Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Candida albicans pozostaje najczęstszą przyczyną infekcji grzybiczych w rosnącej populacji pacjentów z obniżoną odpornością, a kandydoza jest obecnie trzecią najczęstszą infekcją w szpitalach w USA. Różne postaci kandydozy są związane z tworzeniem biofilmu, zarówno na tkankach gospodarza, jak i/lub na urządzeniach medycznych (np. cewnikach). Tworzenie biofilmu niesie ze sobą negatywne skutki kliniczne, ponieważ komórki wewnątrz biofilmu są chronione przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza oraz przed działaniem leków przeciwgrzybiczych. Opracowaliśmy prosty, szybki i niezawodny model in vitro tworzenia biofilmów C. albicans z wykorzystaniem mikropłytek 96-dołkowych, który może być również stosowany do testowania wrażliwości biofilmów na leki przeciwgrzybicze. Odczyt tego testu jest kolorymetryczny i opiera się na redukcji XTT (soli tetrazoliowej) przez metabolicznie czynne komórki grzybów w biofilmie. Typowy eksperyment trwa około 24 h w fazie tworzenia biofilmu, z dodatkowymi 24 h na badanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Ze względu na prostotę oraz wykorzystanie powszechnie dostępnych materiałów i sprzętu laboratoryjnego, technika ta upowszechnia badania nad biofilmami i stanowi ważny krok w stronę standaryzacji testów wrażliwości biofilmów grzybiczych na leki przeciwgrzybicze.
Protokół
1. Przygotowanie C. albicans
C. albicans jest mikroorganizmem z grupy ryzyka 1/BSL1. Pamiętaj o zawsze stosowaniu właściwych technik aseptyki i sterylności podczas pracy z tym mikroorganizmem oraz o przestrzeganiu procedur instytucjonalnych dotyczących prawidłowej utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych.
- Przygotuj nocną hodowlę C. albicans w płynnej pożywce YPD (drożdżowej peptone-dekstrozie) poprzez zaszczepienie pojedynczej kolonii C. albicans do 25 ml pożywki YPD.
- Inkubować hodowlę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną (ok. 180 obr./min) w temperaturze 30 °C przez ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisujemy prosty, szybki, ekonomiczny i wysoce powtarzalny model z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrycyjnej do hodowli biofilmu Candida, połączony z metodą kolorymetryczną XTT służącą do pomiaru aktywności metabolicznej komórek wewnątrz biofilmu. Ten model 96-dołkowej płytki mikrotytrycyjnej do tworzenia biofilmu został pierwotnie opracowany dla C. albicans, lecz może być stosowany w przypadku innych gatunków Candida spp. oraz łatwo adaptowany do innych organizmów g.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
JLL-R posiada udziały w MicrobeHTS Technologies, Inc., która opracowuje środki przeciwgrzybicze. Firma MicrobeHTS Technologies, Inc. nie zapewniła wsparcia finansowego dla tych badań.
Podziękowania
Prace laboratoryjne związane z biofilmem są finansowane z grantów o numerach R21DE017294 oraz R21AI080930 przyznanych przez National Institute of Dental & Craniofacial Research oraz National Institute for Allergy and Infectious Diseases (dla J.L.L.-R.). Treść publikacji jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko NIDCR, NIAID lub NIH.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar Sabouraud-dekstrozowy | BD Biosciences | 211584 | Przygotowanie płytek do świeżych pasażowań izolatów grzybów |
| YPD: Pożywka drożdżowa peptonowo-dekstrozowa | US Biological | Y2076 | Pożywka do namnażania nocnych kultur w cieczy |
| RPMI-1640 bez wodorowęglanu sodu z dodatkiem L-glutaminy | Cellgro | 50-020-PB | Pożywka płynna do formowania biofilmu |
| Kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | Buforowanie medium RPMI 1640 |
| bufor fosforanowo-solny, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Bufor do płukania |
| sól sodowa XTT | Sigma-Aldrich | X4251 | Instrukcje przygotowania znajdują się powyżej |
| roztwór Ringera’mleczan w surowicy | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | Do przygotowania roztworu XTT |
| Menadion | Sigma-Aldrich | M5625 | Ostrzeżenie: substancja niebezpieczna w przypadku kontaktu ze skórą, inhalacji lub połknięcia |
| Szalki Petriego | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| stożkowe probówki wirówkowe 15 ml | Corning | 430790 | |
| probówki do wirowania o pojemności 50 ml z dnem stożkowym | Corning | 430828 | |
| 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne: Polistyrenowe, z płaskim dnem, traktowane do hodowli tkankowych | Corning | 3595 | |
| Pipeta wielokanałowa i końcówki | Eppendorf | ||
| Inkubator | Dowolny dostawca | ||
| Czytnik płytek mikrotitracyjnych | Dowolny dostawca |
Bibliografia
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
