Poszukiwanie doznań w warunkowaniu instrumentalnym u myszy

Christopher M. Olsen; Danny G. Winder

doi:10.3791/2292

Artykuł metodologiczny

Poszukiwanie doznań w warunkowaniu instrumentalnym u myszy

DOI:

10.3791/2292

⸱

10 listopada 2010

Christopher M. Olsen¹ , Danny G. Winder¹

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Center for Molecular Neuroscience, Kennedy Center for Human Development, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole opisujemy metodę uczenia operacyjnego u myszy, w której w roli wzmocnienia wykorzystuje się bodźce sensoryczne. Metoda ta nie wymaga wcześniejszego treningu ani ograniczeń pokarmowych i umożliwia badanie zachowań motywowanych bez użycia wzmocnień farmakologicznych lub naturalnych, takich jak pokarm.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody operacyjne są potężnymi narzędziami behawioralnymi służącymi do badania zachowań motywowanych. Metody te, określane jako „samopodawanie”, są szeroko stosowane w badaniach nad uzależnieniami od substancji ze względu na ich wysoką trafność teoretyczną. Badania operacyjne dostarczają naukowcom narzędzi do przedklinicznych analiz wielu aspektów procesu uzależnienia. Na przykład mechanizmy doraźnego wzmocnienia (zarówno narkotykowego, jak i nienarkotykowego) mogą być badane przy użyciu narzędzi farmakologicznych lub genetycznych w celu określenia zdolności konkretnego celu molekularnego do wpływania na zachowanie samopodawania^1-6. Ponadto zachowania poszukiwania narkotyku lub pokarmu można badać w przypadku braku głównego wzmocnienia, a zdolność związków farmakologicznych do zakłócenia tego procesu stanowi model przedkliniczny do odkrywania celów molekularnych i związków, które mogą być przydatne w leczeniu uzależnień^3,7-9. Jednym z problemów przy przeprowadzaniu badań nad dożylnym samopodawaniem substancji u myszy jest trudność techniczna w utrzymaniu drożności cewnika. Wskaźnik ubytku w takich eksperymentach jest wysoki i może osiągać 40% lub więcej^10-15. Innym ogólnym problemem w badaniach nad samopodawaniem substancji jest rozróżnienie, które z efektów wywołanych farmakologicznie przez wzmocnienie generują konkretne zachowania. Na przykład pomiar efektów wzmacniających i neurologicznych psychostymulantów może być utrudniony przez ich efekty psychomotoryczne. Metody operacyjne z wykorzystaniem wzmocnienia pokarmowego pozwalają uniknąć tych pułapek, choć ich użyteczność w badaniu uzależnień od substancji jest ograniczona przez fakt, że niektóre manipulacje zmieniające samopodawanie narkotyków mają minimalny wpływ na samopodawanie pokarmu. Przykładowo, uszkodzenie dopaminergiczne układu mezolimbicznego lub knockout receptora dopaminowego D1 redukuje samopodawanie kokainy, nie wywierając znaczącego wpływu na samopodawanie pokarmu ^12,16.

Opisano zdolność bodźców sensorycznych do wspierania reakcji operacyjnych jako wzmocnień pierwotnych (tj. nieuwarunkowanych)^17-22. Bodźce słuchowe i wzrokowe są samopodawane przez kilka gatunków^18,21,23, choć zaskakująco niewiele wiadomo o mechanizmach neuronalnych leżących u podstaw tego wzmocnienia. Model operacyjnego poszukiwania doznań (OSS) jest skutecznym modelem uzyskiwania sensorycznej samopodaży u myszy, co pozwala na badanie mechanizmów neuronalnych istotnych dla wzmocnienia sensorycznego²⁴. Dodatkową zaletą OSS jest możliwość przesiewania myszy mutantów pod kątem różnic w zachowaniu operacyjnym, które mogą być istotne w kontekście uzależnień. Wykazaliśmy, że myszy z nokautem receptora dopaminowego D1, u których wcześniej stwierdzono deficyty w samopodaży psychostymulantów, nie nabywają również OSS²⁴. Jest to unikalne odkrycie, ponieważ myszy te są zdolne do nauki zadania operacyjnego, gdy jako wzmocnienie stosuje się pokarm. Choć badania operacyjne z wykorzystaniem wzmocnienia pokarmowego mogą być przydatne w badaniu ogólnego zachowania motywacyjnego oraz mechanizmów leżących u podstaw wzmocnienia pokarmowego, to, jak wspomniano powyżej, badania te mają ograniczone zastosowanie w analizie molekularnych mechanizmów uzależnienia od narkotyków. Zatem mogą istnieć podobne substraty neuronalne pośredniczące we wzmocnieniu sensorycznym i psychostymulantowym, które są odmienne od wzmocnienia pokarmowego, co czyniłoby OSS szczególnie atrakcyjnym modelem do badania procesów uzależnienia od substancji. Stopień pokrywania się innych celów molekularnych OSS i wzmocnień narkotykowych pozostaje niejasny, lecz jest to temat, który obecnie badamy. Chociaż niektóre aspekty uzależnienia, takie jak oporność na wygaszanie, mogą być obserwowane w modelu OSS, stwierdziliśmy, że eskalacja ²⁵ w tym modelu nie występuje²⁴. Co ciekawe, eskalacja spożycia oraz niektóre inne aspekty uzależnienia są obserwowane przy samopodaży sacharozy²⁶. Zatem w sytuacjach, gdy do badania procesów związanych z uzależnieniem pożądane są nielekowe procedury operacyjne, można wybrać wzmocnienia pokarmowe lub sensoryczne, aby najlepiej dopasować je do konkretnego pytania badawczego.

Podsumowując, zarówno samopodawanie pokarmu, jak i OSS u myszy mają tę zaletę, że nie wymagają cewnika dożylnego, co umożliwia zastosowanie metod o wyższej przepustowości w badaniu efektów manipulacji farmakologicznych lub genetycznych w obrębie celów neuronalnych zaangażowanych w motywację. Podczas gdy testowanie operacyjne z wykorzystaniem pokarmu jako wzmocnienia jest szczególnie użyteczne w badaniach nad regulacją spożycia pokarmu, OSS jest szczególnie odpowiednie do badania mechanizmów wzmacniania bodźców sensorycznych i może mieć szerokie zastosowanie w badaniach nad poszukiwaniem nowości oraz uzależnieniami.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Napisanie programu do przeprowadzania sesji testów operacyjnych z wykorzystaniem zróżnicowanych bodźców wizualnych i słuchowych jako wzmocnienia

W przypadku sesji z zastosowaniem stałego stosunku (FR): zaplanuj sesje trwające jedną godzinę, z włączonym światłem pokojowym oraz wentylatorem w trakcie trwania sesji. W przypadku sesji z zastosowaniem stosunku progresywnego, zaplanuj sesje trwające dwie godziny. Obie dźwignie powinny być wysunięte przez cały czas trwania sesji; należy zrównoważyć przydział dźwigni „aktywnej” i „nieaktywnej” pomiędzy zwierzętami (przypisanie dźwigni dla każdego zwierzęcia pozostaje niezmienne).
Zaprogramuj system w taki sposób, aby każdy wzmocniacz był zróżnicowany zgodnie z następującymi parametrami:
- każdy wzmocniacz ma jeden z następujących czasów trwania, wybieranych losowo: 2, 4, 6 lub 8 sec.
- każdy wzmocniacz ma jedną z następujących częstotliwości błyśnięć lampy stymulacyjnej, wybieranych losowo: 0,625, 1,25, 2,5 lub 5 Hz, z cyklem pracy 50% dla każdej z nich.
- każdy błysk lampy stymulacyjnej występuje losowo po lewej lub prawej stronie komory.
- zapewnij bodziec słuchowy przez cały czas trwania wzmocnienia; w naszym laboratorium uruchamiamy pompę infuzyjną, która generuje dźwięk o natężeniu około 3 dB powyżej poziomu szumu tła w komorze.
Zaprogramuj system tak, aby w czasie rzeczywistym wyświetlać następujące wartości: 1. Liczba naciśnięć dźwigni aktywnej, 2. Liczba naciśnięć dźwigni nieaktywnej, 3. Liczba wzmocnień, 4. Czas (w przyrostach 0,1 sekundy).

2. Obsługa zwierząt (procedura 3-dniowa)

Po aklimatyzacji w hodowli zwierząt należy rozpocząć procedurę obsługi zwierząt. Pozwoli to na przyzwyczajenie zwierząt do podnoszenia i transportu.
Zacznij od włożenia dłoni w rękawiczkach do klatki i pozostawienia ich tam przez 90 s. Jeśli w tym czasie nie każda mysz zbada dłonie, delikatnie przesuwaj dłonie w stronę myszy i poczekaj, aż każda z nich powącha dłonie i/lub wejdzie z nimi w kontakt przed kontynuacją.
Ostrożnie podnieś każdą mysz pojedynczo za nasadę ogona i połóż ją na dłoni, szybko podnosząc ją do góry i opuszczając, aby mysz mogła zejść z dłoni z powrotem do klatki.
Powtórz tę czynność dla każdej myszy od 5 do 10 razy, w zależności od zachowania zwierzęcia. Podczas ostatniego powtórzenia trzymaj mysz wysoko (stojącą na dłoni) przez określony czas, zależnie od dnia. Dzień 1: 5 s, Dzień 2: 10 s, Dzień 3: 15 s. Upewnij się, że każda mysz spełnia to kryterium dla danego dnia. W Dniu 1 zmieniaj rękawiczki pomiędzy klatkami.
Od Dnia 2 głaszcz grzbiet zwierzęcia, gdy mysz znajduje się na Twojej dłoni. W Dniu 2 rozpocznij również codzienne ważenie zwierząt. Oznacz ogon każdego zwierzęcia markerem Sharpie, aby wskazać numer obiektu.
Jeśli w trakcie eksperymentu będą wykonywane iniekcje, zacznij przyzwyczajać myszy do iniekcji w Dniu 2. Należy to zrobić po obsłużeniu wszystkich myszy w klatce i spełnieniu przez nie kryterium dla danego dnia.

3. Czyszczenie i testowanie sprzętu

Umyj dolną tackę gorącą wodą.
Wyczyść ściany i podłogę komory operacyjnej 30% etanolem.
Uruchom program testowy, który włącza światło pomieszczenia, wentylator i światła stymulujące, wysuwa dźwignie i rejestruje ich naciskania.
Upewnij się, że wszystkie światła i wentylatory działają poprawnie oraz przetestuj program, aby potwierdzić, że wszystkie nacisnięcia dźwigni są rejestrowane.
Wyczyść dźwignie 30% etanolem.

4. Przeprowadź sesję operantową (sesje powinny odbywać się 5–6 dni w tygodniu o tej samej porze dnia)

Zważ każdą mysz.
Wgraj program do każdej komory i odpowiednio opisz eksperyment. Dźwignia aktywna powinna być zbalansowana między zwierzętami (tzn. połowie myszy przypisano lewą dźwignię jako aktywną, a pozostałej połowie prawą), jednak strona dźwigni aktywnej nie ulega zmianie po przypisaniu jej danej myszy.
Przenieś każdą mysz do wyznaczonej komory, zamknij komorę i rozpocznij sesję.
Po zakończeniu sesji niezwłocznie wyjmij mysz i ponownie oznakuj ogon.
Wyczyść komory zgodnie z opisem w sekcji 3.
Przeanalizuj dane pod kątem liczby naciśnięć dźwigni aktywnej i nieaktywnej. Można również podać liczbę wzmocnień i/lub dokładność naciśnięć dźwigni (% naciśnięć dźwigni aktywnej). Jeśli myszy mają zostać poddane testom w celu zbadania wpływu leczenia na OSS, należy upewnić się, że wszystkie badane myszy spełniły kryteria nabycia reakcji (na przykład >20 naciśnięć dźwigni aktywnej oraz >65% naciśnięć dźwigni aktywnej w trzech ostatnich sesjach FR-1) przed rozpoczęciem leczenia.
Po nabyciu reakcji FR-1 można zmienić schemat wzmacniania (na przykład na wyższy stały stosunek, stosunek progresywny, stosunek losowy itp.).

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład nabywania OSS przez samce myszy C57Bl/6J przedstawiono na Rycini 1 (reprodukowano z ²³). Myszy kontrolne były poddane identycznym warunkom, z wyjątkiem tego, że naciskanie dowolnej z dźwigni nie przynosiło żadnych skutków. Kolejna grupa myszy przedstawiona jest na Rycini 2. W tym eksperymencie jedna grupa myszy otrzymywała wzmocnienie w postaci OSS, natomiast druga grupa otrzymywała wzmocnienie pokarmowe. Stwierdzono, że w warunkach dostępu do pokarmu ad libitum, reakcje w schematie stałego oraz progresywnego stosunku są podobne w przypadku OSS oraz reagowania na 10% Ensure (Rycina 2, A i B). Pozwala to na efektywne porównanie wpływu manipulacji na dwa różne typy wzmocnienia (sensoryczne i pokarmowe), co pozwala uniknąć potencjalnych czynników zakłócających wynikających ze stanu głodu lub różnic w tempie reakcji.

figure-protocol-1
Rycina 1: Naciskanie dźwigni przez myszy OSS i grupę kontrolną. Myszy OSS otrzymywały zróżnicowane bodźce wzrokowe i słuchowe po każdym aktywnym naciśnięciu dźwigni (schemat wzmocnienia FR-1), natomiast naciśnięcia dźwigni nieaktywnej nie przynosiły żadnego efektu. Myszy kontrolne poddano tym samym warunkom, jednak naciśnięcie którejkolwiek z dźwigni nie wywoływało żadnej reakcji (dźwignie oznaczono jako 1 i 2; zostały one zrównoważone między zwierzętami w ten sam sposób, w jaki zrównoważono dźwignie aktywne i nieaktywne u myszy OSS). Częstotliwość naciskania dźwigni aktywnej przez myszy OSS była zwiększona w stosunku do naciskania dźwigni nieaktywnej (*p<0,05, **p<0,01) oraz w stosunku do nienagradzanego naciskania dźwigni przez myszy kontrolne (n=7 8, $p<0,05, $$p<0,01). Rycina powielona z ²³.

figure-protocol-2
Rycina 2: Naciskania dźwigni przez myszy OSS oraz myszy reagujące na pokarm. A.) Myszy reagowały w schemacie wzmocnienia FR-1 na bodźce OSS lub wzmocnienie pokarmowe (10% Ensure). Wszystkie myszy miały dostęp do pokarmu ad libidum przez cały czas trwania eksperymentów. B.) Po sesjach FR-1 myszy przeszły na pięciodniowy schemat wzmocnienia o stosunku progresywnym (PR). Dane przedstawiają średnie wartości z czwartego i piątego dnia dla każdego zwierzęcia. Końcowy ukończony stosunek jest podany na prawej osi Y i odnosi się do liczby reakcji wymaganych do uzyskania odpowiedniego wzmocnienia (np. 30 reakcji jest wymaganych do uzyskania 10^th wzmocnienia po wcześniejszym zdobyciu dziewięciu wzmocnień).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Operacyjne poszukiwanie doznań (OSS) stanowi użyteczną alternatywę dla dożylnej samopodaży leków w badaniach, w których zwierzęciem modelowym jest mysz. Brak konieczności przeprowadzania zabiegów chirurgicznych oraz konserwacji cewników jest istotną zaletą, ponieważ stanowią one znaczące trudności techniczne w przypadku myszy. Metoda OSS jest również atrakcyjna, ponieważ może mierzyć aspekty wzmocnienia odmienne od innych naturalnych wzmocnień, takich jak pokarm.

Warto zauważyć, że miary beha...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt ten był wspierany przez granty NIH DA19112 (DGW) oraz DA026994 (CMO). Ilustracje zostały przygotowane przez Katherine Louderback. Eksperymenty przeprowadzono w Vanderbilt Murine Neurobehavioral Laboratory.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do testu samopodawania leku dla myszy: komora o zwiększonej szerokości i chowane dźwignie	Med Associates, Inc.	MED-307W-CT-D1	Dźwignie są ultrasensytywne (wymagają siły ~2 g) i są zamontowane 2,2 cm nad podłożem. Żółte lampy stymulujące są zamontowane 2 cm nad każdą dźwignią.
Interfejs i pakiet oprogramowania	Med Associates, Inc.	MED-SYST-16	Jest to pakiet przeznaczony dla maksymalnie 16 komór.