Obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza piersi w modelu mysim płci żeńskiej

Streszczenie

Źródło:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Instytut Nauk Biologicznych, Uniwersytet w Brasílii, ²Zakład Podstawowych Procesów Psychologicznych, Instytut Psychologii, Uniwersytet w Brasílii

Ten film przedstawia procedurę śledzenia progresji guza in vivo poprzez wstrzyknięcie komórek gruczolakoraka piersi wykazujących ekspresję lucyferazy samicy myszy i monitorowanie sygnałów bioluminescencyjnych w celu oceny wzrostu guza pierwotnego i przerzutowego w czasie

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Hodowla komórkowa

1. Utrzymuj linię komórkową 4T1 (ATCC-CRL-2539), mysią komórkę gruczolakoraka piersi, w hodowli z pożywką DMEM (zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (v:v), penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 U/ml), w temperaturze 37 °C i w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%_CO2.
2. Transfekcja oryginalnej linii komórkowej za pomocą genu Luc2, który wyraża lucyferazę. Ten enzym bioluminescencyjny jest wytwarzany konstytutywnie.

2. Model zwierzęcy - Przeszczep komórek nowotworowych

1. Podskórnie zaszczepić bioluminescencyjne komórki 4T1 wykazujące ekspresję lucyferazy (2 × 10⁵ komórek na mysz) do lewego grzbietu samic myszy Balb / c w znieczuleniu (ketamina i ksylazyna odpowiednio w dawce 80 mg / kg i 10 mg / kg).
   1. W przypadku tej procedury należy znieczulić mysz przed eksperymentem, stosując dootrzewnowe wstrzyknięcie określonych środków znieczulających (ketaminy i ksylazyny odpowiednio w dawce 80 i 10 mg/kg).
   2. Po 5 minutach indukcji znieczulenia ogol mysz i wstrzyknij komórki podskórnie za pomocą strzykawek insulinowych o pojemności 1 ml.
      UWAGA: W sumie pięć 8-tygodniowych myszy, ważących około 25 g każda, wykorzystano do indukcji guza i obrazowania.
2. Aby określić ilościowo wzrost guza in vivo, oceń mysz z guzem za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, monitorując wzrost guza przez 4 tygodnie.
   1. W przypadku eksperymentów bioobrazowych znieczulij mysz izofluranem (2,5% rozcieńczonym w oczyszczonym sprężonym powietrzu). Aby ocenić postęp guza, obrazuj mysz raz w tygodniu przez 4 tygodnie za pomocą sprzętu, który mierzy sygnały bioluminescencyjne.
      NUTA: Sygnał bioluminescencyjny lucyferazy 4T1-luc został wykorzystany jako parametr do oceny wzrostu i wskazania progresji guza.
3. Podczas procesu obrazowania ustaw mysz w pozycji grzbietowej leżącej w wyznaczonym obszarze urządzenia, aby uchwycić obrazy bioluminescencyjne.
4. Po znieczuleniu wstrzyknąć myszu D-lucyferynę (100 μl; 15 mg/ml) dootrzewnowo.
   NUTA: Ponieważ D-lucyferyna jest substratem dla enzymu lucyferazy, który po rozszczepieniu wytwarza fotony światła, a komórki lucyferazy bioluminescencyjnej 4T1 wyrażają ten enzym konstytutywnie, określają ilościowo i wykrywają guz u żywych zwierząt.
5. Aby wykryć sygnały, wykonaj 20 obrazów bioluminescencyjnych w ciągu 20 minut dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie końcowym. Każdy z tych obrazów reprezentuje sygnał bioluminescencyjny emitowany w okresie 60 sekund.
6. Skonstruuj krzywą kinetyki bioluminescencji reprezentującą sygnał emitowany co minutę. Aby zapewnić optymalne wyniki dla każdego zwierzęcia, należy zarejestrować maksymalną emisję bioluminescencyjną dla każdego punktu końcowego.
7. Do przechwytywania obrazu bioluminescencyjnego należy użyć następujących parametrów: otwarty filtr emisyjny, bez wzbudzenia, binning 8, f/stop 2 i pole widzenia typu D. Aby wygenerować krzywą wzrostu, obrazuj zwierzęta raz w tygodniu przez łącznie 4 tygodnie.
8. Obrazowanie bioluminescencyjne - guz pierwotny i przerzuty do płuc.
   1. Aby odróżnić sygnały guza pierwotnego od przerzutów do płuc, zdefiniuj określone obszary zainteresowania za pomocą oprogramowania sprzętu.
   2. Zidentyfikuj sygnały bioluminescencyjne w miejscu wstrzyknięcia i okolicy klatki piersiowej, w której komórki dały przerzuty. Na podstawie tych obrazów oblicz progresję sygnału bioluminescencyjnego, który silnie koreluje z progresją guza.
   3. Dzięki obrazom zbieranym przez kilka tygodni stwórz profil kinetyki wzrostu dla różnych miejsc guza, w tym guza pierwotnego i zmian przerzutowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-lucyferyna	Perkin Elmer	122799	Odczynnik chemiczny
Zmodyfikowane médium orła firmy Dulbecos	Gibko powiedział:	A7030 (wersja angielska)	Pożywki do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca płodu	Merck	F2442 powiedział:	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Izofluran	Cristália (krystalia)	NIE	Znieczulające
IVIS Lumina	XR	Seria III	Sprzęt – USA
Penicylina	Merck	Zobacz materiał P4333 powiedział:	Antybiotyk do hodowli komórkowych
Falloidyna-Alexa Fluor 488	Termo Fischer	A12379	Odczynnik chemiczny
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	Merck	4437568	Odczynnik chemiczny
Streptomycyny	Merck	Zobacz materiał P4333 powiedział:	Antybiotyk do hodowli komórkowych