Metody zapisów pojemności zacisków krosowych z kielicha

Summary

Pokazujemy podstawowe techniki rejestracji presynaptycznego zacisku plamowego na kielichu Helda, zakończenia nerwowego ośrodkowego układu nerwowego ssaków.

Abstract

Pokazujemy podstawowe techniki rejestracji presynaptycznego zacisku plamowego na kielichu Helda, zakończenia nerwowego ośrodkowego układu nerwowego ssaków. Zapisy elektryczne z terminala presynaptycznego pozwalają na pomiar potencjałów czynnościowych, prądów kanału wapniowego, fuzji pęcherzyków (egzocytoza) i późniejszego wychwytu błonowego (endocytoza). Fuzja pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik powoduje dodanie błony pęcherzykowej do błony komórkowej kielicha. Ten wzrost ilości błony komórkowej mierzy się jako wzrost pojemności. Późniejsze zmniejszenie pojemności wskazuje na endocytozę, proces wychwytu lub usuwania błony z błony kielicha. Endocytoza jest niezbędna do utrzymania struktury kielicha, a także do tworzenia pęcherzyków, które zostaną wypełnione neuroprzekaźnikiem na przyszłe zdarzenia egzocytozy. Zapisy pojemności kielicha Helda umożliwiły bezpośredni i szybki pomiar uwalniania pęcherzykowego, a następnie endocytozy w zakończeniu nerwowym ośrodkowego układu nerwowego ssaków. Ponadto odpowiednią aktywność postsynaptyczną można jednocześnie mierzyć za pomocą sparowanych zapisów. W ten sposób można uzyskać pełny obraz presynaptycznej i postsynaptycznej aktywności elektrycznej w synapsie ośrodkowego układu nerwowego przy użyciu tego preparatu. Przedstawiono tu metody przygotowania plastrów, cechy morfologiczne do identyfikacji kielichów Helda, podstawowe techniki zaciskania plastrów oraz przykłady zapisów pojemnościowych do pomiaru egzocytozy i endocytozy.

Protocol

Ustawienia zacisku krosowego:

Optyka:  Optyka jest bardzo ważna dla znalezienia dobrej komórki i ustalenia jej pozycji.  

Spróbuj uzyskać wyraźny obraz komórek: ostre krawędzie, miękko wyglądająca komórka.

Przeskanuj całe pole w poszukiwaniu dobrych głównych komórek MNTB z dołączonym kielichem. Obróć miskę, aby szukać kielichów pod różnymi kątami.  Na początku można ćwiczyć na terminalu w kształcie balonu.

Wybierz komórkę na powierzchni wycinka lub na drugiej warstwie^komórki. Celuj w pierwszą 1/3 komórki za pomocą pipety 

Identyfikacja kielichów: Poszukaj podwójnej membrany (zobacz Rysunek 1) i obróć półmisek do krojenia, aby zobaczyć go pod różnymi kątami, aby potwierdzić, że jest to kielich.

Rysunek 1

 

Głębokość kielicha: Kielich powinien znajdować się na powierzchni lub jak najbliżej powierzchni.

Powierzchnia dostępna do łatania: Użyj pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości na mikroskopie, aby określić, jak "szeroka/głęboka" jest  kielich. Na przykład, ~10% pełnego obrotu na precyzyjnym ognisku da ci więcej niż wystarczającą powierzchnię do załatania.

Uszczelnianie na komórce presynaptycznej:  Aby dostać się do komórki podłączonej, poszukaj "małej" deformacji na powierzchni komórki spowodowanej ciśnieniem pos (~0,15psi) w pipecie, użyj manipulatora, aby przesunąć pipetę w górę, w dół i w poprzek, a nawet w powierzchnię końcówki presyn, aby uzyskać dobre odkształcenie, a następnie zwolnij ciśnienie i zastosuj ssanie, w razie potrzeby.

PULSE, program do akwizycji danych:

Konieczne jest zwiększenie rozmiaru bufora przed pierwszym użyciem i kiedykolwiek jest to wymagane przez zdolność próbkowania.

Za każdym razem muszę załadować zmodyfikowane makra.

Potencjał złącza cieczy: Rozwiązanie do nagrywania Presyn wynosi -11mV (ujemne 11mV).

Presyn: Cslow=~15 pF

Rs comp dla presyn: 10 μsec, 65 % (możliwa większa kompensacja bez oscylacji)  

Przed zarejestrowaniem pojemności: Przetestuj aktualną relaksację (10 mV, skok 10 ms), aby sprawdzić, czy relaksacja jest monowykładnicza, tzn. czy termin presyn może być modelowany przez pojedynczy przedział.

Filtry: Ustawiane na 30 kHz i 10 kHz (filtr Bessela odpowiednio 1 i 2) podczas pomiaru relaksacji, aby upewnić się, że nie pominięto szybkiego komponentu.

Podczas mini nagrań, Xinsheng używał 10 kHz i 5kHz.  LGW poprosiło mnie o użycie tylko filtra 1 ustawionego na 30 kHz, aby upewnić się, że możemy zmierzyć czas narastania mini.

Nazewnictwo plików: 7 cyfr 000mmxx, gdzie mm to miesiąc (lub miesiąc i rok), a xx to numer komórki.

Linie roztworu czyszczącego: Linie oczyszczone na koniec eksperymentu za pomocą 20 ml 0,1 M HCl, a następnie 200 ml ddH2O. 

Rozwiązania zewnętrzne są poddawane recyklingowi, prędkość pompy wynosi 20-30 obr./min.  

(roztwór powracający z komory kąpielowej spływa z powrotem do cylindra z podziałką).

Ustaw 3 linie wychodzące, aby zapewnić wystarczające ssanie.

Roztwór do zapisu presynaptycznego pipety: ~310 mili osmolaru

Rozwiązanie Presyn musi mieć ~310 mOsm, aby zapobiec wzrostowi dostępu do R podczas eksperymentu.

Roztwór do pipet Presyn różni się od roztworu do pipet po synu (Presyn ma np. ATP i GTP).

Rozwiązanie TTX-TEA (do izolowania prądów Ca):

• Spróbuj nałożyć po uszczelnieniu, a nawet załataniu na komórkę, ponieważ TEA w roztworze blokuje kanały K i depolaryzuje komórkę.  Nie jest to dobre dla komórki. Z tego samego powodu ponowne użycie plasterka po zastosowaniu TTX może nie być możliwe.
• Porównaj pierwszą i ostatnią odpowiedź komórki lub wycinka, aby sprawdzić, czy nie ma wpływu przedłużonej depolaryzacji.
• TTX jest używany przy 1 μM zamiast 0,5 μM, dzięki czemu efekt jest szybszy. Musisz czekać krócej po zmianie rozwiązań.

Krojenie plastrów

Ustawienia wibratomu:

• Drgania boczne 70 Hz
• Amplituda: 1,0 mm
• Prędkość posuwu 0,01-0,02 mm/s podczas krojenia plastrów z kielichem, 0,1 w przeciwnym razie grubość: 180 μm (~150 μm u starszych zwierząt)

Plastry inkubować w temperaturze 37ºC przez 1 godzinę (wliczając czas cięcia), tj. pozostawić w kąpieli 15-20 minut po ścięciu.

Pipety:

Presyn: 3,5-4,5 MΩ na początku, 3,0-3,5 MΩ, gdy czujesz się pewniej

Użyj instrukcji ściągacza, aby ustawić ustawienia. Użyj funkcji opóźnienia, ponieważ szkło jest grube (opóźnienia 200 lub 1 praca)

Rodzaj szkła: borokrzemianowe, o standardowych ściankach, bez włókna

Średnica zewnętrzna: 2,0 mm

Średnica wewnętrzna 1,16 mm

Długość: 7,5 cm