Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Podsumowanie

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji metodą patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków.

Streszczenie

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków. Rejestracje elektryczne z zakończenia presynaptycznego umożliwiają pomiar potencjałów czynnościowych, prądów kanałów wapniowych, fuzji pęcherzyków (egzocytozy) oraz następującego po niej pobierania błony (endocytozy). Fuzja pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik powoduje włączenie błony pęcherzykowej do błony komórkowej kielicha. Ten wzrost ilości błony komórkowej jest mierzony jako wzrost pojemności elektrycznej. Następcza redukcja pojemności wskazuje na endocytozę, czyli proces pobierania lub usuwania błony z błony kielicha. Endocytoza jest niezbędna do utrzymania struktury kielicha, a także do tworzenia pęcherzyków, które zostaną wypełnione neuroprzekaźnikiem na potrzeby przyszłych zdarzeń egzocytatywnych. Rejestracje pojemności w kielichu Held umożliwiły bezpośredni i szybki pomiar uwalniania pęcherzyków oraz następującej po nim endocytozy w zakończeniu nerwowym OUN ssaków. Dodatkowo, odpowiadającą temu aktywność postsynaptyczną można mierzyć jednocześnie, stosując rejestracje parzyste. Dzięki temu, wykorzystując ten preparat, możliwe jest uzyskanie pełnego obrazu aktywności elektrycznej presynaptycznej i postsynaptycznej w synapsie ośrodkowego układu nerwowego. W niniejszym materiale przedstawiono metody przygotowania skrawka, cechy morfologiczne służące do identyfikacji kielichów Held, podstawowe techniki patch clamp oraz przykłady rejestracji pojemności w celu pomiaru egzocytozy i endocytozy.

Protokół

Konfiguracja Patch Clamp:

Optyka: Układ optyczny jest bardzo ważny dla znalezienia odpowiedniej komórki oraz ustalenia jej położenia.

Należy uzyskać wyraźny obraz komórek: z ostrymi krawędziami i miękkim wyglądem komórki.

Przeskanuj całe pole widzenia w poszukiwaniu odpowiednich komórek głównych MNTB z przytwierdzonym kielichem. Obracaj szalkę, aby oglądać kielichy pod różnymi kątami. Na początku można ćwiczyć na zakończeniu o kształcie balonika.

Wybierz komórkę na powierzchni skrawka lub w 2^nd warstwie komórkowej. Za pomocą pipety nakieruj się na pierwszą 1/3^rd komórki

Identyfikacja kielichów: Należy szukać podwójnej błony (patrz Rysunek 1) i obracać naczynie z przekrojem, aby obejrzeć ją pod różnymi kątami, co pomoże potwierdzić, że jest to kielich.

Rycina 1

 

Głębokość kielicha: Kielich powinien znajdować się na powierzchni lub jak najbliżej powierzchni.

Powierzchnia dostępna do patchowania: Użyj pokrętła mikrometrycznego mikroskopu, aby określić „szerokość/głębokość” kielicha. Na przykład ~10% pełnego obrotu pokrętła mikrometrycznego zapewni wystarczająco dużą powierzchnię do przeprowadzenia patchowania.

Uszczelnienie na komórce presynaptycznej: Aby uzyskać konfigurację cell attached, należy szukać „małej” deformacji na powierzchni komórki spowodowanej dodatnim ciśnieniem (~0.15psi) w pipecie; należy użyć manipulatora, aby przesuwać pipetę w górę, w dół i w poprzek, a nawet w głąb powierzchni terminala presynaptycznego, aby uzyskać wyraźną deformację, a następnie zwolnić ciśnienie i w razie potrzeby zastosować ssanie.

PULSE, program do akwizycji danych:

Przed pierwszym użyciem oraz za każdym razem, gdy wymaga tego pojemność próbkowania, należy zwiększyć objętość buforu.

Konieczność ładowania zmodyfikowanych makr przy każdym uruchomieniu.

Potencjał złącza cieczowego: roztwór do rejestracji Presyn wynosi -11mV (minus 11mV).

Presyn: Cslow=~15 pF

Kompensacja Rs dla presyn: 10 μsec, 65 % (możliwa jest większa kompensacja bez oscylacji)

Przed pomiarem pojemności: Przebadaj relaksację prądu (skok 10 mV, 10 msec), aby sprawdzić, czy relaksacja jest monoeksponencjalna, tzn. czy człon presynaptyczny można modelować za pomocą pojedynczej komory.

Filtry: Ustawione na 30 kHz i 10 kHz (odpowiednio filtr Bessela 1 i 2) podczas pomiaru relaksacji, aby upewnić się, że szybka składowa nie zostanie pominięta.

Podczas rejestracji mini, Xinsheng używał 10 kHz i 5 kHz. LGW poprosił mnie o użycie wyłącznie zestawu filtra 1 ustawionego na 30 kHz, aby upewnić się, że możemy zmierzyć czas narastania mini.

Nazewnictwo plików: 7 cyfr 000mmxx, gdzie mm oznacza miesiąc (lub miesiąc i rok), a xx numer komórki.

Czyszczenie linii z roztworami: Linie czyszczone pod koniec eksperymentu 20 ml 0.1 M HCl, a następnie 200 ml ddH2O.

Roztwory zewnętrzne są recyrkulowane, prędkość pompy wynosi 20-30 rpm.  

(roztwór powracający z komory kąpieli spływa z powrotem do cylindra miarowego).

Przygotuj 3 linie odpływowe, aby zapewnić wystarczające ssanie.

Pipetuj roztwór do rejestracji presynaptycznej: ~310 milli Osmolar

Roztwór Presyn powinien mieć osmolalność ~310 mOsm, aby zapobiec wzrostowi R-access podczas eksperymentu.

Roztwór do pipety presynaptycznej różni się od roztworu do pipety postsynaptycznej (np. roztwór presynaptyczny zawiera ATP i GTP).

Roztwór TTX-TEA (do izolacji prądów Ca):

• Należy dążyć do aplikacji po uszczelnieniu, a nawet utworzeniu kontaktu typu patch z komórką, ponieważ TEA w roztworze blokuje kanały potasowe i depolaryzuje komórkę. Jest to niekorzystne dla komórki. Z tego samego powodu ponowne wykorzystanie skrawka po zastosowaniu TTX może być niemożliwe.
• Należy porównać pierwszą i ostatnią odpowiedź komórki lub skrawka, aby sprawdzić, czy wystąpił efekt przedłużonej depolaryzacji.
• Stosuje się TTX w stężeniu 1 μM zamiast 0,5 μM, aby efekt wystąpił szybciej. Dzięki temu czas oczekiwania po zmianie roztworów jest krótszy.

Wycinanie plastrów

Ustawienia mikrotomu wibracyjnego:

• Wibracje boczne 70Hz
• Amplituda: 1.0 mm
• Prędkość posuwu 0.01-0.02 mm/sec podczas wycinania plastrów z kielichem, 0.1 w pozostałych przypadkach; grubość: 180 μm (~150 μm u starszych zwierząt)

Przecięcia inkubuje się w temperaturze 37ºC przez 1 godzinę (wliczając czas krojenia), t.j. pozostawia się je w kąpieli przez 15-20 minut po zakończeniu krojenia.

Pipety:

Presyn: początkowo 3,5-4,5 MΩ, następnie 3,0-3,5 MΩ po nabyciu większej wprawy

Ustawienia należy skonfigurować zgodnie z instrukcją obsługi wyciągacza. Ze względu na grubość szkła należy skorzystać z funkcji opóźnienia (skuteczne są opóźnienia 200 lub 1)

Rodzaj szkła: Borokrzemowe, standardowa ścianka, bez włókna

Średnica zewnętrzna: 2.0 mm

Średnica wewnętrzna 1,16 mm

Długość: 7.5 cm