Poszukiwanie doznań w warunkowaniu instrumentalnym u myszy

Podsumowanie

W niniejszym protokole opisujemy metodę uczenia operacyjnego u myszy, w której w roli wzmocnienia wykorzystuje się bodźce sensoryczne. Metoda ta nie wymaga wcześniejszego treningu ani ograniczeń pokarmowych i umożliwia badanie zachowań motywowanych bez użycia wzmocnień farmakologicznych lub naturalnych, takich jak pokarm.

Streszczenie

Metody operacyjne są potężnymi narzędziami behawioralnymi służącymi do badania zachowań motywowanych. Metody te, określane jako „samopodawanie”, są szeroko stosowane w badaniach nad uzależnieniami od substancji ze względu na ich wysoką trafność teoretyczną. Badania operacyjne dostarczają naukowcom narzędzi do przedklinicznych analiz wielu aspektów procesu uzależnienia. Na przykład mechanizmy doraźnego wzmocnienia (zarówno narkotykowego, jak i nienarkotykowego) mogą być badane przy użyciu narzędzi farmakologicznych lub genetycznych w celu określenia zdolności konkretnego celu molekularnego do wpływania na zachowanie samopodawania^1-6. Ponadto zachowania poszukiwania narkotyku lub pokarmu można badać w przypadku braku głównego wzmocnienia, a zdolność związków farmakologicznych do zakłócenia tego procesu stanowi model przedkliniczny do odkrywania celów molekularnych i związków, które mogą być przydatne w leczeniu uzależnień^3,7-9. Jednym z problemów przy przeprowadzaniu badań nad dożylnym samopodawaniem substancji u myszy jest trudność techniczna w utrzymaniu drożności cewnika. Wskaźnik ubytku w takich eksperymentach jest wysoki i może osiągać 40% lub więcej^10-15. Innym ogólnym problemem w badaniach nad samopodawaniem substancji jest rozróżnienie, które z efektów wywołanych farmakologicznie przez wzmocnienie generują konkretne zachowania. Na przykład pomiar efektów wzmacniających i neurologicznych psychostymulantów może być utrudniony przez ich efekty psychomotoryczne. Metody operacyjne z wykorzystaniem wzmocnienia pokarmowego pozwalają uniknąć tych pułapek, choć ich użyteczność w badaniu uzależnień od substancji jest ograniczona przez fakt, że niektóre manipulacje zmieniające samopodawanie narkotyków mają minimalny wpływ na samopodawanie pokarmu. Przykładowo, uszkodzenie dopaminergiczne układu mezolimbicznego lub knockout receptora dopaminowego D1 redukuje samopodawanie kokainy, nie wywierając znaczącego wpływu na samopodawanie pokarmu ^12,16.

Opisano zdolność bodźców sensorycznych do wspierania reakcji operacyjnych jako wzmocnień pierwotnych (tj. nieuwarunkowanych)^17-22. Bodźce słuchowe i wzrokowe są samopodawane przez kilka gatunków^18,21,23, choć zaskakująco niewiele wiadomo o mechanizmach neuronalnych leżących u podstaw tego wzmocnienia. Model operacyjnego poszukiwania doznań (OSS) jest skutecznym modelem uzyskiwania sensorycznej samopodaży u myszy, co pozwala na badanie mechanizmów neuronalnych istotnych dla wzmocnienia sensorycznego²⁴. Dodatkową zaletą OSS jest możliwość przesiewania myszy mutantów pod kątem różnic w zachowaniu operacyjnym, które mogą być istotne w kontekście uzależnień. Wykazaliśmy, że myszy z nokautem receptora dopaminowego D1, u których wcześniej stwierdzono deficyty w samopodaży psychostymulantów, nie nabywają również OSS²⁴. Jest to unikalne odkrycie, ponieważ myszy te są zdolne do nauki zadania operacyjnego, gdy jako wzmocnienie stosuje się pokarm. Choć badania operacyjne z wykorzystaniem wzmocnienia pokarmowego mogą być przydatne w badaniu ogólnego zachowania motywacyjnego oraz mechanizmów leżących u podstaw wzmocnienia pokarmowego, to, jak wspomniano powyżej, badania te mają ograniczone zastosowanie w analizie molekularnych mechanizmów uzależnienia od narkotyków. Zatem mogą istnieć podobne substraty neuronalne pośredniczące we wzmocnieniu sensorycznym i psychostymulantowym, które są odmienne od wzmocnienia pokarmowego, co czyniłoby OSS szczególnie atrakcyjnym modelem do badania procesów uzależnienia od substancji. Stopień pokrywania się innych celów molekularnych OSS i wzmocnień narkotykowych pozostaje niejasny, lecz jest to temat, który obecnie badamy. Chociaż niektóre aspekty uzależnienia, takie jak oporność na wygaszanie, mogą być obserwowane w modelu OSS, stwierdziliśmy, że eskalacja ²⁵ w tym modelu nie występuje²⁴. Co ciekawe, eskalacja spożycia oraz niektóre inne aspekty uzależnienia są obserwowane przy samopodaży sacharozy²⁶. Zatem w sytuacjach, gdy do badania procesów związanych z uzależnieniem pożądane są nielekowe procedury operacyjne, można wybrać wzmocnienia pokarmowe lub sensoryczne, aby najlepiej dopasować je do konkretnego pytania badawczego.

Podsumowując, zarówno samopodawanie pokarmu, jak i OSS u myszy mają tę zaletę, że nie wymagają cewnika dożylnego, co umożliwia zastosowanie metod o wyższej przepustowości w badaniu efektów manipulacji farmakologicznych lub genetycznych w obrębie celów neuronalnych zaangażowanych w motywację. Podczas gdy testowanie operacyjne z wykorzystaniem pokarmu jako wzmocnienia jest szczególnie użyteczne w badaniach nad regulacją spożycia pokarmu, OSS jest szczególnie odpowiednie do badania mechanizmów wzmacniania bodźców sensorycznych i może mieć szerokie zastosowanie w badaniach nad poszukiwaniem nowości oraz uzależnieniami.

Protokół

1. Napisanie programu do przeprowadzania sesji testów operantowych z wykorzystaniem zróżnicowanych bodźców wizualnych i słuchowych jako wzmocnienia

1. W przypadku sesji o stałym stosunku (FR): zaplanuj sesje trwające jedną godzinę, przy włączonym oświetleniu pomieszczenia i wentylatorze podczas sesji. W przypadku sesji o stosunku progresywnym zaplanuj sesje trwające dwie godziny. Obie dźwignie powinny być wysunięte przez cały czas trwania sesji; zastosuj przeciwwagę w przypisywaniu dźwigni jako „aktywnej” lub „nieaktywnej” pomiędzy zwierzętami (przypisanie dźwigni dla każdego zwierzęcia pozostaje niezmienne).
2. Zaprojektuj program w taki sposób, aby każdy wzmocnienie było zróżnicowane zgodnie z następującymi parametrami:
   • każde wzmocnienie ma jeden z następujących czasów trwania, wybrany losowo: 2, 4, 6 lub 8 sec.
   • każde wzmocnienie ma jedną z następujących częstotliwości błysków lampy stymulującej, wybraną losowo: 0,625, 1,25, 2,5 lub 5 Hz, każda z cyklem pracy 50%.
   • każdy błysk lampy stymulującej pojawia się losowo po lewej lub prawej stronie komory.
   • podaj bodziec słuchowy przez cały czas trwania wzmocnienia; w naszym laboratorium uruchamiamy pompę infuzyjną, która generuje dźwięk o natężeniu około 3 dB powyżej szumu tła w komorze.
3. Zaprojektuj program tak, aby w czasie rzeczywistym wyświetlał następujące wartości: 1. Liczba naciśnięć dźwigni aktywnej, 2. Liczba naciśnięć dźwigni nieaktywnej, 3. Liczba wzmocnień, 4. Czas (w przyrostach 0,1 sekundy).

2. Obsługa zwierząt (procedura 3-dniowa)

1. Po aklimatyzacji w pomieszczeniu dla zwierząt należy rozpocząć obsługę zwierząt. Pozwoli to przyzwyczaić zwierzęta do podnoszenia i transportu.
2. Zacznij od włożenia dłoni w rękawiczkach do klatki i pozostawienia ich tam przez 90 s. Jeśli w tym czasie nie wszystkie myszy zbadają Twoje dłonie, delikatnie przesuń dłonie w stronę myszy i poczekaj, aż każda z nich powącha i/lub dotknie Twoich dłoni przed kontynuowaniem procedury.
3. Ostrożnie podnoś każdą mysz po kolei za nasadę ogona i kładź ją na dłoni, szybko ją unosząc i opuszczając, aby mysz mogła zejść z dłoni z powrotem do klatki.
4. Powtórz tę czynność dla każdej myszy od 5 do 10 razy, w zależności od zachowania zwierzęcia. Podczas ostatniego powtórzenia trzymaj mysz wysoko (stojącą na dłoni) przez określony czas, zależnie od dnia. Dzień 1: 5 s, Dzień 2: 10 s, Dzień 3: 15 s. Upewnij się, że każda mysz spełnia to kryterium w danym dniu. W dniu 1. zmieniaj rękawiczki pomiędzy klatkami.
5. Zaczynając od dnia 2., gładź zwierzę po grzbiecie, gdy mysz znajduje się na Twojej dłoni. Również w dniu 2. rozpocznij codzienne ważenie zwierząt. Oznacz ogon każdego zwierzęcia markerem Sharpie, aby wskazać numer obiektu.
6. Jeśli w trakcie eksperymentu planowane są iniekcje, zacznij przyzwyczajać myszy do iniekcji w dniu 2. Powinno to być wykonane po tym, jak wszystkie myszy w klatce zostały obsłużone i spełniły kryterium na dany dzień.

3. Czyszczenie i testowanie sprzętu

1. Umyć dolną tackę gorącą wodą.
2. Wyczyścić ściany i podłogę komory operacyjnej 30% etanolem.
3. Uruchomić program testowy, który włącza oświetlenie pomieszczenia, wentylator i światła bodźca, wysuwa dźwignie oraz rejestruje ich nacisnięcia.
4. Upewnić się, że wszystkie światła i wentylatory działają prawidłowo, oraz przetestować program, aby upewnić się, że wszystkie nacisgnięcia dźwigni są rejestrowane.
5. Wyczyścić dźwignie 30% etanolem.

4. Przeprowadź sesję operacyjną (sesje powinny odbywać się 5-6 dni w tygodniu o tej samej porze dnia)

1. Zważ każdą mysz.
2. Wgraj program do każdej komory i odpowiednio opisz eksperyment. Dźwignia aktywna powinna być zrównoważona pomiędzy zwierzętami (tzn. połowie myszy przypisano lewą dźwignię jako aktywną, a drugiej połowie prawą), przy czym strona dźwigni aktywnej nie zmienia się po przypisaniu myszy.
3. Przenieś każdą mysz do wyznaczonej komory, zamknij komorę i rozpocznij sesję.
4. Po zakończeniu sesji bezzwłocznie wyjmij mysz i ponownie oznakuj ogon.
5. Wyczyść komory zgodnie z opisem w sekcji 3.
6. Przeanalizuj dane pod kątem liczby naciśnięć dźwigni aktywnej i nieaktywnej. Można również raportować liczbę wzmocnień i/lub dokładność naciskania dźwigni (% naciśnięć dźwigni aktywnej). Jeśli myszy mają zostać poddane badaniu w celu oceny wpływu leczenia na OSS, upewnij się, że wszystkie myszy przed rozpoczęciem leczenia spełniły kryteria nabywania reakcji (na przykład >20 naciśnięć dźwigni aktywnej i >65% naciśnięć dźwigni aktywnej w trzech ostatnich sesjach FR-1).
7. Po nabyciu reakcji FR-1 można zmienić schemat wzmacniania (na przykład na wyższy stały stosunek, stosunek progresywny, stosunek losowy itp.).

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład nabywania OSS przez samce myszy C57Bl/6J przedstawiono na Rysunku 1 (reprodukowano z ²³). Myszy kontrolne były poddane identycznym warunkom, z wyjątkiem tego, że naciskanie dowolnej z dźwigni nie przynosiło żadnych skutków. Kolejna kohorta myszy przedstawiona jest na Rysunku 2. W tym eksperymencie jedna grupa myszy otrzymała wzmocnienie w postaci OSS, natomiast druga grupa otrzymała wzmocnienie pokarmowe. Stwierdzono, że w warunkach dostępu do pożywienia ad libitum, reakcje w schematach stałego oraz progresywnego stosunku są podobne dla OSS i reakcji na 10% Ensure (Rysunek 2, A i B). Pozwala to na efektywne porównanie wpływu manipulacji na dwa różne typy wzmocnienia (sensoryczne i pokarmowe), co eliminuje potencjalne zmienne zakłócające wynikające ze stanu głodu lub różnic w tempie reakcji.

Rycina 1: Naciskania dźwigni przez myszy OSS i grupę kontrolną. Myszy OSS otrzymywały zróżnicowane bodźce wzrokowe i słuchowe po każdym naciśnięciu aktywnej dźwigni (schemat wzmacniania FR-1), podczas gdy naciśnięcia dźwigni nieaktywnej nie wywoływały żadnych skutków. Myszy kontrolne poddano tym samym warunkom, jednak naciśnięcie którejkolwiek z dźwigni nie przynosiło żadnego skutku (dźwignie oznaczone są jako 1 i 2 i są zrównoważone między zwierzętami w taki sam sposób, w jaki zrównoważone są dźwignie aktywne i nieaktywne u myszy OSS). Częstotliwość naciśnięć dźwigni aktywnej przez myszy OSS wzrosła w stosunku do naciśnięć dźwigni nieaktywnej (*p<0,05, **p<0,01) oraz do nienagradzanego naciskania dźwigni przez grupę kontrolną (n=7 8, $p<0,05, $$p<0,01). Rysunek powtórzony z ²³.

Rysunek 2: Naciśnięcia dźwigni przez myszy OSS oraz myszy reagujące w celu otrzymania pokarmu. A.) Myszy reagowały w schemacie wzmocnień FR-1 dla bodźców OSS lub wzmocnienia pokarmowego (10% Ensure). Wszystkie myszy miały ad libitum dostęp do pożywienia przez cały czas trwania eksperymentów. B.) Po sesjach FR-1 myszy przeszły na pięciodniowy harmonogram wzmocnień o stosunku progresywnym (PR). Dane przedstawiają średnie wartości z czwartego i piątego dnia dla każdego zwierzęcia. Ostateczny zrealizowany stosunek jest przedstawiony na prawej osi Y i odnosi się do liczby reakcji wymaganych do otrzymania odpowiedniego wzmocnienia (np. 30 reakcji jest wymaganych do otrzymania 10^th wzmocnienie po uprzednim otrzymaniu dziewięciu wzmocnień).

Dyskusja

Operacyjne poszukiwanie doznań (OSS) stanowi użyteczną alternatywę dla dożylnej samopodaży leków w badaniach, w których zwierzęciem modelowym jest mysz. Brak konieczności przeprowadzania zabiegów chirurgicznych oraz konserwacji cewników jest istotną zaletą, ponieważ stanowią one znaczące trudności techniczne w przypadku myszy. Metoda OSS jest również atrakcyjna, ponieważ może mierzyć aspekty wzmocnienia odmienne od innych naturalnych wzmocnień, takich jak pokarm.

Warto zauważyć, że miary beha...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do testów samodzielnego podawania leku dla myszy: komora o zwiększonej szerokości i chowane dźwignie	Med Associates, Inc.	MED-307W-CT-D1	Dźwignie są ultrasensytywne (wymagają siły ~2 g) i są zamontowane 2,2 cm nad podłogą. Żółte lampy stymulujące są zamontowane 2 cm nad każdą dźwignią.
Zestaw interfejsu i oprogramowania	Med Associates, Inc.	MED-SYST-16	Jest to zestaw obsługujący do 16 komór.