Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.
Artykuł metodologiczny
Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego. Wykorzystuje ona elektroforezę żelową do rozdzielania białek natywnych lub zdenaturowanych na podstawie długości polipeptydu (w warunkach denaturujących) lub trójwymiarowej struktury białka (w warunkach natywnych/niedenaturujących). Następnie białka są przenoszone na membranę (zazwyczaj nitrocelulozową lub PVDF), gdzie są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla białka docelowego.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
Pierwszym krokiem w metodzie Western blotting jest przygotowanie próbek. Aby przygotować próbki do elektroforezy w żelu, komórki i tkanki muszą zostać poddane lizie w celu uwolnienia białek będących przedmiotem analizy.
- Wygodnym, gotowym do użycia odczynnikiem, który jest wszechstronny i łatwy w zastosowaniu do ekstrakcji białek rozpuszczalnych, jest CytoBuster lub PhosphoSafe. Bufory ekstrakcyjne te zawierają detergenty zoptymalizowane pod kątem wydajnej ekstrakcji białek rozpuszczalnych z komórek ssaków i owadów. Łagodny, niejonowy skład odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster umożliwia izolację funkcjonalnie aktywnych białek endogennych lub ekspresyjnych bez konieczności stosowania wtórnej obróbki, takiej jak sonikacja czy zamrażanie/rozmrażanie. PhosphoSafe posiada dodatkową zaletę w postaci zawartości czterech inhibitorów fosfataz.
- Osadź komórki poprzez wirowanie z niską prędkością (np. 5 min przy 2500 x g), a następnie dokładnie odlej nadsącz z osadu komórkowego.
- Resuspenduj komórki w odczynniku do ekstrakcji białek CytoBuster, stosując 150 μL na 106 komórek (optymalna ilość odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster może się różnić w zależności od wielkości komórek).
- Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Przenieś do odpowiedniej probówki i wiruj przez 5 min przy 16,000 x g w temperaturze 4°C.
- Przenieś klarowny nadsącz (ekstrakt komórkowy) do nowej probówki i przystąp do analizy.
- Do specjalistycznej ekstrakcji białek zalecamy stosowanie naszych wysokiej jakości zestawów ProteoExtract. EMD oferuje ponad tuzin zestawów do izolacji mitochondriów, ekstrakcji proteomu subkomórkowego, ekstrakcji białek transbłonowych i wielu innych. Więcej szczegółów można znaleźć na naszej stronie głównej poświęconej metodzie Western blot.
- EMD sprzedaje również szeroką gamę zestawów koktajli inhibitorów proteaz i fosfataz. Zaraz po wystąpieniu lizy rozpoczynają się procesy proteolizy, defosforylacji i denaturacji. Zjawiska te można znacznie spowolnić, jeśli próbki są przez cały czas przechowywane w lodzie lub w temperaturze 4°C, a do buforu do lizy dodaje się świeże, odpowiednie inhibitory. Więcej szczegółów można znaleźć na naszej stronie głównej poświęconej metodzie Western blot.
2. SDS-PAGE
Drugim etapem analizy Western blotting jest rozdział białek. Białka są rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej.
- Można przygotować własny żel PAGE, jednak w tym przypadku będziemy korzystać z gotowego żelu w sprzedaży.
- Po przygotowaniu próbki można przystąpić do oznaczenia stężenia białek. EMD oferuje dwa zestawy do pomiaru stężenia: Non-Interfering Protein Assay Kit oraz BCA Protein Assay Kit.
- Po oznaczeniu stężenia białka próbka jest gotowa do nałożenia na żel. Przeciwciała zazwyczaj rozpoznają niewielką część interesującego nas białka (zwaną epitopem), a domena ta może znajdować się wewnątrz konformacji 3D białka. Aby umożliwić przeciwciałom dostęp do tej części, konieczne jest rozfałdowanie białka.
- W celu denaturacji należy użyć buforu do nakładania próbek z anionowym detergentem denaturującym – dodecylosiarczanem sodu (SDS), a następnie gotować mieszaninę w temperaturze 95-100°C przez 5 minut. Wygodnym i łatwym w użyciu buforem jest 4X Sample Buffer.
- W pierwszej studni należy nanieść marker białek Trail Mix Protein Marker. Marker ten posiada trzy pasma referencyjne, które pozwalają monitorować przebieg elektroforezy. Po zabarwieniu żelu widocznych jest 10 pasm w zakresie 10-225 kDa.
- Wypełnij komorę elektroforetyczną buforem do prowadzenia elektroforezy. W przypadku żeli PAGE jest to zazwyczaj 1X Tris-glycine. Szczegółowe przepisy na bufory znajdują się na stronie dotyczącej Western blottingu. EMD oferuje wysokiej jakości odczynniki buforowe w ramach linii chemicznej OmniPur. Prowadź elektroforezę przy napięciu 220V przez 1 godzinę.
- Po rozdzieleniu białek zabarw żel błękitem Coomassie, aby upewnić się, że białka migrowały równomiernie i jednorodnie. RAPIDstain to ultrasensytywny barwnik gotowy do użycia, który nie wymaga odbarwiania.
3. Transfer białek
Podobnie jak białka posiadające ładunek elektryczny mogą być indukowane do przemieszczania się przez żel w polu elektrycznym, tak samo białka mogą być przenoszone w polu elektrycznym z żelu na membranę, wykonaną z PVDF lub nitrocelulozy.
- Dzisiaj przeprowadzimy transfer mokry. W transferze mokrym żel i membranę umieszcza się pomiędzy gąbką a papierem (gąbka/papier/żel/membrana/papier/gąbka), a następnie całość mocno zaciska, upewniając się, że między żelem a membraną nie powstały pęcherzyki powietrza. Tak przygotowany zestaw zanurza się w buforze do transferu, w którym przykłada się pole elektryczne. Ujemnie naładowane białka wędrują w kierunku dodatnio naładowanej elektrody, jednak membrana je zatrzymuje, wiąże i uniemożliwia dalszy ruch.
- Dostępne są dwa rodzaje membran: nitrocelulozowa oraz PVDF. Obie sprawdzają się dobrze. Dzisiaj będziemy używać PVDF. Membrany PVDF wymagają namoczenia w metanolu przez kilka minut, a następnie w lodowatym buforze do transferu przez 5 minut. Żel również musi być równoważony przez kilka minut w lodowatym buforze do transferu. Pominięcie tego kroku może spowodować skurczenie się żelu podczas transferu.
- Bufor do transferu mokrego to 1X Tris-glicyna z 20% metanolu. Szczegółowe instrukcje przygotowania buforów są dostępne na naszej stronie internetowej.
- Po zakończeniu transferu warto przeprowadzić wizualizację białek, aby upewnić się, że transfer przebiegł równomiernie i bez pęcherzyków powietrza. Można to łatwo zrobić za pomocą barwnika RedAlert Western Blot Stain. Barwnik ten jest gotowy do użycia, a proces odbarwiania można łatwo przeprowadzić w wodzie.
4. Przeciwciała i odczynniki pomocnicze
- Pierwszym krokiem w procesie wykrywania i wiązania przeciwciał z antygenem jest blokowanie membrany. Blokowanie membrany zapobiega niespecyficznemu wiązaniu w tle.
- Jako roztwór blokujący można zastosować mleko odtłuszczone lub BSA. Jednakże przy użyciu przeciwciał fosfospecyficznych nie zaleca się stosowania mleka, ponieważ powoduje ono wysokie tło.
- Firma EMD oferuje kilka wysokiej jakości odczynników blokujących, w tym SeaBlock, który jest niemammalicznym czynnikiem blokującym, oraz BLOT QuickBlocker, który jest gotowym do użycia czynnikiem blokującym. Oferujemy również wysokiej jakości BSA (frakcja V).
- Inkubuj membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym wytrząsaniu.
- Po inkubacji przemyj membranę trzy razy w TBST lub PBST. Łatwym i wygodnym sposobem przygotowania TBST lub PBST jest zastosowanie naszych tabletek (PBS TWEEN Tablets/TBS TWEEN Tablets).
- Po zablokowaniu membrany można przystąpić do inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Od ponad 30 lat firma EMD oferuje kompleksowe portfolio wyjątkowych przeciwciał z najlepszą w branży gwarancją. Pamiętaj, że dla wszystkich przeciwciał EMD oferujemy pełną, 100% gwarancję bez ryzyka. Kup przeciwciało i zastosuj je dla dowolnej specyficzności gatunkowej lub w dowolnej aplikacji. Jeśli przeciwciało nie zadziała w sposób satysfakcjonujący, zapewnimy pełną kwotę kredytu do wykorzystania na dowolny inny produkt. Więcej szczegółów znajduje się na naszej stronie internetowej poświęconej Western blottingowi.
- Dzisiaj inkubujemy przeciwciało pierwszorzędowe z użyciem roztworu 1 SignalBoost. SignalBoost to doskonały produkt, który pozwala na znaczne wzmocnienie sygnału. Wystarczy inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w Roztworze 1 przez 1 godzinę lub zgodnie ze standardową procedurą. Nie ma potrzeby dodawania dalszych czynników blokujących. Alternatywnie można zastosować BSA lub odtłuszczone mleko w proszku jako czynnik blokujący.
- Przemyj membranę w TBST. Przygotowujemy TBST przy użyciu gotowych do rozpuszczenia tabletek TBST.
- Inkubuj przeciwciało drugorzędowe z użyciem roztworu 2 SignalBoost. Inkubuj przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym przez 1 godzinę. Ponownie przemyj membranę kilka razy w TBST.
5. Detekcja
W przypadku przeciwciał wtórnych koniugowanych z HRP tradycyjnie stosuje się ECL. Doskonałym odczynnikiem ECL, który oferujemy, jest RapidStep. Zaletą RapidStep jest brak konieczności mieszania luminoforu lub wzmacniacza. Wystarczy kilka razy spryskać membranę, a następnie przeprowadzić wywoływanie za pomocą filmu rentgenowskiego. RapidStep charakteryzuje się niską czułością pikoświetlną oraz emituje światło przez maksymalnie 2 godziny po dodaniu substratu.
Dyskusja
W tej prezentacji wideo omówiliśmy główne etapy techniki Western blotting, którymi są: przygotowanie próbek, SDS-PAGE, blokowanie membrany/wykrywanie za pomocą przeciwciał oraz detekcja. Na każdym etapie procesu należy stosować odpowiednie protokoły i właściwe odczynniki, aby uzyskać wyniki wysokiej jakości.
Oświadczenia
Autorzy Anna Eslami i Jesse Lujan są zatrudnieni przez firmę EMD Chemicals Inc, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.
Materiały
Bibliografia
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. 'W. estern blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).
- O'Malley, D. ervia Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
Przedruki i uprawnienia
