Method Article

Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu kriosekcji ciał embrionalnych

DOI:

10.3791/2344

⸱

December 8th, 2010

 ,  ,  ,  , 
1Laboratório Nacional de Céulas-Tronco Embrionárias (LaNCE), Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brazil

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotencjalne komórki macierzyste rosnące w zawiesinie różnicują się w ciała embrionalne (EBs). Tutaj pokazujemy, jak uzyskać wysokiej jakości kriosekcje EB przydatne do badania komórkowych i molekularnych aspektów embriogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu ich organizacji jako agregatów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne komórki macierzyste (ES) to pluripotencjalne komórki pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej wczesnych zarodków ssaków w stadium blastocysty 1. Kluczowym etapem różnicowania komórek ES jest tworzenie agregatów ciał zarodkowych (EB) 2, 3. Tworzenie EB opiera się na spontanicznej agregacji, gdy komórki ES są hodowane na nieprzylegających płytkach. Trójwymiarowa EB podsumowuje wiele aspektów wczesnej embriogenezy ssaków i różnicuje się w trzy listki zarodkowe: ektodermę, mezodermę i endodermę 4.

Immunofluorescencja i hybrydyzacja in situ są szeroko stosowanymi technikami wykrywania docelowych białek i mRNA obecnych w komórkach sekcji tkanki 5, 6, 7. Poniżej przedstawiamy prostą technikę generowania wysokiej jakości kriosekcji ciał zarodkowych. Podejście to opiera się na orientacji przestrzennej osadzania EB w OCT, a następnie na technice kriosekcji. Powstałe skrawki mogą być poddawane różnorodnym procedurom analitycznym w celu scharakteryzowania populacji komórek zawierających określone białka, RNA lub DNA. W tym sensie przygotowanie kriosekcji EB (10 μm) jest niezbędnym narzędziem do analizy barwienia histologicznego (np. Hematoksylina i Eozyna, DAPI), immunofluorescencji (np. Oct4, nestin) lub hybrydyzacji in situ. Technika ta może również pomóc w zrozumieniu aspektów embriogenezy w odniesieniu do utrzymania trójwymiarowej struktury sferycznej EB.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrwalanie i kriokonserwacja

Pluripotencjalne komórki macierzyste zostały wyhodowane na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) inaktywowanych mitomycyną C i utrzymywanych w DMEM/F12 uzupełnionych 20% zamiennikiem surowicy nokautującej (KSR) i 8ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2). W celu wywołania tworzenia EB komórki H9 przeniesiono do nieprzylegających szalek i hodowano przez 7 dni, utrzymywano w DMEM/F12 uzupełnionym 15% KSR 8,

Uwaga (!): Technika ta może być stosowana w przypadku EB pochodzących z dowolnej embrionalnej i indukowanej pluripotencjalnej komórki macierzystej.

  1. Zebrać EB z naczynia hodowlanego za pomocą pipety.
  2. Przenieś EB do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i poczekaj, aż materiał opadnie na dno probówki.
  3. Usuń pożywkę i utrwal EB 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    Uwaga (!): W przypadku hybrydyzacji in situ należy przeprowadzić odzyskiwanie antygenu, aby uniknąć reakcji sieciowania z przeciwciałami spowodowanej użyciem PFA6,7.
  4. Usunąć roztwór PFA i przemywać PBS przez 5 minut.
  5. EB należy umieścić w seryjnym rozcieńczaniu roztworów sacharozy buforowanych PBS (kolejno 10, 20 i 30%) w temperaturze 25-28°C, każdy roztwór należy wymieniać co 30 minut. Materiał można następnie przechowywać w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4°C, aż do etapu zatapiania w OCT.

2. Osadzanie tkanek, prowadzenie i zamrażanie

  1. Ostrożnie wyjmij EB z tuby. Wylej jak najwięcej roztworu sacharozy.

    Uwaga (!): Ważne jest, aby zwilżyć wewnętrzną ściankę końcówki roztworem sacharozy przed zebraniem EBs. Ta procedura pozwala uniknąć przyczepienia EB do końcówki.
  2. Umieść EB w formie i usuń pozostały roztwór sacharozy bibułą filtracyjną.

    Uwaga (!): Ważne jest, aby nie wypełniać formy EB, aby uniknąć nakładania się.
  3. Powoli napełniaj formę OCT, uważając, aby nie zawiesić ponownie EBs. Następnie umieść cały EB na środku formy i usuń bąbelki za pomocą pipety.
  4. Lekko mieszać przez 15 minut.
  5. Otocz formę pokruszonym suchym lodem, aby zamrozić próbkę. OCT powinien być całkowicie zamrożony. W tym momencie bloki mogą być przechowywane w temperaturze -70°C, przez co najmniej rok.

3. Technika kriosekcji

  1. Wyjmij zamrożony blok z -70°C i umieść na kriostacie uprzednio schłodzonym w temperaturze od -18 do -21 °C.

    Uwaga (!): Temperatury spoza tego zakresu mogą powodować problemy, takie jak zwijanie się sekcji, topnienie lub pękanie.
  2. Odłącz blok OCT od formy i umieść go w wsporniku kriostatu, dodając więcej OCT.
  3. Ważne jest, aby odpowiednio zorientować blok i ustawić go równolegle do krawędzi ostrza.

    Uwaga(!): Ponieważ EB są mniejsze niż inne próbki tkanek, ten krok jest niezwykle ważny, aby zminimalizować straty materiału.
  4. Bloki OCT należy ciąć powierzchownie, aż do uzyskania płaszczyzny powierzchni. Cienkie skrawki (10 μm) próbki tkanki należy pobrać i umieścić na szkiełkach uprzednio pokrytych 200 mg/ml poli L lizyny (10 μl na szkiełko) 9,10,<br />
    Uwaga(!): Aby uniknąć rozdarcia skrawków, należy zwrócić uwagę na wszelkie uszkodzenia ostrza.
  5. Wszystkie sekcje należy suszyć na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie używać lub przechowywać w temperaturze -70°C do momentu użycia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda zapewnia łatwy do naśladowania protokół uzyskiwania cienkich skrawków kriostatu PFA ciał zarodkowych, przydatnych do testów immunofluorescencyjnych i hybrydyzacji in situ . Uzyskane w ten sposób kriosekcje pozwalają na badanie komórkowych i molekularnych aspektów różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, przy jednoczesnym zachowaniu ich struktury i organizacji w postaci agregatów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Jesteśmy wdzięczni Brunze S. Paulsen i Aline M. Fernandes za zdjęcia wykonane na EB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D (+) Odczynnik do sacharozyVetec228
Odczynnik do paraformaldehyduRieden-de Haë n16005
Roztwór PBSOdczynnikLGC Biotecnology13-30259.05
Odczynnik do bromowodorku poli-L-lizynySigma-AldrichP2636200 mg / ml w wodzie
Odczynnik złożony Tissue-Tek OCTSakura FinetekP2636
Odczynnikdo roztworu sacharozy10% roztwór sacharozy w PBS w/v
Odczynnikdo roztworu sacharozy20% roztwór sacharozy w PBS z v
odczynnikdo roztworu sacharozy30% roztwór sacharozy w PBS z / v
rurki stożkowejTechno Plastic Products9101515mL rurka stożkowa
Wytrząsarka do płytNarzędzieBiomixer
Narzędzie do kriostatuLeica MicrosystemsCM 1850
Forma do platformy OCTNarzędzieForma z tworzywa sztucznego plataform
narzędzie do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
  2. Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
  3. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
  4. Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
  5. Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
  6. Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
  7. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
  8. Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
  9. Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
  10. Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryoid BodiesCryosection TechniqueImmunofluorescence AnalysisIn Situ HybridizationEmbryonic Stem CellsOCT EmbeddingSucrose CryoprotectionParaformaldehyde FixationTissue SectioningGerm Layer Differentiation

Related Articles