Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja dsDNA za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen

DOI:

10.3791/2465

⸱

5 listopada 2010

 , 
1Life Sciences Group, Hitachi High Technologies America

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstracja kwantyfikacji dsDNA za pomocą sond molekularnych barwnika PicoGreen i spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w czytnik mikropłytek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja DNA, zwłaszcza w małych stężeniach, jest ważnym zadaniem o szerokim zakresie zastosowań biologicznych, w tym standardowych testów biologii molekularnej, takich jak synteza i oczyszczanie DNA, zastosowań diagnostycznych, takich jak kwantyfikacja produktów amplifikacji DNA i wykrywanie cząsteczek DNA w preparatach leczniczych. Podczas tego filmu zademonstrujemy możliwości spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium Micro Plate Reader do wykonywania kwantyfikacji dsDNA przy użyciu zestawu odczynników barwnikowych Molecular Probes Quant-it PicoGreen.

Spektrofotometr fluorescencyjny F-7000 oferuje wysoką czułość i dużą szybkość pomiarów. Jest to wysoce elastyczny system zdolny do pomiaru fluorescencji, luminescencji i fosforescencji. Dostępnych jest kilka trybów pomiaru, w tym skanowanie długości fali, skanowanie czasu, fotometria i pomiar skanowania 3D. Spektrofotometr ma czułość w zakresie 50 pikomoli fluoresceiny przy użyciu próbki o objętości 300 μl w mikropłytce i jest w stanie mierzyć prędkość skanowania 60 000 nm/minutę. Posiada również szeroki zakres dynamiki do 5 rzędów wielkości, co pozwala na stosowanie krzywych kalibracyjnych w szerokim zakresie stężeń. Układ optyczny wykorzystuje wszystkie odblaskowe układy optyczne w celu uzyskania maksymalnej energii i czułości. Standardowy zakres długości fali wynosi od 200 do 750 nm i można go rozszerzyć do 900 nm przy użyciu jednego z opcjonalnych fotopowielaczy bliskiej podczerwieni. System umożliwia opcjonalną regulację temperatury czytnika płytek w zakresie od 5 do 60 stopni Celsjusza za pomocą opcjonalnego zewnętrznego cyrkulatora cieczy sterowanego temperaturą. Czytnik mikropłytek pozwala na użycie mikropłytek 96-dołkowych, a prędkość pomiaru dla 96 dołków wynosi mniej niż 60 sekund w trybie kinetycznym.

Sterowanie programowe dla F-7000 i czytnika mikropłytek jest również bardzo elastyczne. Próbki mogą być ustawiane w formacie kolumnowym lub wierszowym, a do pomiarów próbek można wybrać dowolną kombinację studzienek. Pozwala to na optymalne wykorzystanie mikropłytki. Dodatkowo oprogramowanie umożliwia import konfiguracji próbek mikropłytek utworzonych w Excelu i zapisanych w wartościach oddzielonych przecinkami, czyli w formacie "csv". Konfiguracje pomiarowe mikropłytek mogą być zapisywane i przywoływane przez oprogramowanie w celu zapewnienia wygody i zwiększenia wydajności. Wyniki danych można wyprowadzać do standardowego raportu, do programu Excel lub do opcjonalnego programu Report Generator Program.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja instrumentu

  1. Włącz spektrofluorometr i pozwól mu się rozgrzać przez 1 godzinę.
  2. Korzystając z programu Excel, utwórz plik ze standardami i przykładowymi danymi, jak pokazano na rysunku 1, i zapisz go w formacie "csv" z wartościami oddzielonymi przecinkami.
    figure-protocol-1

    Rysunek 1. Dane dotyczące norm i próbek.

  3. Ustaw fluorometr w następujący sposób:
    1. Kliknij przycisk figure-protocol-2, otworzy się okno Metoda analizy, pokazane na rys. 2.
      figure-protocol-3

      Rysunek 2. Okno Metoda analizy, zakładka Ogólne.

      Dokonaj następujących wyborów:
      • W polu "Pomiar" wybierz Fotometria z menu rozwijanego.
      • W polu "Operator" wpisz odpowiednią nazwę operatora.
      • Nie ma potrzeby wprowadzania informacji w polu "Instrument". Jest to wybierane automatycznie przez oprogramowanie.
      • Pole "Pobieranie próbek" jest nieaktywne podczas korzystania z czytnika mikropłytek.
      • Wprowadź wszelkie komentarze, które chcesz uwzględnić w raporcie, w polu Pole "Komentarze".
      • W polu "Akcesorium" wprowadź informacje związane z akcesoriami używanymi w tym teście.
      • Zwróć uwagę na przyciski po prawej stronie okna.
      • Przycisk "Załaduj" umożliwia wczytanie wcześniej zapisanych Metod Analizy.
      • Przycisk "Zapisz" umożliwia aktualizację zestawu parametrów testowych lub Metody Analizy wcześniej zapisanych i wczytanych, przy użyciu tej samej nazwy.
      • Przycisk "Zapisz jako" umożliwia zapisanie nowego zestawu parametrów testowych lub Metody Analizy pod żądaną nazwą.
      Teraz kliknij zakładkę "Kwantyfikacja", patrz rysunek 3 i dokonaj następujących wyborów.
      figure-protocol-4

      Rysunek 3. Okno Metoda analizy, zakładka Kwantytacja.
      • W polu "Typ kwantyfikacji" wybierz opcję Długość fali. Oznacza to, że odczyt fluorescencji zostanie wykonany przy użyciu wybranej długości fali.
      • W polu "Typ kalibracji" wybierz 1. zamówienie.
      • W polu "Liczba długości fal" wybierz 1.
      • W polu "Jednostka stężenia" wpisz ng/ml.
      • Pozostaw niezaznaczone pola "Kalibracja ręczna" i "Wymuś krzywą przez zero".
      • W polu "Cyfra po przecinku dziesiętnym" wybierz wartość 2.
      • W polu "Dolna granica stężenia" wpisz 0.
      • W polu "Górna granica stężenia" wprowadź wartość 10000.

      Teraz kliknij zakładkę "Instrument" i dokonaj następujących wyborów.
      figure-protocol-5

      Rysunek 4. Okno Metoda analizy, zakładka Instrument
      • W polu "Tryb danych:" wybierz opcję Fluorescencja.
      • Pole "Prędkość siekania" jest w tej chwili nieaktywne, służy tylko do pomiarów fosforescencji.
      • W polu "Tryb długości fali" wybierz opcję Oba WL stałe.
      • W polu "EX / WL1" wpisz 480nm.
      • W polu "EM / WL1" wpisz 520nm.
      • Wszystkie inne pola w obszarach EX i EM są w tej chwili nieaktywne.
      • W polu "Szczelina EX" wybierz 5,0 nm z menu rozwijanego.
      • W polu "EM slit" wybierz 5.0nm z menu rozwijanego.
      • Pozostaw niezaznaczone pole przed polem "PMT Voltage 1-1000V".
      • W polu "PMT Voltage" wybierz 700 V z menu rozwijanego.
      • W polu "Automatyczna statystyka liczbowa obliczeniowa" wybierz wartość 2.
      • W polu "Replikacje" wybierz wartość 1.
      • W polu "Czas integracji" wybierz 0,1s.
      • W polu "Opóźnienie" wpisz lub wybierz 0s.
      Kliknij zakładkę "Monitor".
      figure-protocol-6

      Rysunek 5. Okno Metoda analizy, zakładka Monitor.
      • W polu "Oś Y", "Max:" wybierz 10000
      • W polu "Oś Y", "Min:" wybierz wartość 0.
      • Zaznacz pole po lewej stronie opcji "Otwórz przetwarzanie danych po pobraniu danych".
      • Pozostaw niezaznaczone pole po lewej stronie opcji "Drukuj raport po pobraniu danych", chyba że chcesz, aby raport był drukowany automatycznie po zakończeniu odczytów.
      Kliknij zakładkę "Raport", patrz Rysunek 6.
      figure-protocol-7

      Rysunek 6. Okno Metoda analizy, zakładka Raport.
      • W polu "Wyjście" wybierz opcję Drukuj raport z menu rozwijanego. Możesz również wybrać opcję "Użyj programu Microsoft Excel", jeśli chcesz, aby dane zostały wyeksportowane do programu Excel, lub "Użyj arkusza generatora wydruku", jeśli korzystasz z opcjonalnego programu dodatkowego Generator raportów, który umożliwi generowanie niestandardowych raportów.
      • Kliknij pola obok elementów, które mają zostać uwzględnione w raporcie.
      • Aby zapisać wszystkie wybrane parametry w różnych zakładkach okna "Metoda analizy", kliknij ponownie zakładkę "Ogólne" i zapisz je pod nazwą pliku i w miejscu, w którym możesz je znaleźć do wykorzystania w przyszłości, a następnie kliknij przycisk "OK", aby zamknąć to okno.
      • Na tym kończy się ustawianie parametrów testu przyrządu.
      • Teraz skonfigurujemy czytnik mikropłytek.
      • Kliknij przycisk figure-protocol-8, który przeniesie okno konfiguracji MPR na górę.
      Wybierz studzienki dla Wzorców i Próbek w oknie konfiguracji/karcie Płyta MPR, jak pokazano na rysunku 7.
      figure-protocol-9

      Rysunek 7. Okno Ustawienia MPR, zakładka Blacha.
      • Kliknij pozycję A1 i przeciągnij myszką do E1, a następnie kliknij przycisk figure-protocol-10. Spowoduje to wybranie pozycji, które mają być używane dla standardów. Pozycje te zostaną podświetlone kolorem zielonym.
      • Teraz musimy wybrać pozycje od F1 do H3 dla próbek. Kliknij i przeciągnij myszką, zaczynając od pozycji F1, do pozycji H3, a następnie kliknij przycisk figure-protocol-11, spowoduje to podświetlenie tych pozycji na żółto.
      • Następnie powtórz tę samą operację dla pozycji od A2 do E3, aby wybrać te pozycje dla pomiarów próbki.
      • Teraz załadujmy plik Zmienna oddzielona przecinkami (csv) przygotowany wcześniej z informacjami o standardach i próbkach.
      Kliknij zakładkę "Informacje o studni" w "Oknie konfiguracji MPR", jak pokazano na rysunku 8.
      figure-protocol-12

      Rysunek 8. Okno Ustawienia MPR, zakładka Informacje o studni.
      • Następnie kliknij na przycisk figure-protocol-13. Otworzy się okno eksploratora Windows, które, jak pokazano na rysunku 9, pozwoli zlokalizować plik "Well information.csv" i załadować go.
        figure-protocol-14

        Rysunek 9. Wczytywanie informacji o próbce studni.
        Po załadowaniu pliku "Informacje o studni", "Informacje o studni" będą wyglądać tak, jak pokazano na rysunku 10
        figure-protocol-15

        Rysunek 10. Załadowano informacje o studzience próbki.

2. Przygotowanie próbki do testu Picogreen

  1. Przygotować 1X bufor TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), dodając 1 ml 20 X TE Buffer do 19 mL dIH 2O.
  2. Przygotuj roztwór odczynnika PicoGreen, dodając 50 μL 200 X PicoGreen Reagent do 9,95 ml 1 X TE Buffer.
  3. Przygotować wzorce (Lambda dsDNA), wykonując seryjne rozcieńczenia podstawowego dsDNA (100 μg/ml). Najpierw przygotuj roztwór 50 μg/ml dsDNA, dodając 25 μl podstawowego dsDNA (100 μg/mL) i 25 μL 1 x bufor TE. Następnie przygotuj roztwory wzorcowe, dodając wskazane objętości dsDNA i buforu, jak podano w poniższej tabeli: Stężenie dsDNA Objętość dsDNA Objętość bufora 1 μg/ml 20 μl 50 μg/ml dsDNA 980 μL 1 x bufor TE 0,1 μg/ml 100 μl 1 μg/ml dsDNA 900 μL 1 x bufor TE 0,01 μg/ml 100 μl 0,1 μg/ml dsDNA 900 μL 1 x bufor TE 0,001 μg/ml 100 μl 0,01 μg/ml dsDNA 900 μL 1 x bufor TE

3. Pomiar wzorców i fluorescencji próbki

  1. Odpipetować 150 μl każdego wzorca do studzienek A1-E1 na płytce 96-dołkowej, zgodnie z rysunkiem 7 i zgodnie z poniższą tabelą: studnia norma Klasa A1 1 μg/ml Klasa B1 0,1 μg/ml Klasa C1 0,01 μg/ml Klasa D1 0,001 μg/ml Klasa E1 1 x bufor TE
  2. Odpipetować 150 μl nieznanych próbek do studzienek od F1 do H3, pokazanych na rysunku 7
  3. Wlać roztwór PicoGreen przygotowany w kroku 1.2 do koryta przeznaczonego do stosowania z pipetami wielokanałowymi. Użyj pipety wielokanałowej, aby dostarczyć 150 μl roztworu PicoGreen do studzienek A1-H3. Delikatnie wymieszać roztwór i wzorce za pomocą pipety.
  4. Umieść płytkę w ciemnym miejscu i odczekaj 2-5 minut, aż rozwinie się reakcja.

4. Reprezentatywne wyniki

Dobra krzywa kalibracyjna jest oceniana przy użyciu różnych parametrów dostarczanych przez oprogramowanie F-7000 po pomiarze wzorców i obliczeniu krzywej kalibracyjnej przez oprogramowanie.

Współczynnik determinacji wskazuje na dobre dopasowanie mierzonych wzorców i obliczoną krzywą kalibracji. Im wartość ta jest bliższa "1", tym lepsze dopasowanie zmierzonej wartości i krzywej kalibracyjnej.

Jeśli wartość jest daleka od "1", wzorce muszą zostać ponownie zmierzone, ponownie przygotowane, lub dopasowanie krzywej kalibracyjnej musi zostać zmienione.

Rysunek 11 pokazuje przykład krzywej kalibracyjnej z obliczonym współczynnikiem determinacji = 0,99993, uzyskanej do kwantyfikacji dsDNA przy użyciu barwnika PicoGreen.

figure-protocol-16

Rysunek 11. Przykład krzywej kalibracyjnej dsDNA.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staranne pipetowanie podczas przygotowywania próbki, a także używanie stabilnego i czułego spektrofotometru fluorescencyjnego jest niezbędne do uzyskania dobrych i powtarzalnych wyników.

W przypadku spektrofotometru fluorescencyjnego używanego do tego badania sugeruje się użycie 300 μl końcowej objętości próbki w czytniku mikropłytek. Mniejsza objętość zmniejsza czułość, a większa objętość może powodować zanieczyszczenie krzyżowe między odwiertami.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Luis A. Moreno i Kendra L. Cox są zatrudnieni w firmie Hitachi High Technologies America, która produkuje instrument użyty w tym artykule.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnikH2O
Quant-iT Picogreen dsDNA Zestaw testowy odczynnikaP7589
Nalge Nunc Fluorescencyjne mikropłytki p / n237108 Zasilanie237108
12-kanałowej mikropipety Eppendorf3516677
1000 μ L EppendorfPipeta Zasilanie
200 μ L Eppendorf Pipeta Dostawa
10 ml pipety serologicznejDostawa
Folia aluminiowaDostawa
Końcówki do pipetDostawa
Spektrofotometr fluorescencyjny Hitachi F-7000 z wyposażeniem FL Solutions 2.15J1-0003
Czytnik mikropłytek Akcesorium do sprzętu F-70005J0-0139
Destylowany Invitrogen

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dsDNA QuantificationMicroplate ReaderDNA Concentration MeasurementCalibration CurveWavelength PhotometryTE BufferLambda DNA

Powiązane artykuły