Demonstracja ilościowego oznaczenia dsDNA przy użyciu barwnika PicoGreen firmy Molecular Probes oraz spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium do odczytu mikropłytek.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczenie dsDNA przy użyciu spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ilościowe oznaczanie DNA, zwłaszcza w niskich stężeniach, jest istotnym zadaniem o szerokim zakresie zastosowań biologicznych, obejmującym standardowe testy biologii molekularnej, takie jak synteza i oczyszczanie DNA, zastosowania diagnostyczne, m.in. oznaczanie ilości produktów amplifikacji DNA, oraz wykrywanie cząsteczek DNA w preparatach leków. W tym filmie zaprezentujemy możliwości spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium do odczytu mikropłytek w celu przeprowadzenia oznaczania ilościowego dsDNA przy użyciu zestawu odczynników barwiących Molecular Probes Quant-it PicoGreen.
Spektrofotometr fluorescencyjny F-7000 zapewnia wysoką czułość i szybkość pomiarów. Jest to wysoce elastyczny system umożliwiający pomiar fluorescencji, luminescencji i fosforescencji. Dostępnych jest kilka trybów pomiarowych, w tym skanowanie długości fali, skanowanie czasowe, fotometria oraz pomiar skanowania 3D. Spektrofotometr charakteryzuje się czułością na poziomie 50 picomoli fluoresceiny przy objętości próbki 300 μL w mikropłytce i umożliwia pomiary z prędkością skanowania do 60 000 nm/minutę. Posiada również szeroki zakres dynamiczny, wynoszący do 5 rzędów wielkości, co pozwala na stosowanie krzywych kalibracyjnych w szerokim zakresie stężeń. Układ optyczny opiera się w całości na optyce refleksyjnej, aby zapewnić maksymalną energię i czułość. Standardowy zakres długości fal wynosi od 200 do 750 nm i może zostać rozszerzony do 900 nm przy zastosowaniu jednego z opcjonalnych fotopowielaczy bliskiej podczerwieni. System umożliwia opcjonalną kontrolę temperatury czytnika płytek w zakresie od 5 do 60 °C przy użyciu zewnętrznego, opcjonalnego cyrkulatora cieczy z regulacją temperatury. Czytnik mikropłytek umożliwia stosowanie mikropłytek 96-dołkowych, a czas pomiaru dla 96 dołków wynosi mniej niż 60 sekund w trybie kinetycznym.
Oprogramowanie sterujące urządzeniami F-7000 oraz czytnikiem mikropłytek jest również wysoce elastyczne. Próbki można ustawić w formacie kolumnowym lub wierszowym, a do pomiarów można wybrać dowolną kombinację studzienek. Pozwala to na optymalne wykorzystanie mikropłytki. Dodatkowo oprogramowanie umożliwia importowanie konfiguracji próbek na mikropłytce utworzonych w programie Excel i zapisanych w formacie wartości rozdzielanych przecinkami, czyli formacie „csv”. Konfiguracje pomiarowe mikropłytek mogą być zapisywane i przywoływane przez oprogramowanie w celu zwiększenia wygody i wydajności pracy. Wyniki danych mogą być eksportowane do standardowego raportu, do programu Excel lub do opcjonalnego programu Generator Raportów.
Protokół
1. Konfiguracja urządzenia
- Włącz spektrofluorometr i odczekaj 1 godzinę na jego rozgrzanie.
- Za pomocą programu Excel utwórz plik z danymi dla wzorców i próbek, jak pokazano na Rysunku 1, i zapisz go w formacie wartości rozdzielanych przecinkami „csv”.
Rysunek 1. Dane wzorców i próbek.
- Skonfiguruj fluorometr w następujący sposób:
- Kliknij przycisk
, co otworzy okno Metody Analizy (Analysis Method), przedstawione na Rys. 2.
Rysunek 2. Okno Metody Analizy, karta Ogólne (General).
Dokonaj następujących wyborów:- W polu „Pomiar” (Measurement) wybierz z menu rozwijanego opcję Fotometria (Photometry).
- W polu „Operator” wprowadź imię i nazwisko odpowiedniego operatora.
- Nie ma potrzeby wprowadzania informacji w polu „Instrument”. Jest on wybierany automatycznie przez oprogramowanie.
- Pole „Próbkowanie” (Sampling) jest nieaktywne podczas korzystania z czytnika mikropłytek.
- W polu „Komentarze” (Comments) wpisz wszelkie uwagi, które powinny znaleźć się w raporcie.
- W polu „Akcesorium” (Accessory) wprowadź informacje dotyczące akcesoriów użytych w tym badaniu.
- Zwróć uwagę na przyciski po prawej stronie okna.
- Przycisk „Wczytaj” (Load) umożliwia wczytanie wcześniej zapisanych Metod Analizy.
- Przycisk „Zapisz” (Save) umożliwia aktualizację zestawu parametrów testu lub wcześniej zapisanej i wczytanej Metody Analizy przy użyciu tej samej nazwy.
- Przycisk „Zapisz jako” (Save As) umożliwia zapisanie nowego zestawu parametrów testu lub Metody Analizy pod wybraną nazwą.
Rysunek 3. Okno Metody Analizy, karta Ilościowe (Quantitation).
- W polu „Typ oznaczania ilościowego” (Quantitation type) wybierz Długość fali (Wavelength). Oznacza to, że odczyt fluorescencji zostanie wykonany przy użyciu wybranej długości fali.
- W polu „Typ kalibracji” (Calibration type) wybierz 1st order (pierwszy rząd).
- W polu „Liczba długości fal” (Number of wavelengths) wybierz 1.
- W polu „Jednostka stężenia” (Concentration unit) wprowadź ng/mL.
- Pozostaw niezaznaczone pola „Kalibracja ręczna” (Manual Calibration) i „Wymuś przejście krzywej przez zero” (Force curve through zero).
- W polu „Cyfry po przecinku” (Digit after decimal point) wybierz 2.
- W polu „Dolna granica stężenia” (Lower concentration limit) wprowadź 0.
- W polu „Górna granica stężenia” (Upper concentration limit) wprowadź 10000.
Teraz kliknij kartę „Instrument” i dokonaj następujących wyborów.
Rysunek 4. Okno Metody Analizy, karta Instrument.
- W polu „Tryb danych:” (Data mode:) wybierz Fluorescencja (Fluorescence).
- Pole „Prędkość cięcia” (Chopping speed) jest obecnie nieaktywne; służy ono wyłącznie do pomiarów fosforescencji.
- W polu „Tryb długości fali” (Wavelength mode) wybierz Obie WL stałe (Both WL fixed).
- W polu „EX / WL1” wprowadź 480nm.
- W polu „EM / WL1” wprowadź 520nm.
- Wszystkie pozostałe pola w sekcjach EX i EM są obecnie nieaktywne.
- W polu „Szczelina EX” (EX slit) wybierz z menu rozwijanego 5.0nm.
- W polu „Szczelina EM” (EM slit) wybierz z menu rozwijanego 5.0nm.
- Pozostaw niezaznaczone pole przy polu „Napięcie PMT 1-1000V” (PMT Voltage 1-1000V).
- W polu „Napięcie PMT” (PMT Voltage) wybierz z menu rozwijanego 700V.
- W polu „Liczba do auto statystyk” (Auto statistic calc. number) wybierz 2.
- W polu „Powtórzenia” (Replicates) wybierz 1.
- W polu „Czas całkowania” (Integration time) wybierz 0.1s.
- W polu „Opóźnienie” (Delay) wprowadź lub wybierz 0s.
Rysunek 5. Okno Metody Analizy, karta Monitor.
- W polu „Oś Y”, „Maks:” (Y axis, Max:), wybierz 10000.
- W polu „Oś Y”, „Min:” (Y axis, Min:), wybierz 0.
- Zaznacz pole po lewej stronie opcji „Otwórz przetwarzanie danych po akwizycji danych” (Open data processing after data acquisition).
- Pozostaw niezaznaczone pole po lewej stronie opcji „Drukuj raport po akwizycji danych” (Print report after data acquisition), chyba że chcesz, aby raport był drukowany automatycznie po zakończeniu odczytów.
Rysunek 6. Okno Metody Analizy, karta Raport (Report).
- W polu „Wyjście” (Output) wybierz z menu rozwijanego opcję Drukuj Raport (Print Report). Można również wybrać „Użyj Microsoft Excel” (Use Microsoft Excel), jeśli dane mają zostać wyeksportowane do programu Excel, lub „Użyj arkusza generatora wydruków” (Use Print Generator Sheet), jeśli korzystasz z opcjonalnego programu dodatkowego Report Generator, który umożliwia tworzenie spersonalizowanych raportów.
- Zaznacz pola przy elementach, które chcesz uwzględnić w raporcie.
- Aby zapisać wszystkie wybrane parametry na różnych kartach okna „Metoda Analizy”, kliknij ponownie kartę „Ogólne” (General), zapisz je pod wybraną nazwą pliku w lokalizacji, która umożliwi ich późniejsze odnalezienie, a następnie kliknij przycisk „OK”, aby zamknąć to okno.
- To kończy konfigurację parametrów testowych instrumentu.
- Teraz skonfigurujemy czytnik mikropłytek.
- Kliknij przycisk
, co spowoduje wyświetlenie okna Konfiguracji MPR (MPR Setup) na pierwszym planie.
Rysunek 7. Okno konfiguracji MPR, karta Płyta (Plate).
- Kliknij pozycję A1 i przeciągnij myszą do E1, a następnie kliknij przycisk
. Wybierze to pozycje, które będą służyć jako wzorce. Pozycje te zostaną podświetlone na zielono. - Teraz musimy wybrać pozycje od F1 do H3 dla próbek. Kliknij i przeciągnij myszą od pozycji F1 do pozycji H3, a następnie kliknij przycisk
; spowoduje to podświetlenie tych pozycji na żółto. - Następnie powtórz tę samą operację dla pozycji od A2 do E3, aby wybrać te pozycje do pomiarów próbek.
- Teraz wczytaj wcześniej przygotowany plik wartości rozdzielanych przecinkami (csv) z informacjami o wzorcach i próbkach.
Rysunek 8. Okno konfiguracji MPR, karta Informacje o studzienkach (Well Information).
- Następnie kliknij przycisk
. Otworzy się okno Eksploratora Windows, jak pokazano na Rysunku 9, co pozwoli zlokalizować plik „Well information.csv” i go wczytać.
Rysunek 9. Wczytywanie informacji o próbkach w studzienkach.
Po wczytaniu pliku „Well information”, informacje o studzienkach będą wyglądać jak na Rysunku 10.
Rysunek 10. Wczytane informacje o próbkach w studzienkach.
- Kliknij przycisk
2. Przygotowanie próbek do analizy Picogreen
- Przygotować bufor TE 1X (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), dodając 1 mL buforu TE 20X do 19 mL dI H2O.
- Przygotować roztwór odczynnika PicoGreen, dodając 50 μL odczynnika PicoGreen 200X do 9,95 mL buforu TE 1X.
- Przygotować wzorce (Lambda dsDNA), wykonując rozcieńczenia seryjne z roztworu stokowego dsDNA (100 μg/mL). Najpierw przygotować roztwór dsDNA o stężeniu 50 μg/mL, dodając 25 μL stokowego dsDNA (100 μg/mL) i 25 μL buforu TE 1X. Następnie przygotować roztwory wzorcowe, dodając wskazane objętości dsDNA i buforu, zgodnie z poniższą tabelą:
Stężenie dsDNA Objętość dsDNA Objętość buforu 1 μg/mL 20 μL dsDNA 50 μg/mL 980 μL buforu TE 1X 0,1 μg/mL 100 μL dsDNA 1 μg/mL 900 μL buforu TE 1X 0,01 μg/mL 100 μL dsDNA 0,1 μg/mL 900 μL buforu TE 1X 0,001 μg/mL 100 μL dsDNA 0,01 μg/mL 900 μL buforu TE 1X
3. Pomiar fluorescencji wzorców i próbek
- Pipetuj 150 μL każdego standardu do dołków A1-E1 płytki 96-dołkowej, zgodnie z Rysunkiem 7 oraz poniższą tabelą:
Dołek Standard A1 1 μg/mL B1 0,1 μg/mL C1 0,01 μg/mL D1 0,001 μg/mL E1 1 X Bufor TE - Pipetuj 150 μL nieznanych próbek do dołków od F1 do H3, przedstawionych na Rysunku 7
- Przelej roztwór PicoGreen przygotowany w kroku 1.2 do korytka przeznaczonego do pipet wielokanałowych. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 150 μL roztworu PicoGreen do dołków A1-H3. Delikatnie wymieszaj roztwór ze standardami za pomocą pipety.
- Umieść płytkę w ciemnym miejscu i odczekaj 2-5 minut do czasu zajścia reakcji.
4. Reprezentatywne wyniki
Poprawność krzywej kalibracyjnej ocenia się na podstawie różnych parametrów dostarczanych przez oprogramowanie F-7000 podczas pomiaru wzorców i obliczania krzywej kalibracyjnej przez program.
Współczynnik determinacji wskazuje stopień dopasowania zmierzonych standardów do wyznaczonej krzywej kalibracyjnej. Im wartość ta jest bliższa „1”, tym lepsze dopasowanie wartości zmierzonej do krzywej kalibracyjnej.
Jeśli wartość znacznie odbiega od „1”, należy ponownie zmierzyć standardy, przygotować je od nowa lub zmienić dopasowanie krzywej kalibracyjnej.
Rysunek 11 przedstawia przykład krzywej kalibracyjnej z obliczonym współczynnikiem determinacji = 0,99993, uzyskanej podczas ilościowego oznaczania dsDNA z użyciem barwnika PicoGreen.
Rysunek 11. Przykład krzywej kalibracyjnej dsDNA.
Dyskusja
Staranne pipetowanie podczas przygotowania próbek, a także zastosowanie stabilnego i czułego spektrofotometru fluorescencyjnego, są niezbędne do uzyskania dobrych i powtarzalnych wyników.
W przypadku spektrofotometru fluorescencyjnego użytego w tym badaniu zaleca się stosowanie końcowej objętości próbki wynoszącej 300 μL w czytniku mikropłytek. Mniejsza objętość zmniejsza czułość, natomiast większa objętość może spowodować kontaminację krzyżową między dołkami.
Oświadczenia
Luis A. Moreno i Kendra L. Cox są zatrudnieni w firmie Hitachi High Technologies America, która produkuje instrument wykorzystany w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Woda destylowana H2O | Odczynnik | |||
| Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT Picogreen firmy Invitrogen | Odczynnik | P7589 | ||
| Fluorescencyjne mikropłytki Nalge Nunc nr kat. 237108 | Materiały | 237108 | ||
| 12-kanałowa mikropipeta Eppendorf | Materiały | 3516677 | ||
| Pipeta Eppendorf 1000 μL | Materiały | |||
| Pipeta Eppendorf 200 μL | Materiały | |||
| Pipeta serologiczna 10 mL | Materiały | |||
| Folia aluminiowa | Materiały | |||
| Końcówki do pipet | Materiały | |||
| Spektrofotometr fluorescencyjny Hitachi F-7000 z oprogramowaniem FL Solutions 2.1 | Sprzęt | 5J1-0003 | ||
| Akcesorium do odczytu mikropłytek dla modelu F-7000 | Sprzęt | 5J0-0139 |
Bibliografia
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
Przedruki i uprawnienia
