Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopowa tomografia komputerowa (microCT) umożliwia wysokorozdzielcze obrazowanie wolumetryczne anatomii żywych małych zwierząt. Jednakże kontrast między różnymi tkankami miękkimi a płynami ustrojowymi w obrazach micro-CT jest z natury słaby 1. W takich warunkach wizualizacja naczyń krwionośnych staje się zadaniem niemal niemożliwym. Aby temu zaradzić i poprawić wizualizację naczyń krwionośnych, można zastosować egzogenne środki kontrastowe. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię wizualizacji sieci naczyniowej w modelu gryzoni. Wykorzystując długo działający, wodny koloidalny polidyspersyjny jodowy środek kontrastowy do krwi, eXIA 160XL, zoptymalizowaliśmy parametry akwizycji obrazu oraz techniki renderowania objętościowego w celu zlokalizowania naczyń krwionośnych u żywych zwierząt. Nasze wyniki sugerują, że aby uzyskać doskonały kontrast między kośćmi a tkanką miękką naczyń, niezbędne było zastosowanie akwizycji wieloklatkowej (co najmniej 5-8 klatek na widok) oraz od 360 do 720 widoków (dla pełnego obrotu 360°). Wykazaliśmy również zastosowanie dwuwymiarowej funkcji transferu (gdzie kolor i nieprzezroczystość woksela przypisano proporcjonalnie do wartości CT i wielkości gradientu) w wizualizacji anatomii i podkreśleniu struktury będącej przedmiotem zainteresowania, czyli sieci naczyń krwionośnych. Ta obiecująca praca stanowi podstawę do jakościowej i ilościowej oceny przedklinicznych badań nad antyangiogenezą z wykorzystaniem myszy transgenicznych lub myszy z ksenoprzeszczepami guzów.
Protokół
1. Iniekcje u zwierząt
Przed wstrzyknięciem dożylnym do żyły ogonowej skórę ogona należy oczyścić za pomocą gazików nasączonych alkoholem izopropylowym w celu sterylizacji. Następnie myszom należy wstrzyknąć 0,2 mL/20 g jodowanego środka kontrastowego do naczyń krwionośnych o stężeniu 20 mg jodu/mL (eXIA 160XL; Binito Biomedical, Inc. Ottawa, ON, Canada) do dystalnej żyły ogonowej, używając strzykawek insulinowych U-100 28G½ o pojemności ½ CC z niską objętością martwą (Product #329461, Becton Dickinson and company, NJ, USA).
2. Przygotowanie zwierząt
Po 10 minutach od wstrzyknięcia zwierzęta należy przygotować do obrazowania mikroCT. Najpierw zwierzę należy znieczulić w komorze, stosując 2% izofluranu w 100% tlenie z przepływem 2,5 litrów na minutę. Należy zastosować maść nawilżającą do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówek podczas znieczulenia. Temperaturę ciała należy utrzymywać na poziomie 37°C za pomocą mat grzewczych.
3. Obrazowanie MicroCT
Następnie myszy należy poddać skanowaniu w urządzeniu microCT zdolnym do obrazowania żywych zwierząt. Aby zminimalizować artefakty ruchowe i zapewnić stabilność, myszy można umieścić w dostępnej komercyjnie komorze multimodalnej (Numira Biosciences, Salt Lake City, UT) z systemem dopływu i odpływu powietrza. Aby zapobiec hipotermii zwierzęcia podczas skanowania microCT, można zastosować żelowe podkładki grzewcze (Hot Cold Therapy Brace, CVS Pharmacy Woonsocket, RI), ogrzewacze do palców (Heat Factory, Vista, CA) lub glinkowe podkładki Thermipaq (Thermionics, Springfield, IL). Podkładki grzewcze należy umieścić pod piankowym podłożem, aby utrzymać temperaturę myszy na poziomie 37°C, unikając bezpośredniego kontaktu z zwierzęciem. Parametry życiowe zwierzęcia, takie jak temperatura ciała, częstość oddechów i tętno, powinny być monitorowane przy użyciu systemów monitorowania i bramkowania dla małych zwierząt, takich jak SA Instruments (Stony Brook, NY).
Poniższy protokół obrazowania może służyć jako wytyczna pomagająca w określeniu odpowiednich parametrów skanowania dla dowolnych urządzeń microCT. Zwierzęta użyte w tym eksperymencie zostały przeskanowane z rozdzielczością 93 μm na wolumetrycznym skanerze CT GE eXplore Locus (GE Healthcare, London, Ontario). Ten skaner wolumetryczny wykorzystuje detektor CCD 3500 x 1750 do rekonstrukcji wiązki stożkowej metodą Feldkampa. Parametry niezależne od platformy, takie jak natężenie prądu, napięcie i czas ekspozycji, utrzymano na stałym poziomie odpowiednio 450 μA, 80 kVP i 100 ms. Standardowe parametry czasu ekspozycji, liczby klatek na widok oraz liczby widoków mogą być zmienne i mogą wynosić odpowiednio 100 ms, 5-8 oraz 360-720, przy całkowitym czasie skanowania wynoszącym około 20 minut. Obrazy zrekonstruowano przy użyciu autorskiego oprogramowania producenta EVSBeam.
4. Renderowanie obrazu
Zrekonstruowane dane microCT mogą zostać wykorzystane do zaawansowanego renderowania obrazów z użyciem funkcji transferu izopowierzchniowej, jednowymiarowej lub dwuwymiarowej przy pomocy oprogramowania do przetwarzania obrazów Seg3D (Seg3D, http://www.sci.utah.edu/cibc/software).
5. Reprezentatywne wyniki
Prosimy o zapoznanie się z załączoną ryciną przedstawiającą mysz typu dzikiego, przeskanowaną za pomocą eXIA160XL przy użyciu ustawień opisanych w sekcji metod.
Rysunek 1. Obraz renderowany za pomocą dwuwymiarowej funkcji transferu (2DTF) myszy typu dzikiego, utworzony przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów Seg3D (Seg3D, http://www.sci.utah.edu/cibc/software). Zwierzęciu wstrzyknięto eXIA160XL, a 10 minut później wykonano skan microCT z izometryczną rozdzielczością 93 μm przy zastosowaniu ustawień opisanych w sekcji metody.
Wideo 1. Film przedstawiający obrót o 360° myszy typu dzikiego, stworzony za pomocą renderowania dwuwymiarowej funkcji transferu (2DTF) w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów Imagevis3D (Imagevis3D, http://www.sci.utah.edu/cibc/software). Zwierzęciu wstrzyknięto eXIA160XL, a 10 minut później wykonano skanowanie mikroCT z izometryczną rozdzielczością 93 μm przy użyciu ustawień opisanych w sekcji metody.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Głównym celem tej techniki obrazowania naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (microCT) jest zapewnienie optymalnej metody generowania wysokiej jakości zbiorów danych do analizy sieci naczyniowych u żywych myszy. W obrazowaniu microCT lepszy stosunek sygnału do szumu w tkankach miękkich uzyskuje się poprzez wydłużenie czasu skanowania przy zwiększeniu liczby projekcji oraz liczby klatek na projekcję 2.
Identyfikacja naczyń krytycznie zależy od dokładnego rozpo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszystkie procedury z użyciem zwierząt były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals) i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w University of Texas Health Science Center w San Antonio.
Podziękowania
Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantu NCI nr 5R01CA133229-03.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| eXIA 160XL | Binito Biomedical, Inc. | eXIA160XL-01 |
Bibliografia
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20, 417-424 (2002).
- Kindlmann, G. L., Weinstein, D. M., Jones, G. M., Johnson, C. R., Capecchi, M. R., Keller, C. Practical Vessel Imaging by Computed Tomography in Live Transgenic Mouse Models for Human Tumors. Molecular Imaging. 4, 417-424 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
