<ol style="margin-top: 0in">
<li>Odciąć fragmenty ogona (3mm) i oznaczyć uszy.</li>
<li>Dodać 720 ml STE oraz 30 ml Proteinazy K (roztwór stokowy 10 mg/ml).</li>
<li>Inkubować w 55°C na bloku grzejnym, mieszając w vortexie co godzinę przez 3 godziny z maksymalną prędkością przez 10 sekund.</li>
<li>Inaktywować proteinazę K w 70°C przez 5 minut.</li>
<li>Schłodzić na lodzie przez 5 minut.</li>
<li>Odwirować DNA z ogona przez&nbsp;10 minut z maksymalną prędkością.</li>
<li>Przelać do nowej probówki zawierającej 720 ml izopropanolu.&nbsp; </li>
<li>Wytrącić DNA poprzez odwracanie probówki lub mieszanie w vortexie.</li>
<li>Odwirować DNA przez 5 minut z maksymalną prędkością. Usunąć nadsącz.</li>
<li>Przemyć osad 70% etanolem.</li>
<li>Odwirować DNA genomowe przez 5 minut z maksymalną prędkością. Usunąć nadsącz.</li>
<li>Pozostawić DNA do wyschnięcia na 1-2 minuty.</li>
<li>Resuspendować DNA w 100-200 ml, zależnie od wielkości osadu.</li>
<li>Umieścić probówkę w 55°C na 1 godzinę, aby ułatwić rozpuszczanie DNA.&nbsp; </li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / w H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

izolacja genomowego dna z ogonów myszy

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Jest to 10-dniowy szczenię mysie, u którego wykonam biopsję ogona, a następnie wyizoluję genomowe DNA z pobranej tkanki. Odcinam niewielki fragment ogona, około 3 mm, po czym umieszczam go w probówce typu Eppendorf i wkładam probówkę do suchego lodu. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej między myszami, zazwyczaj zaznaczam na ostrzu skalpela miejsce, w którym wykonano ostatnie cięcie.W ten sposób przy kolejnej myszy będę mieć pewność, że do pobrania biopsji ogona użyję czystego fragmentu żyletek. Aby rozróżnić poszczególne myszy w miocie, niezbędny będzie sposób ich identyfikacji. Jedną z metod jest wykonanie otworu w uchu za pomocą dziurkacza do uszu, który jest tutaj pokazany.Delikatnie chwyć mysz za kark w ten sposób, odwróć ją i uciśnij ogon między palcami. Weź dziurkacz do uszu w drugiej ręce i wykonaj szybkie nacięcie w uchu myszy. Widzisz, jak bezbolesne to było?Dobrze, teraz widzą Państwo, że w probówkach typu Eppendorf znajdują się fragmenty ogona, do których teraz dodam roztwory wspomagające trawienie. Najpierw dodam 720 µL roztworu STE, a następnie 30 µL proteinazy K. Oto fragment ogona, który wycięliśmy przed przystąpieniem do trawienia.Teraz umieszczę fragmenty ogona w bloku grzewczym ustawionym na 55 °C. Wiele protokołów wymaga ciągłego ruchu kołyszącego w temperaturze 55 °C, jednak w moim przypadku nie będzie to konieczne, ponieważ fragmenty ogona będę mieszać w wstrząsarzu wirującym. Teraz będę mieszać fragment ogona w wstrząsarzu wirującym przez dwie sekundy.Raz, dwa. Po wirowaniu w vortexie tak wygląda zawartość probówki Eppendorf; widać, że fragment ogona został całkowicie rozpuszczony. Następnie należy aktywować proteinazę K w temperaturze 70 °C przez pięć minut. Przerwać reakcję, schładzając na lodzie przez pięć minut.Odwirować fragmenty ogonków w mikrowirówce przez 10 minut przy pełnej prędkości. W tej mikrowirówce pełna prędkość wynosi 13 000 RPM. Podczas wirowania trawionych ogonków, opisać probówki typu Eppendorf i napełnić je 750 µL izopropanolu.Po odwirowaniu strawionych fragmentów ogonów, włosy i niestrawione materiały utworzą osad na dnie probówki. Odlej roztwór zawierający strawiony materiał, STE i proteinazę K do probówki Eppendorf zawierającej izopropanol. DNA zacznie wytrącać się z roztworu, przybierając postać mgiełki lub pierzy; w tej bąbelku znajduje się wyizolowane z ogona myszy DNA genomowe. Po wymieszaniu izopropanolu i roztworu STE, DNA genomowe wytrąci się z roztworu i pojawi się jako mała kulka; odwiruj wytrącone DNA genomowe przez pięć minut z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze.Na dnie probówki widoczny jest osad naszego genomowego DNA. Teraz odessam roztwór z wnętrza probówki, pozostawiając jedynie pellet genomowego DNA. Przy każdym odsysaniu zawartości kolejnej probówki będę wymieniać końcówkę.Przytwierdź końcówkę do tego aspiratora. Po odessaniu STE i izopropanolu dodam 1 mL 70% etanolu, aby wypłukać osad genomowego DNA. Ponieważ osad genomowego DNA zazwyczaj przylega do ścianki probówki do mikrowirówki i trudno go usunąć w celu dokładnego wypłukania w 70% etanolu, należy go zeskrobać, przesuwając probówkę o statyw do probówek do mikrowirówki, który tutaj mam.Można to zrobić w następujący sposób. Oto widok genomicznego DNA po jego sfragmentowaniu w osad i przemyciu 70% etanolem. Ponownie odwiruję go z maksymalną prędkością przez pięć minut, a następnie odessam 70% etanolu i odwiruję osady genomicznego DNA po ich przemyciu.Wiruj w 70% etanolu przez pięć minut z maksymalną prędkością, następnie odessij 70% etanol i pozostaw DNA do wyschnięcia na pięć minut. Oto widok granulatu genomowego DNA na dnie probówki; powinien być on niemal całkowicie suchy. Po wysuszeniu granulatu genomowego DNA z ogonów myszy, dodaj 100 µL 40 mM TRIS o pH 8.Zatem utrzymuję genomowe DNA w temperaturze 50 °C, w której rozpuści się ono szybciej niż w temperaturze pokojowej. Po około godzinie w 50 °C zamrożę je lub będę przechowywać w temperaturze 4 °C aż do momentu przeprowadzenia reakcji PCR, aby ustalić, które myszy są pozytywne pod kątem mojego transgenu.

isolation-of-genomic-dna-from-mouse-tails

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja DNA genomowego z ogonów myszy

University of California, Irvine (UCI).  Izolacja DNA genomowego z ogonów myszy

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

W tym artykule

Protokół

Materiały

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
STE	Bufor			100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / w H2O
TE	Bufor			100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl