$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie próbki
Pierwszym krokiem w Western blotting jest przygotowanie próbki. Aby przygotować próbki do uruchomienia żelu, komórki i tkanki muszą zostać poddane lizie w celu uwolnienia interesujących białek.
- Wygodnym, gotowym do użycia odczynnikiem, który jest wszechstronny i łatwy w użyciu do ekstrakcji rozpuszczalnych białek, jest CytoBuster lub PhosphoSafe. Te ekstrakcyjne zawierają detergenty zoptymalizowane pod kątem wydajnej ekstrakcji rozpuszczalnych białek z komórek ssaków i owadów. Delikatna, niejonowa kompozycja odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster umożliwia izolację funkcjonalnie aktywnych białek endogennych lub eksprymowanych bez konieczności wtórnego traktowania, takiego jak sonikacja lub zamrażanie/rozmrażanie. PhoshoSafe ma dodatkową zaletę polegającą na tym, że zawiera cztery inhibitory fosfatazy.
- Osadzać komórki przez wirowanie na niskiej prędkości (np. 5 min przy 2500 x g), dobrze opróżnić osad komórkowy.
- Ponownie zawiesić komórki w odczynniku do ekstrakcji białek CytoBuster, używając 150 μl na10-6 komórek (optymalna ilość odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster może się różnić w zależności od wielkości komórki).
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Przenieść do odpowiedniej probówki i wirować przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4°C.
- Przenieść oczyszczony supernatant (ekstrakt komórkowy) do świeżej probówki i przystąpić do analizy.
- Do specjalistycznej ekstrakcji białek zalecamy stosowanie naszych wysokiej jakości zestawów ProteoExtract. EMD posiada kilkanaście zestawów do izolacji mitochondriów, subkomórkowej ekstrakcji proteomu, transbłonowej ekstrakcji białek i wielu innych. Odwiedź naszą stronę docelową Western blot, aby uzyskać więcej informacji.
- EMD sprzedaje również szeroką gamę zestawów koktajli inhibitorów proteaz i fosfatazy. Gdy tylko nastąpi liza, rozpoczyna się proteoliza, defosforylacja i denaturacja. Zdarzenia te można znacznie spowolnić, jeśli próbki są przechowywane przez cały czas na lodzie lub w temperaturze 4°C, a odpowiednie inhibitory są dodawane świeże do buforu do lizy. Odwiedź naszą stronę docelową Western blot, aby uzyskać więcej informacji.
2. STRONA SDS
Drugim krokiem w Western blotting jest separacja białek. Białka są rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej.
- Możesz zrobić swój własny żel PAGE, jednak my będziemy używać komercyjnie prefabrykowanego żelu.
- Po przygotowaniu próbki można przystąpić do określenia stężenia białka. EMD ma dwa zestawy do pomiaru stężenia, jeden to zestaw do oznaczania białek niezakłócających, a drugi to zestaw do oznaczania białek BCA.
- Po ocenie stężenia białka jesteśmy gotowi do przygotowania naszej próbki do załadowania żelu. Przeciwciała zazwyczaj rozpoznają niewielką część białka będącego przedmiotem zainteresowania (określaną jako epitop), a domena ta może znajdować się w konformacji 3D białka. Aby umożliwić dostęp przeciwciała do tej porcji, konieczne jest rozwinięcie białka.
- Do denaturacji należy użyć buforu ładującego z anionowym detergentem denaturującym dodecylosiarczanem sodu (SDS) i gotować mieszaninę w temperaturze 95-100°C przez 5 minut. Łatwym i wygodnym w użyciu buforem ładującym jest 4X Sample Buffer.
- Załaduj pierwszy pas studni za pomocą Trail Mix Protein Marker. Marker ten posiada trzy pasma referencyjne, które umożliwiają monitorowanie elektroforezy. Gdy żel jest zabarwiony, widocznych jest 10 pasm w zakresie od 10 do 225 kDa.
- Napełnij jednostkę elektroforezy działającym buforem. W przypadku żeli PAGE jest to zwykle 1X Tris-glicyna. Szczegółowe przepisy na można znaleźć na stronie Western blot. EMD oferuje wysokiej jakości odczynniki buforowe z naszą linią chemiczną OmniPur. Uruchom żel pod napięciem 220 V przez 1 godzinę.
- Po oddzieleniu białek zabarwić żel kolorem Coomassie blue, aby upewnić się, że białka migrowały równomiernie i równomiernie. RAPIDstain to ultrawrażliwa bejca, która jest gotowa do użycia. Nie jest wymagane odbarwianie.
3. Transfer białka
Tak jak białka z ładunkiem elektrycznym mogą być wywołane do przemieszczania się przez żel w polu elektrycznym, tak białka mogą być przenoszone w polu elektrycznym z żelu na membranę, będąc albo PVDF, albo nitrocelulozą.
- Dzisiaj zrobimy mokry transfer. W przypadku transferu na mokro żel i membrana są umieszczane między gąbką a papierem (gąbka / papier / żel / membrana / papier / gąbka) i wszystkie są ściśle zaciskane razem po upewnieniu się, że między żelem a membraną nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Kanapka jest zanurzona w buforze transferowym, do którego przykładane jest pole elektryczne. Ujemnie naładowane białka przemieszczają się w kierunku dodatnio naładowanej elektrody, ale błona zatrzymuje je, wiąże i uniemożliwia im kontynuowanie.
- Dostępne są dwa rodzaje membran: nitroceluloza i PVDF. Oba działają dobrze. Dzisiaj będziemy używać PVDF. Membrany PVDF wymagają moczenia w metanolu przez kilka minut, a następnie lodowatego buforu transferowego przez 5 minut. Żel musi również równoważyć się przez kilka minut w lodowatym buforze transferowym. Niezastosowanie się do tego może spowodować skurczenie się żelu podczas przenoszenia.
- Bufor do transferu na mokro to 1X Tris-glicyna z 20% metanolem. Szczegółowe przygotowania dostępne są na naszej stronie internetowej.
- Po zakończeniu transferu dobrym pomysłem jest wizualizacja białek, aby zapewnić równomierny transfer bez kieszeni powietrznych. Można to łatwo zrobić za pomocą RedAlert Western Blot Stain. Ta plama jest gotowa do użycia, a odbarwienie można łatwo wykonać za pomocą wody.
4. Przeciwciała i odczynniki pomocnicze
- Pierwszym krokiem do wykonania sondy i przeciwciała przeciwko antygenowi jest zablokowanie błony. Zablokowanie membrany zapobiega niespecyficznemu wiązaniu tła.
- Jako roztwór blokujący można użyć zarówno mleka beztłuszczowego, jak i BSA. Jednak w przypadku stosowania przeciwciał swoistych dla fosfosy nie zaleca się używania mleka, ponieważ spowoduje to wysokie tło.
- EMD oferuje kilka wysokiej jakości odczynników blokujących, w tym SeaBlock, który jest środkiem blokującym niepochodzącym od ssaków oraz BLOT QuickBlocker, który jest przygotowanym, gotowym do użycia środkiem blokującym. Dysponujemy również wysokiej jakości BSA (frakcja V).
- Inkubować membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
- Po inkubacji przemyć trzykrotnie w TBST lub PBST. Łatwym i wygodnym sposobem na zrobienie TBST lub PBST jest użycie naszych tabletów (PBS TWEEN Tablets/TBS TWEEN Tablets)
- Po zablokowaniu błony jesteś gotowy do inkubacji z pierwotnym przeciwciałem. EMD od ponad 30 lat oferuje kompleksowe portfolio wyjątkowych przeciwciał z najlepszą gwarancją na przeciwciała w branży. Pamiętaj, że w przypadku wszystkich przeciwciał EMD oferujemy pełną gwarancję 100% braku ryzyka. Kup przeciwciało i używaj go do dowolnej specyfiki gatunkowej lub zastosowania, którego pragniesz. Jeśli przeciwciało nie zadziała w sposób satysfakcjonujący, zapewnimy pełny kredyt do wykorzystania na dowolnym innym produkcie. Aby uzyskać więcej informacji, odwiedź naszą stronę internetową poświęconą Western blott.
- Dzisiaj będziemy inkubować nasze pierwotne przeciwciało przy użyciu roztworu 1 SignalBoost. SignalBoost to świetny produkt, który pozwala znacznie poprawić sygnał. Po prostu inkubuj swoje pierwszorzędowe przeciwciało w roztworze 1 i inkubuj przez 1 godzinę lub normalnie. Nie ma potrzeby dodawania kolejnych agentów blokujących. Alternatywnie możesz użyć BSA lub odtłuszczonego mleka w proszku jako środka blokującego.
- Umyć za pomocą TBST. TBST wytwarzamy przy użyciu gotowej do rozpuszczenia tabletki TBST.
- Inkubuj przeciwciało drugorzędowe przy użyciu roztworu 2 SignalBoost. Inkubować przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym przez 1 godzinę. Ponownie kilkakrotnie umyj membranę za pomocą TBST.
5. Wykrywanie
Dla HRP sprzężonych z przeciwciałami drugorzędowymi, ECL jest tradycyjnie używany. Doskonałym odczynnikiem ECL, który oferujemy, jest RapidStep. Zaletą RapidStep jest to, że nie jest wymagane mieszanie luminalu ani wzmacniacza. Wystarczy spryskać membranę kilka razy i wywołać za pomocą kliszy rentgenowskiej. RapidStep oferuje niską czułość piktogramu, a także emituje światło do 2 godzin po dodaniu podłoża.