Wywołane przez środowisko dziedziczne zmiany w lnie

Summary

Uprawa niektórych odmian lnu pod wpływem stresu związanego ze składnikami odżywczymi powoduje zmienność genomu w obrębie podzbioru genomu i zmienność fenotypową. Złożona insercja w określonym miejscu jest związana ze wzrostem w różnych reżimach składników odżywczych oraz ze zmianami w ekspresji genów wokół tego miejsca.

Abstract

Niektóre odmiany lnu reagują na stres związany z odżywianiem, modyfikując swój genom, a te modyfikacje mogą być dziedziczone przez wiele pokoleń. Z tymi zmianami genomowymi związane są również dziedziczne wariacje fenotypowe ^1,2. Odmiana lnu Stormont Cirrus (Pl) uprawiana w trzech różnych warunkach składników odżywczych może albo pozostać indukowalna (w warunkach kontrolnych), albo stać się stabilnie zmodyfikowana do dużego lub małego genotrofu poprzez wzrost odpowiednio w warunkach wysokiej lub niskiej zawartości składników odżywczych. Wydaje się, że linie wynikające z początkowego wzrostu w każdym z tych warunków rosną lepiej, gdy są uprawiane w tych samych warunkach w kolejnych pokoleniach, w szczególności linia Pl najlepiej rośnie pod kontrolą leczenia, co wskazuje, że rośliny rosnące zarówno w warunkach wysokich, jak i niskich składników odżywczych są narażone na stres. Jedną ze zmian genomicznych, które są związane z indukcją zmian dziedzicznych, jest pojawienie się elementu insercyjnego (LIS-1) ^{3, 4} podczas gdy rośliny rosną pod wpływem stresu związanego ze składnikami odżywczymi. W odniesieniu do tego przypadku insercji, odmiana lnu Stormont Cirrus (Pl) uprawiana w trzech różnych warunkach składników pokarmowych może albo pozostać niezmieniona (w warunkach kontrolnych), albo spowodować pojawienie się insercji we wszystkich roślinach (przy niskiej zawartości składników odżywczych) i przekazanie jej następnemu pokoleniu, albo wprowadzić (lub jej części) pojawić się, ale nie być przekazywana z pokolenia na pokolenie (przy wysokiej zawartości składników pokarmowych) ⁴. Częstotliwość pojawiania się tej insercji wskazuje, że jest ona poddana selekcji pozytywnej, co jest również zgodne z reakcją wzrostu w kolejnych pokoleniach. Liście lub merystemy zebrane na różnych etapach wzrostu są wykorzystywane do izolacji DNA i RNA. RNA służy do identyfikacji zmienności ekspresji związanej z różnymi środowiskami wzrostu i/lub obecnością/brakiem LIS-1. Wyizolowane DNA służy do identyfikacji tych roślin, w których doszło do insercji.

Protocol

1. Wzrost lnu w warunkach indukcyjnych.

1. Doniczki 5" są wypełnione ziemią i utwardzone.
2. Trzy nasiona w doniczce sadzi się na głębokość 1/4 cala, a gleba jest utwardzona na nasionach.
3. Doniczki są następnie podlewane 100 ml odpowiednich roztworów odżywczych
   1. W warunkach nieindukujących kontroli (C) co tydzień stosuje się Miracle-Gro o sile 1/10. Stan wysokiej wartości odżywczej (leczenie NPK) miał pełną moc Miracle Grow stosowany co tydzień. Uboga zawartość składników odżywczych - rośliny miały tylko wodę z kranu przez cały okres wzrostu. (Durrant 1971, Cullis 1980).
4. Latem rośliny są uprawiane w naturalnym świetle. Zimą uprawia się je pod lampami sodowymi z 16/8-godzinnym cyklem światło/ciemność.
5. W odstępach tygodniowych zbiera się liście i merystemy.
6. Materiał roślinny jest szybko zamrażany w ciekłym azocie.

Wyniki

Trzy genotypy rosną w różnym względnym tempie, w zależności od warunków (Rysunek 1). Dlatego w warunkach kontrolnych najlepiej rośnie linia Pl, przy czym L jest bardziej żywotna niż S (ryc. 1a). Przy niskiej zawartości składników odżywczych (woda) S rośnie lepiej niż L lub Pl (ryc. 1b). W warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych (NPK) L rośnie lepiej niż Pl, który rośnie tylko nieznacznie lepiej niż S (ryc. 1c). Porównanie między każdą z linii wyhodowanych w ramach trzech różnych zabiegów przedstawiono na rysunku 1 d - f. Pl najlepiej rośnie w warunkach kontrolnych (ryc. 1d), L najlepiej w warunkach bogatych w składniki odżywcze (ryc. 1e), a S podobnie zarówno w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych, jak i kontrolnych (ryc. 1f).

Te dane pokazują, że te trzy linie można rozróżnić na podstawie ich wzrostu w trzech środowiskach. Warto zauważyć, że Pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych, podczas gdy L najlepiej rośnie w warunkach NPK (w których został indukowany). S rośnie mniej więcej tak samo we wszystkich trzech warunkach, to znaczy nie jest w stanie wykorzystać lepszych warunków odżywczych, ale jest w stanie lepiej rosnąć w warunkach bardzo niskiej zawartości składników odżywczych.

Parametry wzrostu, które są istotne dla różnicowania roślin, obejmują wysokość rośliny (i związaną z tym długość międzywęźla, czyli odległość między każdym liściem), rozmiar liścia i stopień rozgałęzienia. Dla Pl w warunkach kontrolnych roślina jest wysoka z gałęziami, a liście są duże i ciemnozielone. Przy niskiej zawartości składników odżywczych roślina jest bardzo niska, odległość między każdym liściem jest również bardzo krótka, a liście są małe i jasnozielone. Liście na końcu są ciemniej zielone niż te znajdujące się niżej w łodydze. Przy wysokiej zawartości składników odżywczych roślina wygląda bardzo podobnie do tej w warunkach kontrolnych, z wyjątkiem tego, że zarówno główna łodyga, jak i pędy boczne są krótsze niż u roślin kontrolnych. W przypadku dużego genotrofu rośliny wyglądają bardzo podobnie do tych z Pl, z wyjątkiem tego, że najbardziej energiczny wzrost występuje w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych. Ponownie, przy niskiej zawartości składników odżywczych, roślina jest bardzo niska i ma jasnozielone liście. Genotrof S rośnie podobnie we wszystkich trzech środowiskach, chociaż liście są jaśniejsze zielone przy niskiej zawartości składników odżywczych. Jednak w warunkach ubogich w składniki odżywcze genotrof S jest znacznie bardziej energiczny niż którakolwiek z linii Pl lub L.

2. Ekstrakcje RNA i DNA z merystemów i liści lnu są wykonywane oddzielnie. Do ekstrakcji RNA użyto zestawu do przygotowania całkowitego RNA firmy Roche, a do ekstrakcji DNA użyto zestawu do przygotowania Qiagen DNeasy Plant DNA.

Ekstrakcja RNA

1. 3 merystemy plus kilka otaczających liści przenosi się z kriowialu do probówki Eppendorfa i umieszcza w ciekłym azocie, aż będą gotowe do zmielenia.
2. Do probówki dodaje się sterylny piasek, a tkankę miele się za pomocą mikrotłuczka na drobnoziarnistą masę.
3. Dodaje się 400 ul bufor do lizy/wiązania z zestawu do przygotowania całkowitego RNA firmy Roche, a tkankę dalej mieli, aż nie będą widoczne żadne grudki.
4. Próbka jest wirowana przez 15 sekund, aby wspomóc lizę, a następnie wirowana przez 1 minutę z prędkością 13 000 obr./min w celu zebrania piasku i wszelkich zanieczyszczeń.
5. Supernatant dodaje się do kolumny wirowej, a reszta instrukcji zestawu do przygotowania RNA jest postępowana zgodnie z zaleceniami.

Leczenie DNAzy

1. Dodaje się 1/10 objętości próbki RNA 10-krotnego buforu DNAzy.
2. Dodaje się 30 jednostek DNAzy i reakcję inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 min i w temperaturze 70°C przez 5 min.

Odwrotna transkrypcja

1. Zestaw Applied Biosystems RNA do cDNA stosuje się zgodnie ze wskazówkami, reakcję inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i 95 °C przez 5 minut.

cDNA jest następnie używane w PCR lub do qPCR

qPCR

qPCR został przeprowadzony przy użyciu systemu ABI Step One. Wszystkie testy wykonywano w trzech egzemplarzach w każdym przebiegu. Gen aktyny został użyty jako kontrola liczby kopii jako najlepszy dostępny gen do sprzątania.

1. Do każdej probówki dodano odpowiednią parę starterów w ilości 1 μl.
2. CDNA rozcieńczono do odpowiedniego stężenia i dodano 9 μl do każdej probówki
3. 10 μl 2x Power SYBR Green PCR MasterMix (ABI) i zostało dodane do każdej probówki
4. Program wzmacniający program był następujący:
   • 10 minut w temperaturze 95°C
   • 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 60°C
   
   Etap denaturacji termicznej w celu sprawdzenia swoistości amplifikacji
5. Względne poziomy ekspresji określono na podstawie wartości 2(^{CTunknown - CTactin}).

przygotowanie DNA

1. Bufor AP1 z zestawu do przygotowania DNA roślinnego Qiagen DNeasy dodaje się do 6 liści ze sterylnym piaskiem w probówce do mikrofuge. Tkankę miele się mikrotłuczkiem, aż nie będą widoczne żadne grudki.
2. Instrukcje zestawu są postępowane zgodnie z zaleceniami.

Wyniki

Amplifikacja PCR z DNA wyizolowanego z liści w różnych miejscach wzdłuż łodygi pokazuje, że pojawienie się LIS-1 ma miejsce, gdy rośliny rosną w warunkach indukujących (4). Wyniki qPCR pokazują, że obecność LIS-1 (lub innych zmian genomowych związanych z indukcją) wpływa na ekspresję genów w bezpośrednim sąsiedztwie LIS-1 (Figura 2). Sześć genów pokazanych na rysunku 2 ma różną ekspresję w Pl i S, przy czym cztery mają wyższą ekspresję w PL (bez LIS-1), a dwa mają wyższą ekspresję w S (który ma LIS-1). Panel 1 i 2 to dwa geny znajdujące się najbliżej punktu insercji LIS-1. Ekspresja tych genów s w dużym genotrofie (który miał wywołane zmiany, ale nie ma LIS-1) i ekspresja w różnych warunkach wzrostu będą potrzebne do określenia jakiegokolwiek związku przyczynowego między LIS-1 a zmianami ekspresji.

Rysunek 1. Pl, L i S uprawiane w trzech różnych systemach składników odżywczych. Panele a - kontrola, b - ubogie składniki odżywcze i c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Panele d - f od lewej do prawej: ubogie składniki odżywcze, kontrola i NPK. D - Pl, e - L, F - S.

Rysunek 2. Ekspresja genów wokół punktu insercji LIS-1. Gen 1 (inhibitor wzrostu) jest natychmiast 5' do LIs1 i genu 2 (inhibitor kinazy zależnej od cykliny związany z Kip id 3" LIS-1. Pozostałe geny znajdują się na tym samym rusztowaniu (~500kb) zbudowanym z pełnej sekwencji genomu lnu. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Amplifikacje PCR DNA wyekstrahowanych z pojedynczych liści roślin Stormont Cirrus uprawianych w warunkach ubogich w składniki odżywcze. Produkty PCR oddzielono od siebie na 2% żelu agarozowo-TBE. Niewstawiony serwis jest pokazany w Panelu a, a dwa końce wstawionego serwisu są pokazane w Panelach b i c. Próbki liści 1 - 6 izolowano w odstępach tygodniowych, przy czym próbka 1 była najwcześniejsza po siewie.

Discussion

Wydaje się, że len ma z natury niestabilny genom. Wiele dostępnych na rynku odmian lnu włóknistego szybko staje się niejednorodnych, gdy są uprawiane przez kilka pokoleń. Wydaje się, że te same obserwacje nie są prawdziwe w odniesieniu do odmian lnu olejowego. Dlatego wydaje się, że istnieje związek między selekcją pod kątem jakości błonnika a niestabilnością genomu. Wywołane przez środowisko dziedziczne zmiany w lnie zostały pierwotnie zidentyfikowane poprzez badanie obserwacji agronomicznych wzrostu roślin włóknistych. Te powtarzalne obserwacje określonych zmian fenotypowych i genomowych rodzą pytanie, w jaki sposób stres środowiskowy może wpływać na zestaw rearanżacji genomu, które mogą wystąpić. Powtarzające się pojawianie się LIS-1 w odpowiedzi na określone środowiska jest zgodne z bezpośrednią lub pośrednią selekcją tej mutacji. Wzrost linii wywołany różnymi zabiegami wskazuje również na poprawę wydajności w odpowiednich warunkach indukcyjnych. Zmiany w ekspresji związane również z obecnością LIS-1 ponownie wskazują, że ta insercja wpływa na wydajność roślin. Prezentacja wideo stanowi forum do obserwacji zmian fenotypowych roślin w sposób niemożliwy do przekazania za pomocą tradycyjnych materiałów drukowanych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasiona lnu oryginalnej odmiany Stormont Cirrus oznaczane Pl oraz genotrofy L i S.
5-calowe doniczki
ziemia
Szklarnia
Miracle-Gro
Wysokociśnieniowe światła
Ciekły azot
Moździerz i tłuczki
Mikrotłuczki i probówki
Termocykler
Sprzęt do
Cyfrowy zestaw
Moduł
StepOne Zestaw
Zestaw do przygotowania RNA do cDNA firmy Applied Biosystems
			do przygotowania całkowitego RNA firmy Roche