Pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w zawiesinie różnicują się w ciała embrionalne (EB). W niniejszym materiale demonstrujemy, jak uzyskać wysokiej jakości krioprzekroje EB, które są przydatne do badania komórkowych i molekularnych aspektów embriogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu ich organizacji w formie agregatów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Embrionalne komórki macierzyste (ES) to komórki pluripotencjalne pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej wczesnych zarodków ssaków w stadium blastocysty 1. Kluczowym etapem różnicowania komórek ES jest tworzenie agregatów w postaci ciałek zarodkowych (EB) 2, 3. Formowanie EB opiera się na spontanicznej agregacji, gdy komórki ES są hodowane na płytkach nieprzylepnych. Trójwymiarowe EB odwzorowują wiele aspektów wczesnej embriogenezy ssaków i różnicują się w trzy warstwy zarodkowe: ektodermę, mezodermę i endodermę 4.
Immunofluorescencja i hybrydyzacja in situ są powszechnie stosowanymi technikami wykrywania białek docelowych oraz mRNA obecnych w komórkach przekroju tkankowego 5, 6, 7. Przedstawiamy tutaj prostą technikę przygotowania wysokiej jakości krio-przekrojów ciał embrionalnych. Podejście to opiera się na orientacji przestrzennej ciał embrionalnych (EB) podczas zatapiania w OCT, a następnie na technice krio-sekcjowania. Otrzymane przekroje mogą być poddawane szerokiej gamie procedur analitycznych w celu charakterystyki populacji komórek zawierających określone białka, RNA lub DNA. W związku z tym, przygotowanie krio-przekrojów EB (10μm) stanowi niezbędne narzędzie dla analiz barwień histologicznych (np. hematoksyliną i eozyną, DAPI), immunofluorescencji (np. Oct4, nestina) lub hybrydyzacji in situ. Technika ta może również pomóc w zrozumieniu aspektów embriogenezy w odniesieniu do zachowania trójwymiarowej sferycznej struktury EB.
Protokół
1. Fixacja i kriokonserwacja
Pluripotencjalne komórki macierzyste hodowano na zarodkowych fibroblastach mysich (MEF) inaktywowanych mitomycyną C i utrzymywano w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej o 20% zamiennika surowicy knockout (KSR) oraz 8ng/ mL czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2). W celu indukcji tworzenia ciałek zarodkowych (EB) komórki H9 przeniesiono do naczyń nieprzylegających i hodowano przez 7 dni w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej o 15% KSR 8.
Uwaga (!): Technikę tę można zastosować w przypadku ciałek EB pochodzących z dowolnych embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Zbierz ciała embroidalne (EB) z naczynia hodowlanego za pomocą pipety.
- Przenieś EB do stożkowej probówki o pojemności 15 mL i poczekaj, aż materiał opadnie na dno probówki.
- Usuń medium i utrwal EB w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w buforze PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Uwaga (!): W przypadku hybrydyzacji in situ należy przeprowadzić odzyskiwanie antygenów, aby uniknąć reakcji sieciowania z przeciwciałami wynikającej z zastosowania PFA6,7. - Usuń roztwór PFA i przemyj materiał buforem PBS przez 5 min.
- EB należy umieścić w szeregu rozcieńczeń roztworów sacharozy w buforze PBS (kolejno 10, 20 i 30%) w temperaturze 25-28°C, przy czym każdy roztwór musi być wymieniany co 30 min. Materiał można następnie przechowywać w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4°C aż do etapu zatapiania w OCT.
2. Osadzanie, orientacja i zamrażanie tkanek
- Ostrożnie pobierz ciała embrioidalne (EB) z probówki. Odlej jak największą ilość roztworu sacharozy.
Uwaga (!): Przed pobieraniem EB ważne jest zwilżenie wewnętrznej ścianki końcówki pipety roztworem sacharozy. Ta procedura pozwala zapobiec przywieraniu EB do końcówki. - Umieść EB w formie i usuń pozostały roztwór sacharozy za pomocą papieru filtracyjnego.
Uwaga (!): Ważne jest, aby nie wypełniać formy zbyt dużą ilością EB, aby uniknąć ich nakładania się na siebie. - Powoli wypełnij formę OCT, dbając o to, aby nie resuspender EB. Następnie umieść wszystkie EB w centrum formy i usuń pęcherzyki powietrza za pomocą pipety.
- Delikatnie mieszaj przez 15 minut.
- Otocz formę kruszonym suchym lodem, aby zamrozić próbkę. OCT powinno zostać całkowicie zamrożone. Na tym etapie bloki można przechowywać w temperaturze -70°C przez co najmniej rok.
3. Technika kriosekcjonowania
- Wyjąć zamrożony blok z temperatury -70°C i umieścić go w kriostacie uprzednio schłodzonym do temperatury od -18 do -21 °C.
Uwaga (!): Temperatury spoza tego zakresu mogą powodować problemy takie jak zwijanie się, topnienie lub pękanie skrawków. - Odczepić blok OCT od formy i umieścić go w uchwycie kriostatu, dodając więcej OCT.
- Ważne jest prawidłowe zorientowanie bloku i ustawienie go równolegle do krawędzi noża.
Uwaga(!): Ponieważ EB są mniejsze niż inne próbki tkanek, ten krok jest niezwykle istotny w celu zminimalizowania utraty materiału. - Bloki OCT należy skrawać powierzchownie, aż do uzyskania płaszczyzny powierzchni. Należy wykonać cienkie przekroje (10μm) próbki tkanki i nanieść je na szkiełka przedmiotowe uprzednio pokryte 200 mg/mL poli-L-lizyną (10 μL na szkiełko) 9,10.
Uwaga(!): Aby uniknąć rozdarć skrawków, należy zwrócić uwagę na ewentualne uszkodzenia noża. - Wszystkie skrawki powinny być suszone na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wykorzystane lub przechowywane w -70°C do czasu użycia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda przedstawia prosty do zastosowania protokół uzyskiwania cienkich skrawków kriostatowych ciał embrionalnych utrwalonych w PFA, które są przydatne do analiz immunofluorescencyjnych oraz hybrydyzacji in situ. Uzyskane skrawki kriostatowe umożliwiają badanie aspektów komórkowych i molekularnych różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, przy jednoczesnym zachowaniu ich struktury i organizacji jako agregatów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Jesteśmy wdzięczni Brunie S. Paulsen i Aline M. Fernandes za obrazy EB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| D(+) sacharoza | Odczynnik | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyd | Odczynnik | Rieden-de Haën | 16005 | |
| roztwór PBS | Odczynnik | LGC Biotechnology | 13-30259.05 | |
| Hydrobromian poli-L-lizyny | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P2636 | 200 mg/ml w wodzie |
| Compound Tissue-Tek O.C.T. | Odczynnik | Sakura Finetek | P2636 | |
| Roztwór sacharozy | Odczynnik | 10% (w/v) roztwór sacharozy w PBS | ||
| Roztwór sacharozy | Odczynnik | 20% (w/v) roztwór sacharozy w PBS | ||
| Roztwór sacharozy | Odczynnik | 30% (w/v) roztwór sacharozy w PBS | ||
| Probówka stożkowa | Narzędzie | Techno Plastic Products | 91015 | probówka stożkowa 15 ml |
| Inkubator z wytrząsaniem | Narzędzie | Biomikser | ||
| Kriostat | Narzędzie | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Forma do platformy OCT | Narzędzie | Platforma z formy plastikowej |
Bibliografia
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
