Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Podsumowanie

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Streszczenie

Candida albicans pozostaje najczęstszą przyczyną infekcji grzybiczych w rosnącej populacji pacjentów z obniżoną odpornością, a kandydoza jest obecnie trzecią najczęstszą infekcją w szpitalach w USA. Różne postaci kandydozy są związane z tworzeniem biofilmu, zarówno na tkankach gospodarza, jak i/lub na urządzeniach medycznych (np. cewnikach). Tworzenie biofilmu niesie ze sobą negatywne skutki kliniczne, ponieważ komórki wewnątrz biofilmu są chronione przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza oraz przed działaniem leków przeciwgrzybiczych. Opracowaliśmy prosty, szybki i niezawodny model in vitro tworzenia biofilmów C. albicans z wykorzystaniem mikropłytek 96-dołkowych, który może być również stosowany do testowania wrażliwości biofilmów na leki przeciwgrzybicze. Odczyt tego testu jest kolorymetryczny i opiera się na redukcji XTT (soli tetrazoliowej) przez metabolicznie czynne komórki grzybów w biofilmie. Typowy eksperyment trwa około 24 h w fazie tworzenia biofilmu, z dodatkowymi 24 h na badanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Ze względu na prostotę oraz wykorzystanie powszechnie dostępnych materiałów i sprzętu laboratoryjnego, technika ta upowszechnia badania nad biofilmami i stanowi ważny krok w stronę standaryzacji testów wrażliwości biofilmów grzybiczych na leki przeciwgrzybicze.

Protokół

1. Przygotowanie C. albicans

C. albicans jest mikroorganizmem z grupy ryzyka 1/BSL1. Pamiętaj o zawsze stosowaniu właściwych technik aseptyki i sterylności podczas pracy z tym mikroorganizmem oraz o przestrzeganiu procedur instytucjonalnych dotyczących prawidłowej utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych.

1. Przygotuj nocną hodowlę C. albicans w płynnej pożywce YPD (drożdżowej peptone-dekstrozie) poprzez zaszczepienie pojedynczej kolonii C. albicans do 25 ml pożywki YPD.
2. Inkubować hodowlę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną (ok. 180 obr./min) w temperaturze 30 °C przez noc. Większość C. albicans szczepy będą rosły jako komórki drożdżowe w tych warunkach.
3. Odwiruj hodowle nocne (ok. 3000 obr./min, 5–10 minut), przemyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS i resuspenduj końcowy osad w około 20–25 ml pożywki RPMI 1640 buforowanej kwasem morfolinopropanosulfonowym w stężeniu 165 mM do pH 7,0 i uprzednio ogrzanej do 37 °C (od tej pory pożywka ta określana jest po prostu jako „RPMI 1640”).
4. Policz komórki przy użyciu hemacytometru. Po policzeniu przygotuj zawiesinę komórek o końcowym zagęszczeniu 1,0 x 10⁶ komórek/ml w pośrodku RPMI 1640.
   Uwaga: Ze względu na tendencję komórek do agregacji, ważne jest intensywne mieszanie w wirówce (vortexowanie) pomiędzy kolejnymi etapami płukania oraz przed pipetowaniem.

2. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej do formowania biofilmu

1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μL zawiesiny C. albicans do wybranych dołków płytki mikrotytrującej 96-dołkowej. Nie dodawaj komórek do dołków w kolumnie 12, ponieważ będą one służyć jako kontrole negatywne.
2. Przykryj całą płytkę mikrotytrującą oryginalną pokrywką, uszczelnij parafilmem, umieść w inkubatorze i inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C. Czas inkubacji można dostosować do konkretnego planu eksperymentalnego. Na przykład możliwe jest badanie kinetyki tworzenia biofilmu w okresie od 24 do 48 godzin poprzez zaszczepienie wielu płytek i przetwarzanie każdej z nich w różnych punktach czasowych (np. 2, 4, 8, 12, 24 i 48 h).
3. Po uformowaniu biofilmu, za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie odessij medium, aby nie dotknąć i nie naruszyć biofilmów, które utworzyły się w każdym z dołków.
4. Za pomocą pipety wielokanałowej przemyj płytki trzy razy w sterylnym PBS (200 μL na dołek). Alternatywnie można użyć automatycznej myjki do płytek mikrotytrujących. Pomiędzy myciami, a zwłaszcza po ostatnim płukaniu, osusz płytki w pozycji odwróconej, przykładając ręczniki papierowe, aby usunąć resztki PBS. Na tym etapie biofilmy uformowane na dnie dołków powinny być wyraźnie widoczne nawet gołym okiem i mogą być również wizualizowane za pomocą mikroskopu odwróconego (Rysunek 1). Biofilmy są teraz gotowe do analizy w testach wrażliwości na środki przeciwgrzybicze.
   (Jeśli głównym celem eksperymentu jest ocena stopnia tworzenia biofilmu, płytki są gotowe do przetworzenia metodą kolorymetryczną. W tym celu można dodać odczynnik XTT/menadion (patrz Krok 3 poniżej) i odczytać powstałe zabarwienie za pomocą czytnika płytek mikrotytrujących).

3. Badanie wrażliwości biofilmów na środki przeciwgrzybicze

1. Z roztworów zapasowych lub proszku przygotować roztwór roboczy każdego badanego leku przeciwgrzybiczego w podłożu RPMI 1640. Typowe wysokie stężenia to 1,024 μg/ mL dla flukonazolu oraz 16 μg/ mL dla amfoterycyny B i kaspofunginy. W przypadku innych czynników można zastosować inne stężenia.
2. Używając pipety wielokanałowej, dodać 200 μL wysokiego stężenia roboczego leku przeciwgrzybiczego do odpowiednich studzienek w kolumnie 1 każdej płytki mikrotytrowej zawierającej biofilmy grzybów.
3. Dodać 100 μL RPMI 1640 do każdej studzienki w kolumnach od 2 do 10.
4. Dodać 100 μL RPMI 1640 do studzienek w kolumnie 11.
5. Pobrać 100 μL leku przeciwgrzybiczego ze studzienek w kolumnie 1 i przenieść do sąsiednich studzienek w kolumnie 2 (zawierających już 100 μL podłoża).
6. Dobrze wymieszać zawartość poprzez pipetowanie w górę i w dół w celu wykonania seryjnego rozcieńczenia dwukrotnego, a następnie zdjąć końcówki.
7. Powtarzać czynność, przesuwając się w prawo aż do studzienek w kolumnie 10, po czym odrzucić końcowe 100 μL objętości ze studzienek w kolumnie 10 po wymieszaniu. W ten sposób stworzono serię rozcieńczeń dwukrotnych badanych czynników; od najwyższego stężenia w studzienkach kolumny 1 do najniższego w studzienkach kolumny 10. Biofilmy niepoddane działaniu leków w kolumnie 11 będą służyć jako kontrole dodatnie, a puste studzienki w kolumnie 12 jako kontrole ujemne.
8. Przykryć płytki pokrywkami, uszczelnić parafilmem i inkubować przez 24 -48 h w temperaturze 37 °C.
9. Po okresie inkubacji przemyć płytki zgodnie z Krokiem 2.4 (3 x PBS).
10. Używając pipety wielokanałowej, dodać 100 μL roztworu XTT/menadion do każdej studzienki zawierającej uprzednio przemyty biofilm, a także do studzienek kontroli ujemnej w celu pomiaru tła kolorymetrycznego XTT.
    1. XTT przygotowuje się jako roztwór nasycony o stężeniu 0,5 g/L w sterylnym mleczanie Ringera, PBS lub soli fizjologicznej, który należy wysterylizować przez filtr o rozmiarze oczek 0,22 μm. Roztwór XTT jest światłoczuły, dlatego podczas przygotowania powinien być osłonięty folią aluminiową. Po przygotowaniu i sterylizacji filtracyjnej rozdzielić na alikwoty o objętości roboczej 10 mL i przechowywać w temperaturze -70 °C. Probówki chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Odmrażać tylko tyle probówek, ile jest potrzebnych do konkretnego eksperymentu, bezpośrednio przed użyciem.
    2. Menadion przygotowuje się jako roztwór zapasowy 10 mM w 100% acetonie, rozdzielony na mniejsze objętości (około 50 μL) i przechowywany w temperaturze -70 °C. Roztwór XTT/menadion przygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając 1 μL roztworu zapasowego menadionu do probówki zawierającej 10 mL odmrożonego roztworu XTT.
11. Przykryć płytki folią aluminiową i inkubować w ciemności przez 2 h w temperaturze 37 °C.
12. Odkryć płytki. Używając pipety wielokanałowej, pobrać 80 μL powstałego barwnego supernatantu z każdej studzienki i przenieść do odpowiednich studzienek nowej płytki mikrotytrowej.
13. Odczytać wartości z płytki(ek) w czytniku płytek mikrotytrowych przy 490 nm.
14. Obliczyć osiadłe minimalne stężenia hamujące SMIC50 i SMIC80, czyli stężenia leków przeciwgrzybiczych, przy których odnotowano spadek odczytów kolorymetrycznych o 50% lub 80% w porównaniu do biofilmów kontrolnych utworzonych bez leku przeciwgrzybiczego (w tym przypadku wartości dla kolumny 11, pamiętając o odjęciu wartości z kontroli ujemnych ze studzienek w kolumnie 12 zawierających tylko XTT). Wyniki SMIC można przedstawić w formie tabeli (np. wiele izolatów przeciwko wielu lekom przeciwgrzybiczym) lub alternatywnie wyniki dla każdego pojedynczego izolatu grzyba przeciwko każdemu lekowi przeciwgrzybiczemu można przedstawić na wykresie, naniesionym jako procent inhibicji w funkcji stężenia leku przeciwgrzybiczego.

Przykład: Po odjęciu wartości z kontroli negatywnej, średnia gęstość optyczna (O.D.) biofilmu kontrolnego utworzonego w kolumnie 11 wynosi 1,32. SMIC50 to najniższe stężenie środka przeciwgrzybiczego prowadzące do > 50% redukcji odczytów kolorymetrycznych, w tym przypadku wartość poniżej 1,32 x 50/100 = 0,66. Analogicznie, SMIC80 to najniższe stężenie środka przeciwgrzybiczego prowadzące do > 80% redukcji odczytów kolorymetrycznych, w tym przypadku wartość poniżej 1,32 x 20/100 = 0,264.

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 przedstawia mikrofotografię biofilmu C. albicans uformowanego na dnie studzienki w 96-dołkowej płytce mikrotiterowej, wykonaną przy użyciu mikroskopu odwróconego. Rycina 2 przedstawia odczyty kolorymetryczne XTT (wartości OD₄₉₀) dla każdego z 11 biofilmów szczepu dzikiego C. albicans, uformowanych w każdym z 8 różnych rzędów tej samej 96-dołkowej płytki mikrotiterowej. Rycina 3 przedstawia aktywność amfoterycyny B w różnych stężeniach przeciwko biofilmom C. albicans; strzałki wskazują wartości SMIC50 i SMIC80.

Rysunek 1.(A) Panel A przedstawia mikrofotografię wykonaną za pomocą kamery przymocowanej do mikroskopu odwróconego, obrazującą biofilm C. albicans utworzony na dnie studzienki po aspiracji podłoża RPMI i następnych płukaniach za pomocą PBS. (B) Mikrografia typowego biofilmu C. albicans wizualizowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Paski skali dla paneli A i B wynoszą odpowiednio 100 μm i 10 μm.

Rycina 2. Formowanie wielu równoważnych biofilmu C. albicans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Odczyty kolorymetryczne (wartości OD₄₉₀) z testów redukcji XTT biofilmu utworzonego przez szczep dziki C. albicans w dołkach płytek mikrotitracyjnych. Wartości dotyczą 11 niezależnych biofilmu utworzonych w każdym z 8 różnych rzędów tej samej 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej. Wyniki dla różnych rzędów porównano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, stosując test Bartletta dla jednorodności wariancji oraz post-hoc test wielokrotnych porównań Bonferroniego. Nie odnotowano statystycznie istotnych różnic przy porównywaniu wszystkich par rzędów między sobą (P > 0,05).

Rycina 3. Typowe wyniki testów podatności przeciwgrzybiczej względem biofilmów C. albicans. Wykres przedstawiający typowe wyniki skuteczności różnych stężeń amfoterycyny B przeciwko biofilmom szczepu dzikiego C. albicans. Wartości wyrażono jako średni procent odczytów kolorymetrycznych dla testów redukcji XTT w porównaniu do dołków kontrolnych. Wartości SMIC50 i SMIC80 zostały zaznaczone strzałkami.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisujemy prosty, szybki, ekonomiczny i wysoce powtarzalny model z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrycyjnej do hodowli biofilmu Candida, połączony z metodą kolorymetryczną XTT służącą do pomiaru aktywności metabolicznej komórek wewnątrz biofilmu. Ten model 96-dołkowej płytki mikrotytrycyjnej do tworzenia biofilmu został pierwotnie opracowany dla C. albicans, lecz może być stosowany w przypadku innych gatunków Candida spp. oraz łatwo adaptowany do innych organizmów g...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar Sabouraud-dekstrozowy	BD Biosciences	211584	Przygotowanie płytek do świeżych pasażowań izolatów grzybów
YPD: Pożywka drożdżowa peptonowo-dekstrozowa	US Biological	Y2076	Pożywka do namnażania nocnych kultur w cieczy
RPMI-1640 bez wodorowęglanu sodu z dodatkiem L-glutaminy	Cellgro	50-020-PB	Pożywka płynna do formowania biofilmu
Kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	Buforowanie medium RPMI 1640
bufor fosforanowo-solny, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Bufor do płukania
sól sodowa XTT	Sigma-Aldrich	X4251	Instrukcje przygotowania znajdują się powyżej
roztwór Ringera’mleczan w surowicy	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	Do przygotowania roztworu XTT
Menadion	Sigma-Aldrich	M5625	Ostrzeżenie: substancja niebezpieczna w przypadku kontaktu ze skórą, inhalacji lub połknięcia
Szalki Petriego	Fisher Scientific	08-757-12
stożkowe probówki wirówkowe 15 ml	Corning	430790
probówki do wirowania o pojemności 50 ml z dnem stożkowym	Corning	430828
96-dołkowe płytki mikrotitracyjne: Polistyrenowe, z płaskim dnem, traktowane do hodowli tkankowych	Corning	3595
Pipeta wielokanałowa i końcówki	Eppendorf
Inkubator	Dowolny dostawca
Czytnik płytek mikrotitracyjnych	Dowolny dostawca