Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Podsumowanie

Powszechnie wiadomo, że siły mechaniczne w organizmie mogą wpływać na różnicowanie i proliferację komórek. Przedstawiamy protokół wideo demonstrujący zastosowanie bioreaktora zbudowanego na zamówienie do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek macierzystych hodowanych na elastycznych podłożach z mikrowzorami.

Streszczenie

Rola sił mechanicznych w rozwoju i utrzymaniu tkanek biologicznych jest dobrze udokumentowana, w tym w przypadku kilku zjawisk regulowanych mechanicznie, takich jak przebudowa kości, hipertrofia mięśni oraz plastyczność komórek mięśni gładkich. Jednak siły zaangażowane w te procesy są często niezwykle złożone i trudne do monitorowania oraz kontrolowania in vivo. Aby lepiej zbadać wpływ sił mechanicznych na komórki, opracowaliśmy metodę in vitro do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek adherentnych hodowanych na elastycznych membranach. Metoda ta wykorzystuje bioreaktor o specjalnej konstrukcji z zmotoryzowanym systemem krzywka-wirnik do przyłożenia pożądanej siły. Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół wideo demonstrujący sposób montażu poszczególnych komponentów każdej „komory rozciągania”, w tym w tym przypadku silikonowej membrany z mikrowzorowaną topografią w celu zorientowania komórek zgodnie z kierunkiem odkształcenia. Opisujemy również procedury sterylizacji komór, wysiewania komórek na membranę, mocowania komory w bioreaktorze oraz regulacji parametrów mechanicznych (tj. wartości i szybkości odkształcenia). Procedury przedstawione w tym konkretnym protokole są specyficzne dla wysiewania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na membrany silikonowe z kanałami o szerokości 10 µm zorientowanymi równolegle do kierunku odkształcenia. Jednak metody i materiały zaprezentowane w tym systemie są na tyle elastyczne, że pozwalają na wprowadzenie wielu modyfikacji: szybkość, wartość i czas trwania odkształcenia, typ komórek, topografia membrany, powłoka membrany itp. mogą zostać dostosowane do pożądanej aplikacji lub celu. Jest to solidna metoda badania wpływu jednowymiarowego odkształcenia rozciągającego przykładanego do komórek in vitro.

Protokół

Dzień 0 – Sterylizacja przed dniem eksperymentu

1. Umieścić materiały w plastikowym pojemniku i sterylizować 70% alkoholem przez 2 godziny:
   • Komory
   • Pokrywy
   • Ramki (wszystkie 3 elementy)
   • Śruby
   • Uszczelki gumowe
   • Pincety
   • Nożyczki
   • Klucze imbusowe
2. Oczyścić membrany mydłem Aquet i wodą destylowaną.
3. Poddać membrany sonikacji w 70% alkoholu przez 10 minut.
4. Umieścić czyste membrany w plastikowych kwadratowych naczyniach. W przypadku stosowania membran wzorcowanych należy upewnić się, że strona wzorcowana jest skierowana do góry (rozpylić alkohol na jedną stronę membrany i obserwować, czy ciecz spływa wzdłuż rowków).
5. Pozostawić membrany zanurzone w 70% alkoholu na 2 godziny.
6. Zapakować rękawiczki w folię aluminiową w celu autoklawowania jutro rano.
7. Przygotować 2% (masa/objętość) roztwór żelatyny (2g/100mL) w wodzie destylowanej do autoklawowania jutro.
8. Po 2-godzinnej sterylizacji w 70% alkoholu umieścić wszystkie materiały polimerowe oraz membrany (materiały nieautoklawowalne) w komorze z dyfuzorem UV na całą noc:
   • Komory
   • Pokrywy
   • Ramki (wszystkie 3 elementy)
   • Membrany
9. Zapakować pozostałe materiały do worka do autoklawowania:
   • Śruby
   • Uszczelki gumowe
   • Pincety
   • Nożyczki
   • Klucze imbusowe

Dzień 1 - Montaż komór rozciągania

1. Autoklawować pęsetę, nożyczki, klucze imbusowe, śruby, uszczelki, rękawiczki oraz żelatynę w małym autoklawie w temperaturze 240°F przez łącznie 20 minut
2. Wyjąć membrany z lampy UV i poddać działaniu plazmy O₂ (stroną z wzorem do góry) przez około 1 minutę.
3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza pokryć obszar z wzorem na membranach traktowanych plazmą żelatyną. Naświetlać promieniami UV przez 30 minut.
4. Przemyć każdą membranę dwa razy roztworem PBS. Po  drugim przemyciu pozostawić na membranach niewielką ilość PBS, aby pozostały śliskie, co ułatwi montaż w komorach. (Tego samego PBS należy użyć do nasmarowania uszczelek w celu ułatwienia montażu).
5. Zmontować membrany w komorach (podczas montażu używać autoklawowanych rękawiczek)
   1. Połączyć dwa główne elementy ramy za pomocą jednej śruby.
   2. Odwrócić  ramę i położyć na niej membranę tak, aby strona pokryta żelatyną była skierowana w stronę ramy (obszar z wzorem powinien znajdować się w centrum).
   3. Przymocować membranę do ramy za pomocą uszczelki z każdej strony.
   4. Docisnąć uszczelki, stosując delikatny, równomierny nacisk, aby nie przerwać membrany.
6. Przymocować zmontowaną ramę do poprzeczki w kształcie litery T.
7. Odwrócić ramę i włożyć ją do komory do góry dnem. Naświetlać promieniami UV tylną stronę ramy i membrany przez 30 minut
8. Ponownie odwrócić ramę i przykręcić do komory (brak zmian dla komory kontrolnej, ale dla komory rozciągającej należy użyć dwóch śrub do przymocowania końcowego elementu ramy do dna komory oraz wykręcić pojedynczą śrubę łączącą dwa elementy ramy). Naświetlać promieniami UV stronę przednią przez 30 min. Przed przejściem do następnego kroku upewnić się, że membrany są CAŁKOWICIE suche, w przeciwnym razie zawiesina komórek może spłynąć podczas wysiewania.
9. Wysiać komórki. Powierzchnia 1 płytki = powierzchnia 3 membran, zatem na jedną membranę należy użyć 1/3 konfluentnej płytki. Użyć 1 mL zawiesiny komórek na membranę. Przy ilości większej niż 1,5 mL trudno będzie utrzymać roztwór na powierzchni. Nanieść zawiesinę komórek wyłącznie na obszar z wzorem i za pomocą końcówki pipety rozprowadzić roztwór. Przykryć komory i pozostawić komórki do przytwierdzenia na 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
10. Przenieść komory do inkubatora i pozostawić komórki do przytwierdzenia przez kolejną godzinę. Zachować SZCZEGÓLNĄ ostrożność podczas przenoszenia komór, aby nie dopuścić do spłynięcia zawiesiny komórek! Jeśli roztwór spłynie na tym etapie, komórki w danej komorze zostaną zniszczone.
11. Przenieść komorę do komory z laminarnym przepływem powietrza i dodać 20 mL pożywki.
12. Umieścić komory w oczyszczonej alkoholem kuwecie przykrytej folią aluminiową (również spryskaną alkoholem). Przenieść komory do inkubatora do rozciągania (10% CO₂).
13. Zamocować komory w maszynie do rozciągania. Pozostawić komórki do dalszego przytwierdzenia przez noc i rozpocząć rozciąganie następnego dnia. (Uwaga: podczas wkładania komór do maszyny do rozciągania należy pamiętać o zablokowaniu maszyny w pozycji „zero” przed umieszczeniem komór, a następnie zaciśnięciu gumki wokół kół zębatych. Nie zapomnieć o odblokowaniu kół zębatych przed uruchomieniem maszyny).

Dyskusja

Banes i współpracownicy po raz pierwszy opisali zastosowanie systemu do mechanicznej stymulacji komórek in vitro, wykorzystując elastyczny podłoże elastomerowe do przekazywania siły mechanicznej na komórki¹. Od tego czasu opracowano i wykorzystano wiele modyfikacji tej konstrukcji. Kilka systemów rozciągania mechanicznego jest dostępnych komercyjnie pod nazwą „Flexercell” (Flexcell International Corp.), podczas gdy niektóre laboratoria korzystają z urządzeń budowanych na specjalne zamówienie. W niniejszym prot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fungizone	Odczynnik	Lonza Inc.	17-836R	alikwot 250 ug/mL, 100x, przechowywany w -20C.
Kanamycyna	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15160-054	stężenie końcowe 50 ug/mL. Roztwór zapasowy przechowywać w stężeniu 10 mg/ml w -20C.
Gentamycyna	Odczynnik	Lonza Inc.	17-518Z	stężenie końcowe 50 ug/mL. Roztwory zapasowe 1000x przechowywać w stężeniu 50 mg/mL w -20C.
Pen/Strep	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122	stężenie końcowe 1%. (Dostępne również od innych dostawców)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	11966-025
Uwagi dotyczące pożywek: Te eksperymenty z rozciąganiem jednowymiarowym są podatne na kontaminację ze względu na złożoność konfiguracji bioreaktora. Aby temu przeciwdziałać, przetestowano różne kombinacje antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych. Zazwyczaj niezbędne jest zastosowanie 1% fungizone wraz z kombinacją antybiotyków. Należy stosować albo kombinację Pen/Strep, ALBO kombinację kanamycyny i gentamycyny (NIE należy jednak stosować kombinacji/koktajlu trzech lub więcej antybiotyków jednocześnie, ponieważ może to prowadzić do powstania opornych szczepów bakterii i może być szkodliwe dla komórek).