Bezpośrednie dostarczenie morfolin MIF do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Podsumowanie

Opracowano metodę bezpośredniego dostarczania morfolino do otocysty ryby zebrafish w 24hpf. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji morfolino do światła pęcherzyka słuchowego oraz elektroporacji w celu umożliwienia penetracji, udało się ominąć wpływ morfolino na mózg i uzyskać efekty specyficzne dla ucha wewnętrznego.

Streszczenie

W ostatnich latach elektroporacja stała się popularną techniką transfekcji in vivo DNA, RNA oraz morfolino do różnych tkanek, w tym do oka, mózgu i somytów danio-ostrobramkowego. Przewagą elektroporacji nad innymi metodami manipulacji genetycznej jest możliwość celowania w konkretne tkanki, zarówno przestrzennie, jak i czasowo, w celu wprowadzenia makrocząsteczek poprzez przyłożenie prądu elektrycznego. W niniejszym opisie przedstawiamy zastosowanie elektroporacji do transfekcji morfolino mif oraz mif-like do tkanek rozwijającego się ucha wewnętrznego danio-ostrobramkowego. W poprzednich badaniach wstrzyknięcie morfolino mif do embrionów w stadium od 1 do 8 komórek skutkowało rozległymi zmianami morfologicznymi w układzie nerwowym, oku, a także w uchu. Celując w tkanki ucha wewnętrznego w późniejszych etapach rozwoju, możemy określić pierwotne efekty MIF w rozwijającym się uchu wewnętrznym, w przeciwieństwie do efektów wtórnych, które mogą wynikać z wpływu innych tkanek. Wykorzystując barwienie faloidyną i acetylowaną tubuliną do badania morfologii neuronów, wypustek neuronalnych i komórek rzęsek związanych z tylną plamką, byliśmy w stanie ocenić skuteczność elektroporacji jako metody ukierunkowanej transfekcji w uchu wewnętrznym danio-ostrobramkowego. Do pęcherzyków słuchowych embrionów w wieku 24hpf wstrzyknięto morfolino i przeprowadzono elektroporację, a następnie porównano je z embrionami, które nie otrzymały żadnej terapii lub zostały poddane jedynie wstrzyknięciu bądź elektroporacji. Embriony, u których zastosowano wstrzykiwanie i elektroporację, wykazały spadek liczby komórek rzęsek, zmniejszoną innowację zrazu statoakustycznego (SAG) oraz mniejszą liczbę neuronów SAG w porównaniu z grupami kontrolnymi. Nasze wyniki wykazały, że bezpośrednie dostarczenie morfolino do otocyst w późniejszych etapach pozwala uniknąć niespecyficznych efektów w układzie nerwowym i grzebieniu neuralnym, które występują przy dostarczaniu morfolino w stadium 1-8 komórek. Pozwala to również na badanie efektów skierowanych bezpośrednio do ucha wewnętrznego, a nie efektów wtórnych w uchu wynikających z pierwotnego wpływu na mózg, grzebień neuralny lub mezenchymę periotyczną.

Protokół

1. Przygotowanie elektrod do elektroporacji

1. Odetnij kawałek drutu wolframowego o średnicy 75 μm (A-M Systems, Inc. Carlsborg, WA) o odpowiedniej długości (około 3-5 cm)
2. Wprowadź drut wolframowy do złącza kabla Molex (stemplowany mosiężny pin)
3. Owiń druty wolframowe i złącze kabla Molex rurką termokurczliwą (SPC Technology, Chicago, IL), a następnie podgrzej palnikiem Bunsena lub opalarką, aby uszczelnić rurkę na drucie
4. Aby zaostrzyć końcówkę drutu wolframowego, zanurz go w 1,0 N wodorotlenku sodu (Conrad et al. 1993) i, używając spinacza do papieru jako drugiej elektrody, przeprowadź elektrolizę drutu za pomocą elektroporatora falowego. Stosowane warunki to 5 impulsów o napięciu 50 V, z których każdy trwa 100 ms, z odstępami 50 ms między impulsami. Elektrody powinny zostać zaostrzone do średnicy 15-20 μm
5. Przed użyciem w procesie elektroporacji przechowuj druty w tacy w rowkach odciśniętych w glinie modelarskiej

2. Przygotowanie stanowiska do elektroporacji

1. Przymocuj taśmą zaostrzone elektrody wolframowe o średnicy 75μm do mikromanipulatorów (World Precision instruments).
2. Umieść mikromanipulatory po obu stronach stolika mikroskopu sekcyjnego (Leica).
3. Podłącz elektrody do elektroporatora kwadratowej fali Protect CUY-21 Edit (Rycina 1).
4. Włącz elektroporator i ustaw parametry elektroporacji, w tym napięcie, czas trwania impulsu oraz liczbę impulsów. Ustalono, że najskuteczniejszymi parametrami dla tego eksperymentu były trzy impulsy o napięciu 13 V, z których każdy trwał 5,0ms, z odstępami 100ms pomiędzy impulsami. Jeśli w wyniku elektroporacji w embrionie powstają pęcherzyki powietrza, należy skrócić czas trwania impulsu.

3. Mikrowstrzykiwanie morfolino do pęcherzyka słuchowego rybki zebrafish

1. Zbierz zarodki danio pręgowanego z zbiornika hodowlanego. Inkubuj zarodki w medium do hodowli zarodków z dodatkiem 0,3 PPM błękitu metylenowego (Westerfield, 2005) w temperaturze 28,5°C przez noc.
2. Wytwórz szklane igły za pomocą wyciągacza elektrod Sutter P-97
3. Podgrzej podkład z żelu agarozy (1% agaroza w wodzie dla ryb w 10 mm szalce Petriego) do 37°C w kąpieli wodnej
4. Podgrzej 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMPA) w wodzie dla ryb aż do stopienia, a następnie utrzymuj ją w ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
5. Napełnij szklaną igłę roztworem morfolino (GeneTools, Corvallis, OR) i przytnij końcówkę do odpowiedniej średnicy. Zamocuj igłę do wtryskiwania w mikromanipulatorze (Kuhn).
6. Przytnij końcówkę igły do około 10 μm i wstrzyknij do oleju mineralnego, aby upewnić się, że końcówka umożliwia dostarczenie odpowiedniej ilości roztworu morfolino.
7. Usuń otoczki z zarodków w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf) i znieczul je za pomocą MS222 (trykaina, Sigma) w wodzie dla ryb z 0,3 PPM błękitu metylenowego.
8. Ułóż 3 do 5 znieczulonych zarodków na podkładzie z żelu agarozy prawą stroną do góry w celu zapewnienia wygodnej i jednolitej analizy
9. Nanieś 1 do 2 kropli 1% LMPA na każdy zarodek i poczekaj do zastygnięcia, aby utrwalić zarodek w miejscu
10. Obróć szalkę Petriego tak, aby pęcherzyk słuchowy znajdował się po prawej stronie
11. Wprowadź igłę do światła pęcherzyka słuchowego i wstrzyknij roztwór morfolino za pomocą pneumatycznej mikropompki PV820 Pneumatic PicoPump (World Precision Instruments) z podłączonym zbiornikiem azotu (Rycina 2)

4. Procedura elektroporacji

1. Przenieś zamontowane embriony do stacji elektroporacji natychmiast po wstrzyknięciu
2. Umieść elektrodę dodatnią na tkance bezpośrednio za pęcherzykiem słuchowym, ale nie przebijaj jej; wprowadź elektrodę ujemną do mózgu bezpośrednio przed pęcherzykiem słuchowym
3. Przyłoż prąd za pomocą pedału nożnego lub naciskając przełącznik.
4. Wlej wodę dla ryb na agarozę i usuń embriony z agarozy, delikatnie zamieszałszy i używając szklanej pipety. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić embrionów. W przypadku embrionów trudnych do usunięcia, użyj igły, aby delikatnie odłupać LMPA otaczający embrion.
5. Umieść embriony w płytce z wodą dla ryb z błękitem metylenowym i hoduj je do etapów wymaganych do analizy (analizy morfologicznej, immunohistochemicznej, hybrydyzacji in situ itp. oraz analizy mikroskopowej).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Stanowisko do elektroporacji. Elektrody wykonano z zaostrzonych drutów wolframowych o średnicy 75μm i połączono przewodami z elektroporatorem Protect CUY-21 Edit Square Wave. Elektrody te zostały przymocowane taśmą do mikromanipulatorów.

Rycina 2. Stanowisko do iniekcji. Wszystkie embriony otrzymywały iniekcje do prawego ucha w celu standaryzacji.

Rysunek 3. Barwienie filamentów aktynowych falloidyną w embrionach w 3 dpf. (A) Embrion w 3 dpf po iniekcji kontrolnego MO wykazuje silne barwienie falloidyną w tylnej plamce (pm). (B) Embrion, który został poddany iniekcji kontrolnego MO, a następnie elektroporacji, wykazywał poziom barwienia falloidyną w pm podobny do embrionów poddanych tylko iniekcji. (C) Sama iniekcja mif MO do pęcherzyka słuchowego nie spowodowała zmniejszenia barwienia falloidyną, podczas gdy iniekcja mif MO wraz z elektroporacją spowodowała drastyczne zmniejszenie barwienia falloidyną w pm (D). am, przednia plamka.

Rysunek 4. Barwienie filamentów aktynowych falloidyną u larw w 5 dpf. Nie stwierdzono różnic między samą injekcją (A) a injekcją z elektroporacją przy zastosowaniu standardowego kontrolnego morfolino (B). Jednakże larwy w 5 dpf, którym wstrzyknięto morfolino mif i poddano elektroporacji, wykazały osłabione barwienie falloidyną w tylnej plamce (pm) (D), choć efekt był mniej gwałtowny niż w 3 dpf, w porównaniu z embrionem, któremu wstrzyknięto jedynie morfolino mif (C). am, przednia plamka.

Rysunek 5. Barwienie acetylowanej tubuliny w embrionach w 3 dpf. Embrion na zdjęciu (A) nie został poddany żadnej iniekcji ani elektroporacji. Embrion na zdjęciu (B) został poddany elektroporacji, ale nie otrzymał iniekcji. Embriony, które otrzymały zarówno iniekcję, jak i elektroporację (C, D) z morfolinami mif, wykazały widocznie zmniejszone barwienie tubuliny w porównaniu z grupą kontrolną. (pm, plamka tylna).

Rysunek 6. Barwienie acetylowanej tubuliny w embrionach w 3 dpf z kontrolnym morfolino. (A) Embrion bez żadnego zabiegu wykazał silne barwienie acetylowanej tubuliny w tylnej plamce (pm) oraz rozległą unerwienie. (B) Embrion po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino. (C) Embrion poddany wyłącznie elektroporacji. (D) Embrion kontrolny po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino i elektroporacji wykazuje poziom acetylowanej tubuliny w tylnej plamce i stopień unerwienia zbliżony do grupy kontrolnej bez zabiegów.

Dyskusja

Pomyślnie wprowadziliśmy oligosomowe morfolino (MO) antysensowne do ucha zarodka zebrafish w 24 hpf. Zarodki hodowane po wstrzyknięciu i elektroporacji pozostały żywotne. W przypadku zarodków, które przeżyły elektroporację, tempo ich wzrostu było prawidłowe w porównaniu z zarodkami niepoddanymi żadnej procedurze, a także z zarodkami, którym wykonano jedynie wstrzyknięcie lub jedynie elektroporację.

Obserwowaliśmy efekty działania MO przeciwko mif i mif-like po wstrzyknięciu do ucha i elektroporacji, wykorzystując znakowanie faloidyną oraz acetylowaną tubuliną. Barwienie filamentów aktynowych faloidyną w komórkach rzęsnych sensorycznych tylnej plamki wskazuje, że elektroporacja MO przeciwko mif i mif-like w stadium 24-hpf spowodowała zmiany w liczbie komórek rzęsnych i/lub stereocilii w porównaniu z embrionami, którym wstrzyknięto jedynie MO (Rysunek 3). Ten spadek liczby komórek rzęsnych jest zgodny z wynikami Shen et al. (w recenzji), wykazującymi, że MO przeciwko mif i mif-like powodują redukcję liczby komórek rzęsnych w plamce woreczka. Zmniejszenie liczby komórek rzęsnych u embrionów, którym wstrzyknięto MO i poddano elektroporacji, dowodzi, że elektroporacja może wspomagać transport MO przez błonę komórkową, zwiększając tym samym zakres efektów morfologicznych w porównaniu z embrionami, w których wstrzyknięto MO jedynie do pęcherzyka słuchowego. Zmiany w morfologii zwoju przedsionkowo-ślimakowego zaobserwowano poprzez barwienie acetylowaną tubuliną. Zakres unerwienia przez zwój przedsionkowo-ślimakowy uległ zmianie, ponieważ embriony poddane wstrzyknięciu i elektroporacji wykazały zmniejszone rozgałęzianie się neurytów (Rysunek 5). Może również występować zmniejszona kondensacja komórek zwojowych i/lub zmniejszona liczba komórek zwojowych, ponieważ barwienie acetylowaną tubuliną jest znacznie słabsze u embrionów, które zostały zarówno wstrzyknięte, jak i poddane elektroporacji. Ponieważ wykazano, że mif jest kluczowy dla rozwoju układu nerwowego (Suzuki et al., 2004), zmiany zaobserwowane po elektroporacji mogą być wynikiem zwiększonej transfekcji roztworu MO przeciwko mif i mif-like do komórek neuroblastów.

Elektroporacja oligos morfolin antysensownych bezpośrednio do rozwijającej się tkanki jest użytecznym narzędziem do kontrolowania ekspresji genu podczas rozwoju tej tkanki w zarodku, zarówno przestrzennie, jak i czasowo. Elektroporacja MO przeciwko mif oraz mif-like do tkanek ucha wewnętrznego doprowadziła do nieprawidłowej morfologii zarówno plamki tylnej, jak i zwoju statakoakustycznego. Odnotowano zmniejszenie liczby komórek rzęskowych sensorycznych w plamce tylnej u zarodków poddanych iniekcji i elektroporacji w porównaniu z zarodkami niepoddanymi żadnej procedurze lub zarodkami, u których zastosowano wyłącznie iniekcję lub wyłącznie elektroporację. Zaobserwowano również zmniejszenie stopnia unerwienia tylnej plamki sensorycznej przez zwój statakoakustyczny oraz zmniejszenie rozmiaru SAG. Elektroporacja jest cenną metodą transfekcji makrocząsteczek do konkretnych tkanek, co pozwala na obserwację pierwotnych efektów działania danego DNA, RNA lub MO w pożądanej tkance i odróżnienie ich od efektów wtórnych w innych tkankach, w tym w mózgu, grzebieniu neuralnym i mezenchymie periotycznym, wpływających na rozwój ucha wewnętrznego (Barald and Kelley, 2004).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wyciągacz elektrod Sutter P-97	Sprzęt
Pneumatyczna mikropompka PV820 PicoPump	Sprzęt	World Precision Instruments, Inc.
Manualny mikromanipulator M3301L	Sprzęt	World Precision Instruments, Inc.
stereomikroskop Leica S6D	Sprzęt
Zabezpieczenie elektroporatora prostokątnych impulsów CUY-21 Edit	Sprzęt
mikroskop konfokalny Olympus FV500	Sprzęt
drut platynowy 0,01 cala	Zaopatrzenie	A-M Systems	711000
Rurki termokurczliwe	Materiały i odczynniki	Newark Inc	03F3172
Zacisk krimpujący gniazdowy	Materiały i odczynniki	Digi-Key	82PECT-ND
Naczynia włosowate	Zaopatrzenie	Stoelting Co.	50613
Plastyczna masa modelarska	Odczynniki i materiały
Plastikowe szalki Petri 100 mm	Materiały	Falcon BD
plastikowe płytki 6-dołkowe	Materiały i odczynniki	Falcon BD
MO: 0,3 mM kombinacji dla mif, podobny do MIF MO1, oraz podobny do MIF Zastosowano MO2. MO przeciwko Mif jest komplementarne do kodonu startowego ryby danio przebrzuchłej mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’Użyto dwóch mikroorganizmów do podobny do MIF. podobny do MIF MO1 jest komplementarny do miejsca startu translacji: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’podczas gdy podobny do MIF MO2 pochodząca z sekwencji AS na granicy intronu 1/eksonu 2: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’Kontrolnym MO była sekwencja nukleotydowa typu scrambled firmy Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’. błękit metylenowy (0,3 ppm) w wodzie dla ryb MS222 (trikaina, Sigma; 0,64 mM w wodzie dla ryb) agaroza niskotopliwa (LMPA; Roche) czerwień fenolowa (Sigma) Przeciwciało przeciwko acetylowanej tubulinie (Sigma) Alexa Fluor® 488 kozie przeciwciało przeciwko mysim przeciwciałom wtórnym (Molecular probes) Texas red-falloidyna (Molecular Probes)