Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z motylnym fenotypem komórek, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu/cytokiny oraz składniki macierzy pozakomórkowej (ECM) w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym ze składników zrębowych ECM, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilenie inwazji, wzrostu i angiogenezy1. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnałowe, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym rozprzestrzenianie przerzutów2-3. HA jest anionowym, niesiarczanowanym glikozaminoglikanem składającym się z powtarzających się jednostek kwasu D-glukuronowego i D-N-acetyloglukozaminy. Ze względu na obecność grup karboksylowych i hydroksylowych w powtarzających się jednostkach disacharydowych, natywny HA jest w dużej mierze hydrofilowy i podatny na modyfikacje chemiczne wprowadzające grupy siarczanowe w celu unieruchomienia fotoreaktywnego 4-5. Poprzednie badania dotyczące unieruchamiania HA na powierzchniach wykorzystywały bioodporne właściwości HA i jego pochodnej siarczanowanej do kontrolowania adhezji komórek do powierzchni6-7. W badaniach tych adhezja komórek zachodzi preferencyjnie w obszarach nieopatronowanych HA.
Aby przeanalizować interakcje komórkowe z egzogennym HA, opracowaliśmy wzorcowane powierzchnie funkcjonalizowane, które umożliwiają kontrolowane badanie i wysokorozdzielczą wizualizację interakcji komórek nowotworowych z HA. Wykorzystaliśmy mikrostemplowanie (uCP) do zdefiniowania dyskretnych obszarów wzorców HA na powierzchniach szklanych. Zastosowano metodę „kotwiczenia”, wykorzystującą chemię wiązań karbodiimidowych do unieruchomienia HA 8. Powierzchnie szklane poddano mikrostemplowaniu aminosilanem, a następnie poddano reakcji z roztworem HA o zoptymalizowanych proporcjach EDC i NHS, aby umożliwić unieruchomienie HA w wzorcowanych macierzach. Połączenie chemii karbodiimidowej z mCP pozwoliło na unieruchomienie HA w zdefiniowanych obszarach, tworząc powierzchnie odpowiednie do zastosowań in vitro. Zarówno komórki raka jelita grubego, jak i komórki raka piersi wchodziły w interakcje z mikro-wzorcowanymi powierzchniami HA. Adhezja komórek nowotworowych nastąpiła w ciągu 24 godzin, a proliferacja do 48 godzin. Wykorzystując mikro-wzorcowane powierzchnie HA, wykazaliśmy, że adhezja komórek nowotworowych odbywa się poprzez receptor HA CD44. Ponadto wzorcowane powierzchnie HA były kompatybilne ze skaningową mikroskopią elektronową (SEM) i pozwoliły na obrazowanie z wysoką rozdzielczością adhezyjnych wypustek oraz rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych na wzorcach HA, co umożliwiło analizę motylości komórek nowotworowych na egzogennym HA.
Protokół
1. Standardowa fotolitografia do produkcji stempli z mikrowzorami
- Przepłucz nowy wafelek krzemowy etanolem i wysusz strumieniem powietrza. Przez cały proces używaj pęsety do manipulowania wafelkiem, aby zapobiec powstaniu defektów powierzchniowych.
- Przenieś wafelek do powlekarki rotacyjnej i pokryj jego powierzchnię negatywowym fotorezystem SU-2025. Pokryj fotorezystem co najmniej 80% powierzchni wafelka. Wykonaj powlekanie rotacyjne przez 10 sekund przy 600rpm, a następnie przez 30 sekund przy 3000rpm. Ze względu na światłoczułość fotorezystu, od tego momentu wyłącz światła w pomieszczeniu.
- Przenieś pokryty fotorezystem wafelek krzemowy na płytkę grzejną w celu przeprowadzenia „wygrzewania wstępnego” (soft-bake) w temperaturze 95°C przez 3 minuty. Zdejmij z płytki grzejnej i odstaw na 1 minutę do ostygnięcia.
- Umieść wcześniej wykonaną maskę z pożądanym wzorem na powierzchni pokrytego fotorezystem wafelka krzemowego i naświetlaj promieniowaniem ultrafioletowym (UV) (350-450 nm) przez 20 sekund.
- Przenieś wafelek krzemowy na płytkę grzejną w celu przeprowadzenia „wygrzewania końcowego” (hard-bake) w temperaturze 110°C przez 6 minut.
- Włącz światła i zdejmij wafelek z płytki grzejnej. Na tym etapie powinny być widoczne wyraźne wzory.
- Ostrożnie przepłucz wafelek krzemowy wywoływaczem do fotorezystu SU-8. Po trzykrotnym przepłukaniu roztworem wywoływacza, przepłucz etanolem. W przypadku wystąpienia białych osadów powtórz płukanie roztworem wywoływacza lub zanurz wafelek w roztworze wywoływacza na 2 minuty, a następnie ponownie przepłucz etanolem. Umyj wodą i wysusz powietrzem.
- Wymieszaj roztwór elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1. Wirowarkuj przy 900rpm przez 5 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Umieść wzorowany wafelek w szalce Petriego i wlej PDMS na wafelek krzemowy. Jeśli obecne są pęcherzyki, umieść próbkę w eksykatorze i poddaj działaniu próżni przez kilka minut, aż pęcherzyki znikną.
- Utwardzaj przez noc w temperaturze pokojowej (RT), aby utworzyć komplementarną stempel elastomerowy. Jeśli PDMS nie utwardził się całkowicie po 12 godzinach, umieść go w piekarniku w temperaturze 60°C na 30 minut.
- Ostrożnie oddziel PDMS od wafelka krzemowego. Użyj ostrza żyletki, aby dociąć stempel do pożądanego rozmiaru. Sonicuj w etanolu przez 15 minut. Wafelki można wykorzystywać wielokrotnie do tworzenia nowych stempli elastomerowych.
2. Mikrowzorcowanie HA
- Oczyść szkiełka szklane w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez 5 minut. Umieść wszystkie szkiełka w komorze i poddaj próżni przez 5 minut. Następnie wpuść do komory niewielki strumień tlenu. Włącz urządzenie do czyszczenia plazmowego na 5 minut. Wyjmij szkiełka z urządzenia i za pomocą pęsety umieść je w szalce Petriego.
- Podczas czyszczenia plazmowego poddaj stemple PDMS sonikacji w etanolu przez 15 minut.
- Przygotuj świeży 3% v/v roztwór 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) w 95% v/v etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Pozostaw do reakcji przez 5 minut w RT w celu utworzenia silanoli.
- Umieść stempel PDMS wzorem do góry na uchwycie wirówki i pokryj powierzchnię z wzorem roztworem APTMS. Wykonaj spincoating przy 3500rpm przez 30 sekund. Nie dotykaj powierzchni stempla, jedynie jego boków.
- Przenieś roztwór APTMS na oczyszczone plazmowo powierzchnie szklane: ustaw stempel stroną z wzorem do dołu na jednym końcu i delikatnie przesuń, dociskając PDMS tak, aby był w pełnym kontakcie z powierzchnią szkła przez 1 minutę.
- Delikatnie zdejmij stempel PDMS i pozostaw szkiełko szklane z wzorem do inkubacji w RT przez 30 minut. Przepłucz powierzchnie z wzorem etanolem i wysusz na powietrzu. Poddaj stempel PDMS sonikacji przez 15 minut, aby usunąć nadmiar APTMS.
- Ogrzewaj powierzchnie w piekarniku lub na płycie grzejnej przez 1 godzinę w 115°C. Przepłucz etanolem i wysusz na powietrzu.
- Przygotuj świeży roztwór PEG-silanu składający się z 20% v/v 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane w toluenie. Będzie on służył jako region nieadhezyjny otaczający wzory.
- Przenieś szkiełko szklane z wzorem do szklanej szalki Petriego i inkubuj w roztworze PEG-silanu przez 45 minut w 75°C na płycie grzejnej. Przepłucz toluenem, wodą i wysusz na powietrzu.
- Sterylizuj przez 1 godzinę za pomocą bakteriobójczego promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zachowania sterylności.
- Przygotuj sterylną wodną roztwór HA:
10mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
5mM N-hydroxysuccinimide
50μg/ mL HA znakowanego fluoresceiną - Nanieś roztwór HA na wzorowane podłoża szklane w warunkach sterylnych i z osłonięciem od światła. Wzorowane podłoża powinny pozostać niezakłócone przez 16-24 godziny.
- Odsajuj roztwór HA, przemyj solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i pokryj powierzchnię 1% albuminą wołową (BSA) w PBS na 1 godzinę. Powierzchnia jest teraz gotowa do hodowli komórkowej.
3. Hodowla komórek na mikrowzorowanych powierzchniach z HA
- Namnożyć komórki raka piersi człowieka MDA-MB-231 oraz komórki raka jelita grubego LS174T zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wysiać zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych w zagęszczeniu od 0,4 do 1x106 komórek na 18,75 cm2 szklanej powierzchni na powierzchnie z unieruchomionym HA. Inkubować w wilgotnym inkubatorze (37 °C) w atmosferze z 5% CO2. Adhezja komórek powinna nastąpić w ciągu 24 godzin i może być obserwowana za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.
- Kultury komórkowe na powierzchniach można utrzymywać do 5 dni w standardowych warunkach inkubacji. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Morfologię i wzrost komórek można obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. Do analizy odpowiedzi na powierzchnię HA można zastosować dodatkowe testy komórkowe.
4. Reprezentatywne wyniki:
Chemia karbodiimidowa wykorzystana do kowalencyjnego unieruchomienia HA na szklanych płytkach wzorowanych APTMS została przedstawiona na Ryc. 1A. EDC jest czynnikiem sieciującym o zerowej długości, który reaguje z grupami karboksylowymi HA, tworząc reaktywne względem amin pośredniki. Ponieważ pośrednik ten jest podatny na hydrolizę, dodaje się NHS w celu zwiększenia wydajności reakcji karbodiimidowej. W wyniku oddziaływania roztworu HA z mikrowzorami APTMS powstaje stabilne wiązanie amidowe między pośrednikiem HA a aminą pierwszorzędową APTMS. Przykład powierzchni wzorowanej HA zwizualizowanej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego oraz analiza natężenia fluorescencji w programie ImageJ demonstrują wzorowane unieruchomienie HA (Ryc. 1B-C).
Powierzchnie z mikrowzorami HA umożliwiają badanie interakcji komórek nowotworowych z egzogennym HA. Zarówno ludzka linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231, jak i ludzka linia komórkowa raka jelita grubego LS174t wykazują preferencyjne przyleganie do obszarów z mikrowzorami HA (Rysunek 2). Do analizy interakcji hodowlanych komórek z powierzchniami z immobilizowanym HA można wykorzystać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (Rysunek 3).
Rycina 1 Powierzchnie z mikrowzorami HA (A) Schemat opisujący opracowanie funkcjonalnych powierzchni HA, (B) obraz fluorescencyjny powierzchni z mikrowzorami HA znakowanej fluoresceiną (zielony). (C) Mapa rozkładu pikseli 3D wykonana w oprogramowaniu ImageJ, demonstrująca dyskretne wzory HA. Pasek skali = 100μm. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Rycina 2. Adhezja komórek nowotworowych na mikrowzorowanych powierzchniach HA. Zarówno rak jelita grubego (A), jak i piersi (B) preferencyjnie przylegały do łat HA po 24 godzinach hodowli. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Rysunek 3. Interakcja komórek nowotworowych z HA. (A) Obrazy z skaningowej mikroskopii elektronowej komórek raka jelita grubego (A) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej) oraz komórek raka piersi (B) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona metoda mikrowzorowania HA umożliwia badanie oddziaływań komórek z egzogennym HA. Znane jest, że HA odgrywa kluczową rolę w progresji nowotworów 1, jednak liczba badań dotyczących oddziaływania komórek nowotworowych na dwuwymiarowych powierzchniach z wzorami HA była ograniczona. Kontrolowane badanie mikrowzorów egzogennego HA pozwala na wysokorozdzielczą wizualizację adhezji, wzrostu i migracji komórek nowotworowych i może pomóc w dalszym wyjaśnieniu podstaw mechanizmów nowotworowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Schemat wideo powielony za zgodą; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].
Podziękowania
Autorzy dziękują za możliwość korzystania z laboratorium analizy powierzchni na Johns Hopkins, finansowanego w ramach Materials Research Science and Engineering Center przez National Science Foundation. LED jest stażystą IGERT oraz stypendystą National Science Foundation Graduate Fellow. Niniejsze badania były częściowo finansowane z grantu NIH U54CA143868.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| fotorezyst SU-2025 | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| wywoływacz SU-8 | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimetoksysilan (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [metoksy(polietylenooksy) propyl] trimetoksysilan (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-etylo-3- (3-dimetyloaminopropyl) karbodiimid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroksysuccynimid (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| kwas hialuronowy znakowany fluoresceiną (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Rekonstytuować w 10ml wody DI |
| komórki raka piersi MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| komórki raka jelita grubego LS174t | ATCC | Cl-188 |
Bibliografia
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
