Artykuł metodologiczny

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

DOI:

10.3791/2413

⸱

22 grudnia 2010

 , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins Physical Sciences Oncology Center and Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z motylnym fenotypem komórek, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu/cytokiny oraz składniki macierzy pozakomórkowej (ECM) w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym ze składników zrębowych ECM, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilenie inwazji, wzrostu i angiogenezy1. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnałowe, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym rozprzestrzenianie przerzutów2-3. HA jest anionowym, niesiarczanowanym glikozaminoglikanem składającym się z powtarzających się jednostek kwasu D-glukuronowego i D-N-acetyloglukozaminy. Ze względu na obecność grup karboksylowych i hydroksylowych w powtarzających się jednostkach disacharydowych, natywny HA jest w dużej mierze hydrofilowy i podatny na modyfikacje chemiczne wprowadzające grupy siarczanowe w celu unieruchomienia fotoreaktywnego 4-5. Poprzednie badania dotyczące unieruchamiania HA na powierzchniach wykorzystywały bioodporne właściwości HA i jego pochodnej siarczanowanej do kontrolowania adhezji komórek do powierzchni6-7. W badaniach tych adhezja komórek zachodzi preferencyjnie w obszarach nieopatronowanych HA.

Aby przeanalizować interakcje komórkowe z egzogennym HA, opracowaliśmy wzorcowane powierzchnie funkcjonalizowane, które umożliwiają kontrolowane badanie i wysokorozdzielczą wizualizację interakcji komórek nowotworowych z HA. Wykorzystaliśmy mikrostemplowanie (uCP) do zdefiniowania dyskretnych obszarów wzorców HA na powierzchniach szklanych. Zastosowano metodę „kotwiczenia”, wykorzystującą chemię wiązań karbodiimidowych do unieruchomienia HA 8. Powierzchnie szklane poddano mikrostemplowaniu aminosilanem, a następnie poddano reakcji z roztworem HA o zoptymalizowanych proporcjach EDC i NHS, aby umożliwić unieruchomienie HA w wzorcowanych macierzach. Połączenie chemii karbodiimidowej z mCP pozwoliło na unieruchomienie HA w zdefiniowanych obszarach, tworząc powierzchnie odpowiednie do zastosowań in vitro. Zarówno komórki raka jelita grubego, jak i komórki raka piersi wchodziły w interakcje z mikro-wzorcowanymi powierzchniami HA. Adhezja komórek nowotworowych nastąpiła w ciągu 24 godzin, a proliferacja do 48 godzin. Wykorzystując mikro-wzorcowane powierzchnie HA, wykazaliśmy, że adhezja komórek nowotworowych odbywa się poprzez receptor HA CD44. Ponadto wzorcowane powierzchnie HA były kompatybilne ze skaningową mikroskopią elektronową (SEM) i pozwoliły na obrazowanie z wysoką rozdzielczością adhezyjnych wypustek oraz rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych na wzorcach HA, co umożliwiło analizę motylości komórek nowotworowych na egzogennym HA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Standardowa fotolitografia do wytwarzania stempli z mikrowzorami

  1. Przepłucz nowy wafle krzemowy etanolem i wysusz strumieniem powietrza. Używaj pęsety do manipulowania waflą, aby zapobiec powstaniu defektów powierzchniowych podczas całego procesu.
  2. Przenieś wafle do urządzenia do powlekania wirowego i pokryj powierzchnię wafla negatywowym fotorezystem SU-2025. Pokryj fotorezystem co najmniej 80% powierzchni wafla. Wykonaj powlekanie wirowe przez 10 sekund przy 600rpm, a następnie przez 30 sekund przy 3000rpm. Ze względu na światłoczułość fotorezystu, od tego momentu wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu.
  3. Przenieś pokryty fotorezystem wafle krzemowy na płytę grzejną w celu wykonania „soft-bake” w 95°C przez 3 minuty. Zdejmij z płyty grzejnej i pozostaw na 1 minutę do ostygnięcia.
  4. Umieść prefabrykowaną maskę z pożądanym wzorem na wierzchu pokrytego fotorezystem wafla krzemowego i poddaj naświetlaniu promieniowaniem ultrafioletowym (UV) (350-450 nm) przez 20 sekund.
  5. Przenieś wafle krzemowy na płytę grzejną w celu wykonania „hard-bake” w 110°C przez 6 minut.
  6. Włącz światła i zdejmij wafle z płyty grzejnej. Na tym etapie powinny być widoczne wyraźne wzory.
  7. Ostrożnie przepłucz wafle krzemowy wywoływaczem do fotorezystu SU-8. Po 3 płukaniach roztworem wywoływacza przepłucz etanolem. Jeśli obecne są jakiekolwiek białe osady, powtórz płukanie roztworem wywoływacza do fotorezystu lub po prostu zanurz wafle w roztworze wywoływacza na 2 minuty, a następnie ponownie wykonaj płukanie etanolem. Umyj wodą i wysusz powietrzem.
  8. Wymieszaj roztwór elastomeru polidimetylosiloksanowego (PDMS) oraz czynnik sieciujący w stosunku masowym 10:1. Odwiruj w wirówce przy 900rpm przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  9. Umieść wzorowany wafle w szalce Petriego i wlej PDMS na wafle krzemowy. W przypadku obecności pęcherzyków powietrza, umieść próbkę w eksykatorze i poddaj próżni przez kilka minut, aż pęcherzyki znikną.
  10. Utwardzaj przez noc w temperaturze pokojowej (RT), aby utworzyć komplementarną stempel elastomeryczną. Jeśli PDMS nie utwardził się całkowicie po 12 godzinach, umieść go w piekarniku w 60°C przez 30 minut.
  11. Ostrożnie oddziel PDMS od wafla krzemowego. Użyj ostrza żyletki, aby dociąć stempel do pożąnanego rozmiaru. Poddaj sonikacji w etanolu przez 15 minut. Wafla można wykorzystać wielokrotnie do tworzenia nowych stempli elastomerycznych.

2. Mikrowzorowanie HA

  1. Oczyść szkiełka przedmiotowe w plazmie przez 5 minut. Umieść wszystkie szkiełka w komorze i poddaj działaniu próżni przez 5 minut. Następnie wpuść do komory niewielki strumień tlenu. Włącz oczyszczacz plazmowy na 5 minut. Wyjmij szkiełka z oczyszczacza i za pomocą pęsety przełóż je do szalki Petriego.
  2. Podczas oczyszczania plazmowego poddaj stemple PDMS sonikacji w etanolu przez 15 minut.
  3. Przygotuj świeży 3% v/v roztwór 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) w 95% v/v etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Pozostaw do reakcji w RT przez 5 minut w celu utworzenia silanolu.
  4. Umieść stempel PDMS wzorem do góry na uchwycie spin coatera i pokryj wzorowaną powierzchnię roztworem APTMS. Wykonaj spincoating przy 3500rpm przez 30 sekund. Nie dotykaj powierzchni stempla, jedynie jego boków.
  5. Przenieś roztwór APTMS na oczyszczone plazmowo powierzchnie szklane: ustaw stempel stroną wzorowaną do dołu na jednym z końców i delikatnie przesuń, dociskając PDMS tak, aby przez 1 minutę był on w pełnym kontakcie z powierzchnią szkła.
  6. Ostrożnie zdejmij stempel PDMS i pozostaw wzorowane szkiełko do inkubacji w RT przez 30 minut. Przepłucz wzorowane powierzchnie etanolem i wysusz na powietrzu. Poddaj stempel PDMS sonikacji przez 15 minut, aby usunąć nadmiar APTMS.
  7. Wygrzej powierzchnie w piekarniku lub na płycie grzejnej przez 1 godzinę w 115°C. Przepłucz etanolem i wysusz na powietrzu.
  8. Przygotuj świeży roztwór silanu glikolu polietylenowego (PEG) zawierający 20% v/v 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane w toluenie. Będzie on służyć jako region nieadhezyjny otaczający wzory.
  9. Przenieś wzorowane szkiełko przedmiotowe do szklanej szalki Petriego i inkubuj w roztworze PEG-silane przez 45 minut w 75°C na płycie grzejnej. Przepłucz toluenem, wodą i wysusz na powietrzu.
  10. Sterylizuj przez 1 godzinę za pomocą bakteriobójczego promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
  11. Przygotuj sterylną wodną roztwór HA zawierający:
    10mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
    5mM N-hydroxysuccinimide
    50μg/ mL fluoresceiny-znakowanego HA
  12. Nanieś roztwór HA na wzorowane podłoża szklane w warunkach sterylnych i z osłoną przed światłem. Podłoża z wzorami nie powinny być niepokojone przez 16-24 godziny.
  13. Odsącz roztwór HA, przemyj solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i pokryj powierzchnię 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS na 1 godzinę. Powierzchnia jest teraz gotowa do hodowli komórkowej.

3. Hodowla komórkowa na mikrowzorowanych powierzchniach z HA

  1. Namnóż ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231 oraz komórki raka jelita grubego LS174T zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wysiej zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych z zagęszczeniem od 0,4 do 1x106 komórek nowotworowych na 18,75 cm2 szklanej powierzchni na powierzchnie z unieruchomionym HA. Inkubuj w wilgotnej inkubatorze (37 °C) w atmosferze z 5% CO2. Adhezja komórek powinna nastąpić w ciągu 24 godzin i może być obserwowana przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego.
  3. Powierzchnie z hodowlą komórkową można utrzymywać do 5 dni w standardowych warunkach inkubacji. Wymieniaj medium co drugi dzień. Morfologię i wzrost komórek można obserwować przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego. W celu analizy odpowiedzi na powierzchnię HA można zastosować dodatkowe testy komórkowe.

4. Reprezentatywne wyniki:

Chemia karbodiimidowa wykorzystana do kowalencyjnej immobilizacji HA na szkiełkach przedmiotowych z wzorem APTMS przedstawiona jest na Rysunku 1A. EDC jest czynnikiem sieciującym o zerowej długości, który reaguje z grupami karboksylowymi HA, tworząc reaktywne wobec amin pośredniki. Ponieważ pośrednik ten jest podatny na hydrolizę, dodaje się NHS w celu zwiększenia wydajności reakcji karbodiimidowej. W miarę oddziaływania roztworu HA z mikrowzorami APTMS, pomiędzy pośrednikiem HA a aminą pierwszorzędową APTMS tworzy się stabilne wiązanie amidowe. Przykład powierzchni z wzorem HA zwizualizowanej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego oraz analiza intensywności fluorescencji w programie ImageJ demonstrują wzorcowaną immobilizację HA (Rysunek 1B-C).

Powierzchnie z mikrowzorami HA umożliwiają badanie oddziaływań komórek nowotworowych z egzogennym HA. Zarówno linia komórkowa raka piersi człowieka MDA-MB-231, jak i linia komórkowa raka jelita grubego człowieka LS174t wykazują preferencyjne przyleganie do obszarów z mikrowzorami HA (Rycina 2). Do analizy oddziaływań hodowanych komórek z powierzchniami z unieruchomionym HA można wykorzystać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (Rycina 3).

figure-protocol-1
Rysunek 1 Powierzchnie z mikrowzorami z HA (A) Schemat opisujący opracowanie funkcjonalnych powierzchni z HA, (B) obraz fluorescencyjny powierzchni z mikrowzorami z HA znakowanej fluoresceiną (kolor zielony). (C) Trójwymiarowa mapa rozkładu pikseli sporządzona za pomocą oprogramowania ImageJ, przedstawiająca dyskretne wzory HA. Pasek skali = 100μm. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Adhezja komórek raka do powierzchni z HA wzorowanych w mikroskali. Zarówno rak jelita grubego (A), jak i rak piersi (B) preferencyjnie przyległy do obszarów z HA po 24 godzinach hodowli. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.

figure-protocol-3
Rycina 3. Interakcja komórek nowotworowych z HA. (A) Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego komórek raka jelita grubego (A) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej) oraz komórek raka piersi (B) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda mikrowzorowania HA umożliwia badanie oddziaływań komórek z egzogennym HA. Znane jest, że HA odgrywa kluczową rolę w progresji nowotworów 1, jednak liczba badań dotyczących oddziaływania komórek nowotworowych na dwuwymiarowych powierzchniach z wzorami HA była ograniczona. Kontrolowane badanie mikrowzorów egzogennego HA pozwala na wysokorozdzielczą wizualizację adhezji, wzrostu i migracji komórek nowotworowych i może pomóc w dalszym wyjaśnieniu podstaw mechanizmów nowotworowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat wideo powielony za zgodą; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za możliwość korzystania z laboratorium analizy powierzchni na Johns Hopkins, finansowanego w ramach Materials Research Science and Engineering Center przez National Science Foundation. LED jest stażystą IGERT oraz stypendystą National Science Foundation Graduate Fellow. Niniejsze badania były częściowo finansowane z grantu NIH U54CA143868.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
fotorezyst SU-2025MicroChem Corp.Y111069
wywoływacz SU-8MicroChem Corp.Y020100
Sylgard 184Dow Corning
3-aminopropyltrimetoksysilan (APTMS)Sigma-Aldrich281778
2- [metoksy(polietylenooksy) propyl] trimetoksysilan (Peg-silane)Gelest Inc.SIM6492.7
1-etylo-3- (3-dimetyloaminopropyl) karbodiimidThermo Fisher Scientific, Inc.22980
N-hydroksysuccynimid (NHS)Thermo Fisher Scientific, Inc.24500
kwas hialuronowy znakowany fluoresceiną (FL-HA)Sigma-AldrichF1177Rekonstytuować w 10ml wody DI
komórki raka piersi MDA-MB-231ATCCHTB-26
komórki raka jelita grubego LS174tATCCCl-188

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
  2. Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
  3. Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
  4. Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
  5. Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
  6. Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
  7. Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
  8. Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
  9. Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
  10. Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
  11. Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adhezja kom rek rakowychdrukowanie mikrokontaktowechemia karbodiimidowaskaningowa mikroskopia elektronowareceptor CD44immobilizacja HAanaliza ruchliwo ci kom rekmikro rodowisko guza

Powiązane artykuły