W niniejszym materiale prezentujemy protokół barwienia żywych komórek, który umożliwia wygodne wykrywanie receptorów zapachowych na powierzchni komórek HEK293T. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do analizy ekspresji powierzchniowej innych receptorów chemosensorycznych lub receptorów GPCR.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Barwny świat zapachów jest rozpoznawany przez zmysł węchu. Węch u myszy jest mediowany przez repertuar około 1200 receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs) 1, które według przypuszczeń wiążą lotne cząsteczki substancji zapachowych i przekształcają sygnał zewnątrzkomórkowy w sygnał wewnątrzkomórkowy poprzez sprzężenie z białkiem G Gαolf. Uważa się, że wiązanie substancji zapachowych z receptorami odbywa się zgodnie z regułą kombinatoryczną, co oznacza, że jedna substancja zapachowa może wiązać się z kilkoma receptorami, a jeden receptor może wiązać kilka substancji zapachowych w różnym stopniu 2. Badania biochemiczne, sygnalizacyjne oraz badania wiązania ligandów dla większości GPCRs były wygodnie przeprowadzane z wykorzystaniem komórek heterologicznych. Jednak stosowanie komórek heterologicznych do badania receptorów węchowych było przez długi czas niemożliwe, ponieważ po transfekcji nie były one eksportowane na powierzchnię komórki. Saito i wsp. wykazali, że chaperony z rodziny białek transportujących receptory (RTP), posiadających pojedynczy motyw przechodzenia przez błonę, wykazują zwiększoną ekspresję w neuronach sensorycznych węchu i działają jako chaperony transportujące receptory węchowe na powierzchnię w komórkach heterologicznych podczas wspólnej kotransfekcji 3. Aby przeprowadzić testy biochemiczne dla receptorów z użyciem komórek heterologicznych, należy najpierw ustalić, czy receptor wykazuje silną ekspresję powierzchniową w danej linii komórkowej. Można to zbadać poprzez nadekspresję receptorów wraz z chaperonem RTP1S, a następnie przeprowadzić barwienie żywych komórek w celu fluorescencyjnego oznakowania wyłącznie domeny zewnątrzkomórkowej lub tagu w tej domenie. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia żywych komórek, który może być wygodnie wykorzystany do wykrywania receptorów węchowych na powierzchni komórek HEK293T. Ponadto może on służyć do badania ekspresji powierzchniowej innych receptorów chemosensorycznych lub GPCRs.
Protokół
1. Procedura:
Procedura składa się z trzech części realizowanych w ciągu 3 dni: transferu komórek, transfekcji oraz immunocytochemii, przy czym każdego dnia wykonuje się jeden etap. Transfer i transfekcja komórek w ciągu pierwszych dwóch dni muszą być przeprowadzone w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Dzień 1: Przesiewanie komórek HEK293T do analizy ekspresji powierzchniowej.
- Poziomka transferowa (M10): W warunkach sterylnych wymieszać minimalne medium niezbędne (MEM) uzupełnione o 10% (objętościowo) płodowej surowicy bydlęcej.
- Hodywać komórki w płytce hodowlanej 100 mm do pożądanego stopnia konfluencji, w zależności od liczby płytek wymaganych do przygotowania układu. Ważne jest określenie frakcji komórek do transferu, aby uniknąć przerośnięcia lub zbyt małej gęstości komórek: na przykład z płytki 100 mm o 100% konfluencji można przenieść około 3% komórek do płytki 35 mm, aby uzyskać w niej konfluencję na poziomie około 30%.
- Przed transferem komórek, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, pokryć szklane szkiełka podstawowe 22 X 22 mm sterylną poli-D-lizyną (1mg/ mL) i umieścić jedno w każdej płytce hodowlanej 35 mm, stroną pokrytą do góry, w celu wysiania komórek (Rycina 1). Pozostawić roztwór do wyschnięcia na 5- 10 minut. W tym czasie można włączyć źródło UV w komorze laminarnej, aby wysterylizować szkiełka, jeśli jest to pożądane. Poli-D-lizyna pomaga komórkom heterologicznym przylegać do szkiełek.
- Aby przenieść komórki, odessać istniejące medium z płytki 100 mm, przemyć poprzez ostrożne dodanie 8 mL sterylnego PBS, odessać PBS i poddać komórki trypsynizacji, używając 3 mL 0,05% Trypsyny-EDTA; gdy komórki odkleją się od płytki, zablokować dalszą reakcję enzymatyczną, dodając 5 mL M10. Rozbić skupiska komórek i przenieść wymaganą objętość do sterylnej probówki stożkowej; wirować przy 200g przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Odessać nadsącz zawierający Trypsynę-EDTA, pozostawiając nienaruszony pellet komórek. Aby przenieść komórki do płytek 35 mm, dodać 1 mL M10 do każdej płytki i rozbić skupiska, aby zdysocjować komórki. Dodać 1 mL resuspenderowanych komórek do każdej płytki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2.
Rycina 1. Pokrycie szklanych szkiełek podstawowych 22 X 22 mm poli-D-lizyną i umieszczenie jednego szkiełka stroną pokrytą do góry w każdej płytce 35 mm.
Dzień 2: Transfekcja komórek HEK293T.
- Od 18 do 24 godzin po przesiewaniu komórki są gotowe do transfekcji receptora, który ma zostać poddany analizie. Należy użyć receptora oraz RTP1S sklonowanych w ssaczym wektorze ekspresyjnym pCI, przygotowanych z kultur bakteryjnych przy użyciu Qiagen Miniprep Kit zgodnie z protokołem opisanym wcześniej4. Należy zastosować receptory z etykietą epitopu rodopsyny o długości 20 aminokwasów na końcu N, aby ułatwić barwienie immunocytochemiczne.
- Do każdej transfekcji należy użyć 1000ng konstruktu receptora, 250 ng konstruktu RTP1S oraz 50 ng zielonego białka fluorescencyjnego. Transfekcję należy przeprowadzić przy użyciu Lipofectamine 2000, zgodnie z instrukcją producenta.
Dzień 3: Immunocytochemia w celu wizualizacji receptorów barwionych na powierzchni komórek.
- Przed rozpoczęciem przygotować roztwory do barwienia i płukania, a następnie schłodzić je do 4°C. Medium do barwienia: Minimum Essential Medium, 45 mL; Fetal Bovine Serum, 5 mL; HEPES (1M), 500 μL (stężenie końcowe 10mM); azotek sodu (1,5M), 500 μL (stężenie końcowe 15mM). Roztwór do płukania: HBSS, 500 mL; HEPES (1M), 5 mL (stężenie końcowe 10mM); azotek sodu (1,5M), 5 mL (stężenie końcowe 15mM). Oba roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C do ponownego użycia. Przygotować roztwory przeciwciał poprzez 100-krotne rozcieńczenie wymaganych przeciwciał w medium do barwienia.
- Immunochemię w celu barwienia receptorów węchowych na powierzchni rozpocząć około 24 godzin po transfekcji. Aby przeprowadzić barwienie żywych komórek, układ doświadczalny musi zostać schłodzony do 4°C: napełnić duży pojemnik lodem i wyrównać jego powierzchnię, położyć na lodzie tackę i spryskać ją 70% etanolem. Odciąć kawałek parafilmu (krótszy niż długość tacki) i przymocować go do spryskanej etanolem tacki, aby uzyskać gładką powierzchnię. Przenieść szklane zakrywki z transfektowanymi komórkami na parafiliim, pojedynczo, stroną z komórkami do góry, używając pęsety. Na każdą zakrywkę nałożyć 100 μL zimnego roztworu barwiącego pierwszorzędowego, ostrożnie dozując go od narożnika zakrywki (Rysunek 2). Po naniesieniu roztworu przeciwciał na wszystkie zakrywki, przykryć tackę, aby zapobiec wysychaniu roztworu w powietrzu. Inkubację pierwszorzędową prowadzić przez 45-60 minut.
- Po inkubacji pierwszorzędowej szybko przenieść zakrywki do oryginalnych naczyń hodowlanych 35 mm zawierających medium. Odessać medium i delikatnie dodać 2 mL schłodzonego roztworu do płukania od krawędzi naczynia, aby zapobiec utracie komórek z zakrywki. Odessać roztwór do płukania i powtórzyć czynność dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy płukania. Po trzecim płukaniu nie odsysać roztworu.
- Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych w medium do barwienia i przenieść zakrywki z roztworu do płukania na nową warstwę parafilmu na tej samej tacce. Ponownie delikatnie nanieść 100 μL roztworu przeciwciał na każdą zakrywkę, dozując od narożnika, podobnie jak podczas inkubacji pierwszorzędowej. Inkubację drugorzędową prowadzić przez 30-45 minut, a następnie przenieść zakrywki z powrotem do roztworu do płukania w oryginalnych naczyniach 35 mm. Ponownie wypłukać zakrywki trzy razy w opisany sposób.
- Odessać roztwór po ostatnim płukaniu i dodać 2 mL 1% schłodzonej paraformaldehydu. Utwierdzić komórki w schłodzonym 1% roztworze paraformaldehydu na lodzie przez 15 minut.
- Zamontować zakrywki na czystych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu medium montażowego Mowiol, stroną z komórkami do dołu, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza (Rysunek 3). Po wyschnięciu Mowiolu na powietrzu delikatnie opłukać zakrywki, dodając wodę destylowaną na powierzchnię i natychmiast ją odsysając.
Rysunek 2. Nałożyć na każdą zakrywkę 100 μL zimnego roztworu barwiącego pierwszorzędowego.
Rysunek 3. Zamontować zakrywki stroną z komórkami do dołu na czystych szklanych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu medium montażowego Mowiol.
2. Reprezentatywne wyniki:
Barwienie żywych komórek umożliwia wizualizację białek na powierzchni komórek podczas transfekcji receptorów wraz z białkami opiekuńczymi (w tym przypadku receptora węchowego Olfr62 wraz z białkiem transportującym receptor RTP1S) (Rysunek 4). Barwienie receptorów na powierzchni komórki charakteryzuje się punktowym wzorem barwienia (Rysunek 4B, wstawka). Barwienie przeprowadzone w niewłaściwy sposób może prowadzić do zwiększonego poziomu szumów, co utrudnia obserwatorowi odróżnienie rzeczywistego barwienia powierzchniowego od szumu.
Rysunek 4. Transfekcja receptorów wraz z białkami opiekuńczymi pozwala na wizualizację białek na powierzchni komórek przy użyciu barwienia żywych komórek. Transfekcja samego receptora węchowego Olfr62 (A) oraz transfekcja Olfr62 z białkiem opiekuńczym RTP1S (B). Poziomy ekspresji GFP służą jako kontrola transfekcji (A' i B').
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Każdy krok należy przeprowadzić starannie, aby zapewnić wyraźne i charakterystyczne barwienie powierzchniowe. Cały proces barwienia musi odbywać się w niskiej temperaturze (na lodzie), a tacka, na której układane są szkiełka nakrywkowe, musi zostać schłodzona przed użyciem, aby zapewnić przeżywalność komórek. Co więcej, fiksację przeprowadza się na koniec procesu barwienia powierzchniowego. Stanowi to wyraźny kontrast w stosunku do barwienia wewnętrznego, gdzie fiksacja poprzedza barwienie w celu permeabilizacji błony ko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Matsunami za krytyczną lekturę niniejszego manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kryszka 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Płodowa surowica bydlęca | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4655 | Z L-glutaminianem, solą Earle’s i wodorowęglanem |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyd | EMS | 19208 | |
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | Z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu |
| Bufor HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Bufor fosforanowo-solny (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Bez wapnia i magnezu |
| Hydrobromek poli-D-lizyny | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Azotek sodu | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Szkło hodowlane 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsyna-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
Bibliografia
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
