Uprawa niektórych odmian lnu w warunkach stresu nutrientowego prowadzi do zmienności genomicznej w obrębie określonej części genomu oraz do zmienności fenotypowej. Złożona insercja w konkretnym miejscu jest powiązana z wzrostem w różnych reżimach odżywczych oraz ze zmianami w ekspresji genów w obrębie tego miejsca.
Artykuł metodologiczny
Indukowane środowiskowo dziedziczne zmiany u lnu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niektóre odmiany lnu reagują na stres pokarmowy poprzez modyfikację swojego genomu, a modyfikacje te mogą być dziedziczone przez wiele pokoleń. Z tymi zmianami genomicznymi wiążą się również dziedziczne zmienności fenotypowe 1,2. Odmiana lnu Stormont Cirrus (Pl), w zależności od trzech różnych warunków odżywienia, może pozostać indukowalna (w warunkach kontrolnych) lub zostać stabilnie zmodyfikowana do genotrofu dużego bądź małego poprzez wzrost odpowiednio w warunkach wysokiej lub niskiej zawartości składników odżywczych. Linie powstałe w wyniku początkowego wzrostu w każdych z tych warunków wydają się rosnąć lepiej, gdy są hodowane w tych samych warunkach w kolejnych pokoleniach; w szczególności linia Pl rośnie najlepiej w traktowaniu kontrolnym, co wskazuje, że rośliny rosnące zarówno przy wysokiej, jak i niskiej zawartości składników odżywczych znajdują się pod wpływem stresu. Jedną ze zmian genomicznych związanych z indukcją zmian dziedzicznych jest pojawienie się elementu insercyjnego (LIS-1) 3, 4 podczas wzrostu roślin w warunkach stresu pokarmowego. W odniesieniu do tego zdarzenia insercyjnego, odmiana lnu Stormont Cirrus (Pl) hodowana w trzech różnych warunkach odżywienia może pozostać niezmieniona (w warunkach kontrolnych), wykazać pojawienie się insercji u wszystkich roślin (przy niskiej zawartości składników odżywczych) i przekazać ją następnemu pokoleniu, lub wykazać pojawienie się insercji (lub jej części), która nie jest jednak przekazywana w kolejnych pokoleniach (przy wysokiej zawartości składników odżywczych) 4. Częstotliwość występowania tej insercji wskazuje, że podlega ona selekcji pozytywnej, co jest spójne z odpowiedzią wzrostową w kolejnych pokoleniach. Liście lub merystemy zbierane na różnych etapach wzrostu są wykorzystywane do izolacji DNA i RNA. RNA służy do identyfikacji zmienności ekspresji związanej z różnymi środowiskami wzrostu i/lub obecnością/brakiem LIS-1. Izolowane DNA jest wykorzystywane do identyfikacji roślin, w których doszło do insercji.
Protokół
1. Wzrost lnu w warunkach indukujących.
- Doniczki o średnicy 5 cali wypełnia się ziemią i ugniata.
- W każdej doniczce sadzi się po trzy nasiona na głębokości ¼ cala, a następnie ugniata się nad nimi glebę.
- Następnie doniczki podlewa się 100 ml odpowiednich roztworów odżywczych.
- Warunki kontrolne bez indukcji (C) wykorzystują 1/10th stężenie Miracle-Gro co tydzień. W warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych (zabieg NPK) co tydzień stosowano pełne stężenie Miracle-Grow. W warunkach niskiej zawartości składników odżywczych rośliny otrzymywały wyłącznie wodę z kranu przez cały okres wzrostu (Durrant 1971, Cullis 1980).
- Rośliny są hodowane przy świetle naturalnym w okresie letnim. W okresie zimowym są hodowane pod lampami sodowymi z 16/8-godzinnym cyklem światła i ciemności.
- Liście i merystemy są zbierane w odstępach tygodniowych.
- Materiał roślinny jest szybko zamrażany w ciekłym azocie.
Wyniki
Trzy genotypy rosną w różnym tempie względnym w zależności od warunków (Rysunek 1). W związku z tym, w warunkach kontrolnych najlepiej rośnie linia Pl, przy czym linia L wykazuje większą wigorystyczność niż S (Rysunek 1a). W warunkach niskiej dostępności składników odżywczych (woda), linia S rośnie lepiej niż L lub Pl (Rysunek 1b). Przy wysokiej dostępności składników odżywczych (NPK) linia L rośnie lepiej niż Pl, która z kolei rośnie tylko nieco lepiej niż S (Rysunek 1c). Porównanie każdej z linii hodowanych w trzech różnych wariantach traktowania przedstawiono na Rysunku 1 d - f. Linia Pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych (Rysunek 1d), linia L najlepiej przy wysokiej zawartości składników odżywczych (Rysunek 1e), a linia S podobnie zarówno w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych, jak i w warunkach kontrolnych (Rysunek 1f).
Dane te pokazują, że trzy linie można rozróżnić na podstawie ich wzrostu w trzech różnych środowiskach. Warto zauważyć, że Pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych, podczas gdy L rośnie najlepiej w warunkach NPK (w których została indukcja). S rośnie podobnie we wszystkich trzech warunkach, co oznacza, że nie jest w stanie wykorzystać poprawionych warunków odżywczych, ale lepiej radzi sobie w warunkach bardzo niskiej zawartości składników odżywczych.
Parametry wzrostu istotne dla różnicowania roślin obejmują wysokość rośliny (a z tym powiązaną długość międzywęźla, czyli odległość między kolejnymi liśćmi), wielkość liści oraz stopień rozgałęzienia. W przypadku linii Pl w warunkach kontrolnych roślina jest wysoka z licznymi gałęziami, a liście są duże i ciemnozielone. W warunkach niedoboru składników odżywczych roślina jest bardzo niska, odległość między liśćmi jest również bardzo mała, a liście są małe i jasnozielone. Liście na szczycie są ciemniej zielone niż te znajdujące się niżej na łodydze. W warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych roślina wygląda bardzo podobnie do rośliny w warunkach kontrolnych, z wyjątkiem tego, że zarówno główna łodyga, jak i pędy boczne są krótsze niż u roślin kontrolnych. W przypadku dużego genotypu L rośliny wyglądają bardzo podobnie do linii Pl, z wyjątkiem tego, że najbardziej intensywny wzrost występuje przy wysokiej zawartości składników odżywczych. Ponownie, w warunkach niedoboru składników odżywczych roślina jest bardzo niska i posiada jasnozielone liście. Genotyp S rośnie podobnie we wszystkich trzech środowiskach, choć liście są jaśniejszą zielenią przy niskiej zawartości składników odżywczych. Jednakże w warunkach niedoboru składników odżywczych genotyp S jest znacznie bardziej wigorystyczny niż linie Pl lub L.
2. Ekstrakcje RNA i DNA z merystemów i liści lnu przeprowadzono oddzielnie. Do ekstrakcji RNA wykorzystano zestaw Roche total RNA prep kit, a do ekstrakcji DNA zestaw Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit.
Izolacja RNA
- 3 merystemy wraz z kilkoma otaczającymi liśćmi przenosi się z krio probówki do przechowywania do probówki typu Eppendorf i umieszcza w ciekłym azocie do momentu rozgrubienia.
- Do probówki dodaje się sterylny piasek i rozciera tkankę za pomocą mikro pestle, aż do uzyskania drobnej konsystencji.
- Dodaje się 40 µL buforu lizującego/wiążącego z zestawu Roche total RNA prep kit i dalej rozciera tkankę, aż do całkowitego usunięcia grudek.
- Próbkę mieszano w vortexie przez 15 sec, aby wspomóc lizę, a następnie wirowano przez 1 min przy 13,0 rpm w celu osadzenia piasku i zanieczyszczeń.
- Nadosad przenosi się do kolumny wiążącej i postępuje zgodnie z pozostałymi instrukcjami zestawu do izolacji RNA.
Obróbka DNazą
- Dodaje się 1/10 objętości próbki RNA buforu DNAse 10X.
- Dodaje się 30 jednostek DNAse; reakcję inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 min oraz w 70°C przez 5 min.
Odwrotna transkrypcja
- Zestaw Applied Biosystems RNA to cDNA należy stosować zgodnie z instrukcją; reakcję inkubuje się w temperaturze 37°C przez 1 godzinę oraz w 95°C przez 5 minut.
Następnie cDNA jest wykorzystywane w reakcji PCR lub qPCR
qPCR
Analizę qPCR przeprowadzono przy użyciu systemu ABI Step One. Wszystkie testy wykonano w trzech powtórzeniach w każdym przebiegu. Gen aktyny wykorzystano jako kontrolę liczby kopii, ponieważ jest to najlepszy dostępny gen gospodarski.
- Do każdej probówki dodano 1μl odpowiedniej pary starterów.
- cDNA rozcieńczono do odpowiedniego stężenia, a następnie do każdej probówki dodano 9μl.
- Do każdej probówki dodano 10μl 2x Power SYBR Green PCR MasterMix (ABI).
- Program amplifikacji obejmował:
- 10 minut w 95°C
- 40 cykli: 15sec w 95°C, 1 min w 60°C
Krok denaturacji termicznej w celu weryfikacji swoistości amplifikacji. - Względne poziomy ekspresji określono na podstawie wartości 2(CTunknown - CTactin).
Przygotowanie DNA
- Do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 6 liści oraz steryjny piasek dodaje się bufor AP1 z zestawu Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit. Tkankę uciera się mikropestleikiem do momentu, aż nie będą widoczne żadne grudki.
- Postępuje się zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu.
Wyniki
Amplifikacja PCR z DNA wyizolowanego z liści w różnych pozycjach wzdłuż łodygi wykazuje, że pojawienie się LIS-1 następuje podczas wzrostu roślin w warunkach indukujących (4). Wyniki qPCR wskazują, że obecność LIS-1 (lub innych zmian genomicznych związanych z indukcją) wpływa na ekspresję genów znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie LIS-1 (Rysunek 2). Sześć genów przedstawionych na Rysunku 2 wykazuje zróżnicowaną ekspresję w PL i S, przy czym cztery z nich mają wyższą ekspresję w PL (bez LIS-1), a dwa wyższą ekspresję w S (które posiada LIS-1). Panele 1 i 2 przedstawiają dwa geny położone najbliżej punktu insercji LIS-1. Aby określić jakikolwiek związek przyczynowy między LIS-1 a zmianami ekspresji, konieczne będzie zbadanie ekspresji tych genów w dużym genotropie (w którym zaszły zmiany indukowane, ale który nie posiada LIS-1) oraz ekspresji w różnych warunkach wzrostu.
Rysunek 1. Pl, L i S wyhodowane w trzech różnych reżimach odżywczych. Panele a – kontrolne, b – niskie stężenie składników odżywczych i c – NPK. d – Pl, e – S, f – L. Panele d – f od lewej do prawej: niskie stężenie składników odżywczych, kontrolne i NPK. D – Pl, e – L, F – S.
Rysunek 2. Ekspresja genów wokół miejsca insercji LIS-1. Gen 1 (inhibitor wzrostu) znajduje się bezpośrednio po stronie 5' względem LIS-1, a gen 2 (inhibitor kinazy zależnej od cyklin związany z Kip) znajduje się po stronie 3' LIS-1. Pozostałe geny rozmieszczone są wzdłuż tego samego rusztowania (~50 kb), zbudowanego na podstawie pełnej sekwencji genomu lnu. Proszę kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony schemat.
Rysunek 3. Amplifikacje PCR DNA wyekstrahowanego z pojedynczych liści roślin Stormont Cirrus hodowanych w warunkach niskiej dostępności składników odżywczych. Produkty PCR rozdzielono w 2% żelu agaroza-TBE. Miejsce bez wstawki pokazano na panelu a, a dwa końce miejsca z wstawką pokazano na panelach b i c. Próbki liści 1–6 pobierano w odstępach tygodniowych, przy czym próbka 1 była najwcześniejsza po wysiewie.
Dyskusja
Len wydaje się posiadać z natury niestabilny genom. Liczne komercyjne odmiany lnu włóknistego szybko tracą jednorodność po kilku pokoleniach uprawy. Podobne obserwacje nie wydają się mieć miejsca w przypadku odmian lnu olejnego. Wskazuje to zatem na istnienie związku między selekcją pod kątem jakości włókna a niestabilnością genomu. Dziedziczne zmiany w lnie wywołane czynnikami środowiskowymi zostały pierwotnie zidentyfikowane podczas badania agronomicznych obserwacji wzrostu upraw włóknistych. Te powtarzalne obserwacje specyficznych wariacji fenotypowych i genomicznych stawiają pytanie o to, w jaki sposób stres środowiskowy może wpływać na zestaw możliwych do wystąpienia rearanżacji genomicznych. Powtarzające się pojawianie się LIS-1 w odpowiedzi na konkretne warunki środowiskowe jest zgodne z tezą, że mutacja ta jest selekcjonowana bezpośrednio lub pośrednio. Wzrost linii indukowanych różnymi zabiegami wskazuje również na poprawę wydajności w odpowiednich warunkach indukcyjnych. Zmiany w ekspresji powiązane z obecnością LIS-1 ponownie wskazują, że insercja ta wpływa na kondycję rośliny. Prezentacja wideo stanowi forum umożliwiające obserwację zmian fenotypowych roślin w sposób niemożliwy do przekazania w tradycyjnych materiałach drukowanych.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nasiona lnu oryginalnej odmiany Stormont Cirrus oznaczone jako Pl oraz genotrofy L i S. | |||
| Doniczki 5" | |||
| ziemia do doniczek | |||
| Miracle-Gro | |||
| szklarnia | |||
| Lampy sodowe wysokociśnieniowe | |||
| Ciekły azot | |||
| Moździerze i tłuczki | |||
| Mikrotłuczki i probówki do wirówek mikrocentryfugalnych | |||
| Termocykler | |||
| Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym | |||
| System obrazowania cyfrowego | |||
| Moduł qPCR StepOne | |||
| Zestaw Qiagen DNeasy do izolacji DNA z roślin | |||
| Zestaw Applied Biosystems do syntezy cDNA z RNA | |||
| Zestaw Roche do izolacji całkowitego RNA |
Bibliografia
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
Przedruki i uprawnienia
