Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Podsumowanie

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Streszczenie

Hipokamp, będący elementem układu limbicznego, odgrywa istotną rolę w pamięci długotrwałej i nawigacji przestrzennej ¹. Neurony hipokampa mogą modyfikować siłę swoich połączeń po krótkich okresach silnej aktywacji. Zjawisko to, znane jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP), może trwać wiele godzin lub dni i stało się najlepszym kandydatem na mechanizm uczenia się i pamięci ². Ponadto dobrze określona anatomia i łączność hipokampa ³ sprawiły, że stał się on klasycznym systemem modelowym do badania przekaźnictwa synaptycznego oraz plastyczności synaptycznej⁴.

Wraz z poszerzaniem wiedzy na temat fizjologii synaps hipokampa i identyfikacją kluczowych cząsteczek, konieczna stała się możliwość manipulacji białkami synaptycznymi. Organotypowe hodowle hipokampa umożliwiają łatwą manipulację genetyczną i precyzyjną interwencję farmakologiczną, zachowując jednocześnie organizację synaptyczną, która jest kluczowa dla zrozumienia funkcji synaps w kontekście bardziej zbliżonym do naturalnego niż w rutynowych metodach hodowli rozproszonych neuronów.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przygotowania i hodowli skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Metoda ta umożliwia łatwy dostęp do skrawków w celu manipulacji genetycznych z wykorzystaniem różnych podejść, takich jak infekcja wirusowa ^5,6 czy biolistyka ⁷. Ponadto skrawki można łatwo odzyskać do analiz biochemicznych ⁸ lub przenieść pod mikroskopy w celu obrazowania ⁹ bądź przeprowadzenia eksperymentów elektrofizjologicznych ¹⁰.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem przygotowania skrawków hipokampa.

1. Przygotuj slicer do tkanek, kładąc arkusz teflonowy i montując nowe ostrze.
2. Przetrzyj komorę do hodowli komórkowych (TC) 70% etanolem i ustaw wewnątrz mikroskopysekcyjny. Sterylizuj komorę, mikroskop, slicer do tkanek oraz wszystkie narzędzia sekcyjne przez 15 minut światłem UV.
3. Przygotuj 6-dołkowe płytki TC. Do każdej dołki dodaj 750 μL pożywki do hodowli plastrów tkankowych (SCM) i umieść w nich inserty do hodowli komórkowych. Upewnij się, że membrany są całkowicie zwilżone i nie ma pod nimi pęcherzyków powietrza. Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 35°C z dopływem 5% CO₂ do momentu użycia.
4. Wlej 50 mL ACSF o niskiej zawartości Na⁺ (roztwór do sekcji) do zlewki o pojemności 100 mL i umieść ją w mieszaninie lodu z solą. Napowietrzaj ACSF o niskiej zawartości Na⁺ mieszaniną 5% CO₂ / 95% O₂, aż zmieni kolor, a ACSF utworzy zawiesinę z zamrożonego i ciekłego roztworu (10-20 min).
5. Pobierz szczura w wieku P5-P7. Można użyć do trzech młodych szczurów.

2. Przygotowanie skrawków hipokampa.

1. Odetnij głowę zwierzęcia ostrymi nożyczkami użytkowymi. Przetnij skórę i odsłoń czaszkę. Otwórz czaszkę, przecinając ją od strony do strony wzdłuż linii międzyprzysuchem oraz wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą małych nożyczek. W celu ułatwienia usunięcia kości i odsłonięcia mózgu można wykonać opcjonalne cięcie poprzeczne w przedniej części. Szybko wybierz mózg za pomocą zaokrąglonej mikroszpatułki i umieść go w zawiesinie roztworu do sekcji, aby schłodzić go przez ~ 1 minutę. Wlej ~10 mL lodowatego roztworu do sekcji do szalki 60 mm i przenieś mózg z zlewka do szalki. Mózg powinien być całkowicie przykryty roztworem do sekcji.
2. Pod mikroskopem sekcyjnym: Umieść mózg i utrzymaj go w linii środkowej, dociskając pęsetą sekcyjną do dna szalki 60 mm. Użyj narzędzia do sekcji hipokampa, aby rozdzielić półkule, pozostawiając śródmózowie. Następnie odsłoń hipokampy w każdej półkuli. Delikatnie wybierz hipokamp za pomocą narzędzia do sekcji hipokampa. Użyj igły sekcyjnej, aby całkowicie wyizolować hipokamp i jak najlepiej go oczyścić.
3. Używając przyciętej końcówki filtra pipety P1000, delikatnie odessij hipokamp i przenieś go na arkusz teflonowy w kroiczeniu tkanek. Ułóż hipokamp stroną wklęsłą do dołu.
4. Ustaw hipokampy prostopadle do ostrza, aby uzyskać przekroje wieńcowe, i odlej nadmiar płynu.
5. Krój hipokampy w odstępach co 400 μm.
6. Wlej ~10 mL zimnego SCM do szalki 60 mm i przenieś pokrojone hipokampy z kroicznika, używając drugiej przyciętej końcówki filtra P1000 i zimnego SCM. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.
7. Za pomocą szpatułki irydowej i szpatułki prostej delikatnie rozdziel od siebie plasterki.
8. Oddziel wyraźne i nieuszkodzone plasterki od tych uszkodzonych.

3. Hodowla przekrojów hipokampa

1. Wyjmij z inkubatora płytki sześcio-dołkowe z SCM i wkładkami do hodowli komórkowej. Za pomocą innej przyciętej końcówki z filtrem do pipety P1000 przenieś poszczególne skrawki na membranę. Umieść 4-5 skrawków na jednej membranie. Należy uważać, aby skrawki nie znajdowały się zbyt blisko ścianki wkładki ani zbyt blisko siebie. W razie potrzeby użyj szpatułki irysowej do rozdzielenia skrawków. Usuń nadmiar pożywki. Po umieszczeniu skrawków na membranie unikaj ich dotykania w miarę możliwości.
2. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora i inkubuj w temperaturze 35°C i przy 5% CO₂.
3. Wymieniaj SCM co 48 godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odsysając SCM pipetą Pasteura. Dodaj 750 μL świeżego, uprzednio ogrzanego SCM do każdego dołka. Upewnij się, że pod membraną nie powstały pęcherzyki powietrza.

4. Roztwory

1. ACSF o niskiej zawartości Na⁺ – roztwór do sekcji dla kultur skrawków
   Do dejonizowanej i sterylnej H₂O dodać:
   

   	Dla 500 mL	Dla 1000 mL	Stężenie końcowe
   CaCl2 (1 M)	0,5  mL	1 mL	1 mM
   D-glukoza	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mM
   MgCl2 (1 M)	2,5 mL	5 mL	5 mM
   NaHCO3	1,092 g	2,184 g	26 mM
   Sacharoza	40 g	80 g	234 mM
   Roztwór czerwieni fenolowej 0,5% w DPBS	0,5 mL	1 mL	0,1% v/v

   
   Mieszać przez ok. 30 min
   Sterylizować poprzez przefiltrowanie przez filtr 0,22 μm
   Przygotować aliquoty po 50 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 2 miesiące.
2. Pożywka do kultur skrawków (SCM)
   

   	Dla 500 mL	Dla 1000 mL	Stężenie końcowe
   Pożywka MEM Eagle	4,2 g	8,4 g	8,4 g/l
   Surowica konia inaktywowana ciepłem	100 mL	200 mL	20%
   L-glutamina (200 mM)	2,5 mL	5 mL	1 mM
   CaCl2 (1 M)	0,5 mL	1 mL	1 mM
   MgSO4 (1 M)	1 mL	2 mL	2 mM
   Insulina (1 mg/mL), rozpuszczona w HCl 0,01 N	0,5 mL	1 mL	1 mg/l
   Kwas askorbinowy, roztwór (25% w/v)	0,024 mL	0,048 mL	0,00125%
   D-glukoza	1,16 g	2,32 g	13 mM
   NaHCO3	0,22 g	0,44 g	5,2 mM
   Hepes	3,58 g	7,16 g	30 mM

   
   Mieszać do całkowitego rozpuszczenia i doprowadzić do temperatury pokojowej.
   Dostosować pH do poziomu 7,27–7,28 za pomocą 1 N NaOH
   Zmierzyć osmolarność. Dostosować do 320 mmol/kg za pomocą dejonizowanej i sterylnej H₂O. Należy spodziewać się dodania około 25–40 mL. Ponownie sprawdzić osmolarność.
   ***pH może nieznacznie ulec zmianie podczas dostosowywania osmolarności, jest to dopuszczalne; ważniejsze jest, aby osmolarność mieściła się w odpowiednim zakresie (317–323).
   Sterylizować poprzez przefiltrowanie przez filtr 0,22 μm.
   Przygotować aliquoty po 20 mL i przechowywać do dwóch-trzech tygodni w temperaturze 4 °C.
   Roztwór zapasowy glutaminy: przygotować w stężeniu 200 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C w aliquotach po 2,5 mL.
   Roztwór zapasowy kwasu askorbinowego: przygotować w stężeniu 25% (w/v) i przechowywać w temperaturze -20 °C w aliquotach po 100 μL.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przekroje pod stereomikroskopem powinny mieć biały kolor, bez czarnych plamek, a obszary CA1, CA3 oraz zakrętu zębaty (Dentate gyrus) powinny być wyraźne i nieuszkodzone. Kontaminacja bakteryjna jest łatwo rozpoznawalna jako ruchome czarne drobinki w medium lub zmętnienie SCM. Po umieszczeniu pod mikroskopem, powierzchnia przekroju po 4 dniach hodowli powinna być czysta, z wyraźnymi i rozróżnialnymi ciałami komórkowymi. Jeśli po 4 dniach nie widać wyraźnych ciał komórkowych, a powierzchnię pokrywa znaczna ilość debris, przekrój nie jest zdrowy.

Dyskusja

Metoda ta opiera się na procedurze opisanej po raz pierwszy przez Stoppini et al. ¹¹ i umożliwia szybką hodowlę skrawków hipokampa. Najważniejszym aspektem tego protokołu jest utrzymanie sterylności skrawków; dlatego kluczowe jest stosowanie odpowiednich technik aseptycznych oraz właściwa dezynfekcja i sterylizacja wszystkich materiałów mających kontakt z tkanką.

Różne źródła surowicy mogą wpływać na jakość otrzymanych skrawków. Zalecamy wcześniejsze przetestowanie kilku p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wkładki do hodowli komórkowych	EMD Millipore	PICM03050
płytki 6-dołkowe	BD Biosciences	353046
Krojonka do tkanek	Stoelting Co.	51425/51415
Mikroskop	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
Narzędzie do wycinania hipokampa	F.S.T.	10099-15
Duże nożyce użytkowe. Perfekcja	F.S.T.	37500-00/37000-00 praworęczny/leworęczny
Spatuła Iris	F.S.T.	10093-13
Spatuła prosta	F.S.T.	10094-13
Mikroszpatułka z zaokrągloną łyżeczką	VWR international	57949-039
Disekcja przy użyciu pojedynczej igły z jednym ostrzem	Nauki o mikroskopii elektronowej	72946
Pinceta anatomiczna	Dumont	#2
Małe nożyczki do dyssekcji	F.S.T.	14060-10
pożywka MEM Eagle	Cellgro	50-019 PB
Surowica konia inaktywowana ciepłem	Invitrogen	26050-88
L-glutamina (200 mM)	Invitrogen	25030081
CaCl22 (1 M)	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO₄4 (1 M)	Sigma-Aldrich	M2773
Insulina (1 mg/ml), rozpuszczona w 0,01 N HCl	Sigma-Aldrich	I0516
Kwas askorbinowy, roztwór (25%)	Sigma-Aldrich	A4544
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO33	Sigma-Aldrich	S6014
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S5016
Roztwór czerwieni fenolowej 0,5% w DPBS	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl22 (1 M)	Sigma-Aldrich	M9272