Szybkie termocyklowanie PCR z wykorzystaniem mikroskalowej konwekcji termicznej

Podsumowanie

Opisujemy nową metodę przeprowadzania replikacji DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Wykorzystano konwekcję termiczną do ciągłego przemieszczania odczynników między warunkami denaturacji, przyłączania i elongacji poprzez utrzymywanie przeciwległych powierzchni reaktora w stałej temperaturze. Ta naturalnie prosta konstrukcja obiecuje zwiększenie dostępności szybkich testów PCR.

Streszczenie

Wiele testów biologii molekularnej w pewien sposób opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu namnożenia początkowo rozcieńczonej próbki docelowego DNA do poziomu stężenia umożliwiającego detekcję. Jednak konstrukcja konwencjonalnego sprzętu do termocyklingu PCR, oparta głównie na masywnych metalowych blokach grzewczych, których temperatura jest regulowana przez grzejniki termoelektryczne, znacznie ogranicza osiągalną szybkość reakcji¹. Do wielokrotnego ogrzewania i chłodzenia mieszaniny reagentów wymagana jest również znaczna moc elektryczna, co ogranicza możliwość zastosowania tych urządzeń w formacie przenośnym.

Konwekcja termiczna wyłoniła się jako obiecująca alternatywna metoda termocyklowania, która ma potencjał do przezwyciężenia tych ograniczeń^2-9. Przepływy konwekcyjne występują powszechnie w różnorodnych środowiskach, od atmosfery, oceanów i wnętrza Ziemi, po dekoracyjne i kolorowe lampy lawowe. Ruch płynu jest inicjowany w ten sam sposób w każdym przypadku: niestabilność napędzana wypornością pojawia się, gdy ograniczona objętość płynu zostaje poddana przestrzennemu gradientowi temperatury. Te same zjawiska oferują atrakcyjny sposób prowadzenia termocyklowania w reakcji PCR. Poprzez zastosowanie statycznego gradientu temperatury w odpowiednio zaprojektowanej geometrii reaktora, można ustanowić ciągły przepływ cyrkulacyjny, który będzie wielokrotnie transportował odczynniki PCR przez strefy temperatury związane z etapami denaturacji, przyłączania starterów i elongacji reakcji (Rysunek 1). Termocyklowanie może zatem przebiegać w sposób pseudoizotermiczny poprzez proste utrzymywanie dwóch przeciwległych powierzchni w stałych temperaturach, co całkowicie eliminuje konieczność wielokrotnego ogrzewania i chłodzenia urządzenia.

Jednym z głównych wyzwań w projektowaniu konwekcyjnych termocyklerów jest konieczność precyzyjnego kontrolowania przestrzennych rozkładów prędkości i temperatury wewnątrz reaktora, aby zapewnić, że odczynniki sekwencyjnie zajmują odpowiednie strefy temperaturowe przez wystarczający czas^10,11. W niniejszej pracy opisujemy wyniki naszych działań mających na celu zbadanie pełnych trójwymiarowych rozkładów prędkości i temperatury w mikroskalowych konwekcyjnych termocyklerach¹². Nieoczekiwanie odkryliśmy podzbiór złożonych trajektorii przepływu, które są wysoce korzystne dla PCR dzięki synergicznemu połączeniu (1) ciągłej wymiany między ścieżkami przepływu, co stwarza zwiększoną możliwość próbkowania przez odczynniki pełnego zakresu optymalnych profili temperaturowych, oraz (2) wydłużenia czasu spędzonego w strefie temperatury elongacji, która jest etapem limitującym szybkość reakcji PCR. W reaktorach zaprojektowanych do generowania takich przepływów możliwe jest osiągnięcie niezwykle szybkich czasów amplifikacji DNA (poniżej 10 min).

Protokół

1. Podstawowa konstrukcja konwekcyjnego termocyklera

1. Zbudowaliśmy proste urządzenie do konwekcyjnego termocyklingu, składające się z wymiennych plastikowych „wkładów” z komorami reakcyjnymi, które są umieszczone pomiędzy dwiema płytami aluminiowymi o niezależnie sterowanych temperaturach⁷ (Rysunek 2).
2. cylindryczne studzienki reaktora wykonano poprzez nawiercanie otworów w blokach poliwęglanowych, stosując różne kombinacje średnicy otworu i grubości arkusza tworzywa w celu uzyskania pożądanych proporcji (wysokość/średnica = h/d). W przedstawionych tutaj wynikach rozważono dwie różne geometrie reaktora: h/d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, objętość 38,2 μL; h/d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, objętość 18,5 μL.
3. Dolna powierzchnia reaktora jest ogrzewana za pomocą bloku aluminiowego zawierającego grzałki patronowe połączone z regulatorem temperatury sterowanym przez mikroprocesor.
4. Temperaturę górnej powierzchni reaktora reguluje blok aluminiowy podłączony do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej.
5. Cały zespół jest skręcony nylonowymi śrubami w celu ograniczenia przewodzenia cieplnego pomiędzy przeciwstawnymi blokami aluminiowymi.

2. Przygotowanie i ładowanie mieszaniny reakcyjnej PCR

1. Typowa 100 μL mieszanina reakcyjna zawiera 10 μL 10x roztworu buforu, 6 μL 25 mM MgCl₂, 10 μL dNTPs (po 2 mM każdego), 41,2 μL wody DI, 10 μL sondy β-actin, 10 μL przedniego primera β-actin, 10 μL tylnego primera β-actin, 2 μL ludowego matrycowego DNA genomicznego (10 ng/μL) oraz 0,8 μL polimerazy DNA KOD (2,5 units/ μL).
2. Przed naniesieniem odczynników uszczelnij dolną powierzchnię komory PCR, używając cienkiego paska taśmy aluminiowej.
3. Przepłucz studzienki reaktora wodnym roztworem albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 10 mg/mL, a następnie Rain-X Anti-Fog.
4. Nanieś odczynniki do studzienek reaktora za pomocą długich końcówek do pipetowania do żeli i uszczelnij górną powierzchnię taśmą teflonową FEP.

3. Prowadzenie reakcji w konwekcyjnym termocyklerze

1. Przed rozpoczęciem reakcji należy wstępnie rozgrzać oba bloki aluminiowe do pożądanych temperatur górnej i dolnej powierzchni.
2. Plastikowy reaktor wypełniony odczynnikami do PCR należy umieścić pomiędzy aluminiowymi blokami grzejnymi, a następnie szybko zaciśnąć cały zespół za pomocą nylonowych śrub.
3. Po przebiegu reakcji w wyznaczonym czasie należy wyłączyć grzejniki i umieścić dolną (gorącą) powierzchnię urządzenia na schłodzonym bloku metalowym, aby szybko go ochłodzić i zatrzymać przepływ konwekcyjny.
4. Należy wyjąć plastikowy reaktor i wypipetować produkty z otworów (używając długich końcówek do nakładania żelu) w celu przeprowadzenia dalszej analizy.

4. Wykonywanie analizy za pomocą elektroforezy w żelu

1. Przygotuj żel agarozy o stężeniu 2% wag., podgrzewając 10 g agarozy z 500 mL buforu 1x na mieszalce z podgrzewaniem, aż roztwór stanie się klarowny.
2. Wlej żel agarozowy do formy odlewniczej i włóż grzebień. Pozostaw żel do zastygnięcia na ok. 30 min.
3. Wyjmij grzebień i dolej bufor 1x TAE, aż żel zostanie całkowicie zanurzony.
4. Próbki DNA barwione fluorescencyjnie zawierają 2 μL roztworu 100x SYBR Green I, 2 μL próbki DNA, 2 μL barwnika do ładowania 6x Orange Loading Dye oraz 4 μL buforu TAE.
5. Naniesienie próbek DNA do dołków i przeprowadź elektroforezę przy napięciu 60 V przez 1 h, stosując marker wielkości DNA 100 bp.
6. Wyjmij żel i sfotografuj go w świetle UV w celu uzyskania wyniku.

5. Reprezentatywne wyniki:

Optymalna konstrukcja konwekcyjnych termocyklerów polega na wyborze odpowiedniej geometrii reaktora, która wygeneruje przepływ cyrkulacyjny zdolny do transportu odczynników przez kluczowe temperatury biorące udział w procesie PCR. Parametrami geometrycznymi, które mogą być zmieniane w rozważanych tutaj reaktorach cylindrycznych, są wysokość (h) i średnica (d), lub równoważnie stosunek wysokości do średnicy (h/d). Za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) zbadaliśmy trójwymiarowe pola przepływu wewnątrz konwekcyjnych reaktorów PCR dla różnych stosunków wysokości do średnicy i stwierdzono, że mogą pojawić się nieoczekiwanie złożone wzory. Co ważniejsze, nasza analiza ujawniła podzbiór tych złożonych pól przepływu, które znacząco przyspieszają reakcję¹².

Efekty geometryczne te można wyraźnie zaobserwować, porównując pola przepływu w reaktorach o wysokim i niskim stosunku wysokości do średnicy. W przypadku wysokiego stosunku (h/d = 9; wysoki, wąski cylinder) elementy płynu są adwekcyjnie przenoszone wzdłuż trajektorii tworzących w zasadzie zamknięte pętle i są one uwięzione na tych samych ścieżkach przez długi czas (Rysunek 3a). W konsekwencji istnieje niewielka szansa na wymianę między trajektoriami przepływu, które wystawiają odczynniki na optymalną sekwencję warunków termicznych dla PCR (oscylując między ekstremami temperatury przyłączania i denaturacji przy górnej i dolnej powierzchni reaktora), a znacznie większą grupą pozostałych trajektorii, które nie przyczyniają się do amplifikacji (zlokalizowanych bliżej centrum reaktora).

Pole przepływu jest znacznie inne przy mniejszym stosunku wymiarów (h/d = 3; krótszy, szerszy cylinder), stając się bardziej chaotycznym w tym sensie, że trajektorie elementów płynu nie tworzą już zamkniętych ścieżek (Rysunek 3b). W związku z tym, mimo że odczynniki są poddane bardziej złożonemu profilowi temperatury, elementy płynu mogą poruszać się po znacznie szerszym zakresie trajektorii, dzięki czemu większa część objętości odczynników ma możliwość przejścia przez optymalne profile termiczne. Wyniki te sugerują w sposób nieintuicyjny, że choć poszczególne trajektorie przepływu przy h/d = 9 mogą wydawać się korzystniejsze dla PCR, tworząc profile temperatury, które „wyglądają” podobnie do tych stosowanych w konwencjonalnym termocyklerze, to chaotyczny charakter pola przepływu przy h/d = 3 ostatecznie dominuje w skali globalnej poprzez promowanie zwiększonej wymiany, dzięki czemu odczynniki nie pozostają uwięzione w niekorzystnych trajektoriach przez zbyt długi czas.

Aby przetestować tę hipotezę i określić, która geometria reaktora jest korzystniejsza dla PCR, wykorzystaliśmy oba warianty do przeprowadzenia replikacji PCR docinkowego fragmentu o długości 295 bp powiązanego z genem β-aktyny z matrycy ludzkiego DNA genomowego. Co zdumiewające, rutynowo uzyskiwaliśmy amplifikację właściwego produktu docelowego w zaledwie 10 min przy h/d = 3 (Rysunek 4a), podczas gdy ta sama reakcja wymagała co najmniej 20 min, zanim zaobserwowano wykrywalne produkty przy h/d = 9 (Rysunek 4b). Specyficzność reakcji jest również znacznie większa przy h/d = 3, gdzie otrzymuje się pojedynczy produkt PCR, podczas gdy przy h/d = 9 powstaje wiele niespecyficznych produktów, ponieważ pole przepływu więzi elementy płynu w niekorzystnych trajektoriach termicznych przez dłuższy czas.

Rycina 1. Konwekcja termiczna w komorze cylindrycznej, której górna i dolna powierzchnie są utrzymywane w różnych stałych temperaturach. Jeśli temperatura dolnej powierzchni jest wyższa niż górnej, w zamkniętym płynie powstaje pionowy gradient gęstości, który jest w stanie wygenerować cyrkulacyjny wzorzec przepływu. Przy odpowiednim doborze parametrów geometrycznych (wysokość h i średnica d), pole przepływu konwekcyjnego może zostać wykorzystane do sterowania termocyklingiem PCR, gdy górna i dolna powierzchnie są utrzymywane odpowiednio w temperaturach bliskich temperaturze przyłączania i denaturacji (grawitacja działa pionowo w dół).

Rysunek 2. (a) Kluczowe elementy termocyklera PCR z przepływem konwekcyjnym. Wkład reaktora składa się z bloku poliwęglanowego zawierającego układ cylindrycznych komór. Blok znajduje się pomiędzy górną płytką, przeznaczoną do podłączenia do cyrkulującej kąpieli wodnej, a dolną płytką z wbudowanymi grzałkami. (b) Odczynniki do PCR są ładowane i uszczelniane wewnątrz wkładu reaktora, po czym urządzenie jest montowane w celu przeprowadzenia reakcji. Po zakończeniu procesu produkty można łatwo pobrać pipetą do dalszej analizy.

Rycina 3. Symulacje komputerowe trójwymiarowych pól przepływu konwekcyjnego generowanych w reaktorach cylindrycznych z temperaturami 53 i 96 °C wymuszonymi odpowiednio na powierzchni górnej i dolnej. Wyniki przedstawiono dla stosunków wymiarowych (a) h/d = 9 (objętość reaktora 38,2 μL) oraz (b) h/d = 3 (objętość reaktora 18,5 μL). Po lewej stronie pokazano reprezentatywną trajektorię elementu płynu poruszającego się w trójwymiarowym polu przepływu wraz z projekcjami ścieżki w rzucie z góry i z boku; po prawej stronie przedstawiono odpowiadający im wykres zależności temperatury od czasu dla śledzonego elementu płynu. Profil termiczny przy h/d = 9 wydaje się zbliżony do profilu w konwencjonalnym termocyklerze, jednak chaotyczne pole przepływu przy h/d = 3 jest wbrew intuicji bardziej korzystne dla PCR.

Rycina 4. Wyniki replikacji DNA uzyskane w geometriach reaktora przedstawionych na Rycini 3 (powierzchnie górna i dolna były utrzymywane odpowiednio w temperaturach 53 i 96 °C). (a) Reakcja PCR jest znacznie przyspieszona przy h/d = 3, co potwierdzają intensywne produkty widoczne już po 10 min czasu reakcji (M: drabinka 100 bp, ścieżki 1-4: produkty z równoległych reakcji w 4 różnych komorach cylindrycznych). (b) Ta sama reakcja przeprowadzona przy h/d = 9 wymaga co najmniej 20 min przed zaobserwowaniem widocznych produktów, a obecność wielu prążków wskazuje na replikację nieswoistego docelowego DNA oprócz pożądanego produktu (M: drabinka 100 bp, ścieżki 1-2: produkty z równoległych reakcji w 2 różnych komorach cylindrycznych).

Dyskusja

Wzajemne oddziaływanie między przepływem a reakcją chemiczną może ulec gwałtownej zmianie pod wpływem chaotycznej adwekcji. Te złożone stany przepływu są jednak trudne do zbadania, zwłaszcza w realistycznych geometriach, w których istotne stają się efekty trójwymiarowe. Konwekcja Rayleigha-Bénarda przy h/d > 1 nie tylko stanowi wygodną platformę do badania tych zjawisk, ale jej zastosowanie w reakcji PCR umożliwia również analizę sprzężenia między przepływem a reakcjami chemicznymi. Ta wyjątkowa możliwość pozwala na wybór optymalnych stanów przepływu, w których efekty chaotyczne (kontrintuicyjnie) przyspieszają tempo replikacji DNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw KOD DNA Polymerase	Novagen, EMD Millipore	71085-3
Zestaw odczynników kontrolnych TaqMan β-actin	Applied Biosystems	401846
Taśma aluminiowa	Axygen Scientific	PCR-AS-200
Albuminy surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog	SOPUS Products
Wydłużone końcówki do pipet do nakładania próbek na żel	Fisher Scientific	05-408-151
Taśma teflonowa FEP	McMaster-Carr	7562A17
Żel agarozy	Bio-Rad	161-3107
Bufor do elektroforezy TAE	Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I	Invitrogen	S7563
6x Pomarańczowy barwnik do nakładania próbek	Fermentas	R0631
Marker wielkości DNA 100 bp	Bio-Rad	170-8202