Opracowaliśmy model naprzemiennego odciążenia kończyn tylnych u myszy. Główną zaletą naszej metody odciążania kończyn tylnych z wykorzystaniem pierścienia ogonowego w stosunku do konwencjonalnej techniki trakcji ogona Morey-Holton jest prosta i bezpośrednia procedura, która minimalizuje stres u zwierzęcia.
Artykuł metodologiczny
Alternatywna metoda dla tradycyjnego modelu odciążenia kończyn tylnych według NASA u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda Morey-Holton odciążania kończyn tylnych (HU) jest powszechnie akceptowanym modelem naziemnym Narodowej Agencji Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA) służącym do badania zaniku z nieużywania u gryzoni 4-6. W naszym badaniu oceniono alternatywną metodę względem uznawanej za złoty standard techniki Morey-Holton HU polegającej na trakcji ogona u myszy. Pięćdziesiąt cztery samice myszy (w wieku 4-8 mies.) poddano procedurze HU przez 14 dni (n=34) lub 28 dni (n=20). Regenerację po HU oceniono po 3 dniach normalnego poruszania się w klatce po zakończeniu HU (n=22). Myszy w tym samym wieku (n=76) służyły jako kontrole obciążeniowe.
Przed HU utworzono pierścień ogonowy za pomocą sterylnego drutu chirurgicznego ze stali o rozmiarze 2-0, który przeprowadzono przez 5., 6. lub 7. przestrzeń międzykręgową i uformowano w pierścień, na którym zawieszono myszy. Lokalizację kręgu dla pierścienia ogonowego wybrano tak, aby odpowiednio zrównoważyć masę ciała zwierzęcia, nie zakłócając procesu defekacji.
Skuteczność tej nowej techniki HU ocenialiśmy poprzez pomiar masy ciała przed i po HU, stopień zaniku mięśnia soleus oraz masę nadnerczy po HU. Masa ciała myszy przed HU (24,3 ± 2,9g) nie spadła znacząco bezpośrednio po 14 dniach HU (22,7 ± 1,9g), 28 dniach HU (21,3 + 2,1g) ani po 3 dniach rekonwalescencji (24,0 ± 1,8g). Masa mięśnia soleus uległa znacznemu spadkowi (-39,1% i -46,6%) odpowiednio po 14 i 28 dniach HU (p<0,001). Po 3 dniach rekonwalescencji masa mięśnia soleus znacząco wzrosła do 74% wartości kontrolnych. Masa nadnerczy myszy poddanych HU nie różniła się od masy nadnerczy myszy z grupy kontrolnej.
O skuteczności naszej nowej metody HU świadczy utrzymanie masy ciała zwierząt, porównywalna masa nadnerczy oraz zanik mięśnia soleus po zastosowaniu HU, co odpowiada oczekiwanym wartościom literaturowym 2, 7, 8. Głównymi zaletami tej metody HU są: 1) łatwość badania ogona podczas zawieszenia; 2) zmniejszone prawdopodobieństwo wystąpienia sinicy, stanu zapalnego i/lub martwicy ogonów, często obserwowane przy mocowaniu ogona taśmą podczas HU; 3) brak możliwości przegryzienia przez myszy taśmy trakcyjnej i wypadnięcia z aparatury do zawieszenia; oraz 4) szybka rekonwalescencja i normalna aktywność w klatce bezpośrednio po HU.
Protokół
Instrumenty i materiały przedoperacyjne
- Obcinaczki do drutu/szczypce
- Gaziki 2 x 2"
- Podkładka grzewcza
- Klejnotki z azotanu srebra
- Sterylne rękawiczki chirurgiczne
- Izofluran (anestetyk do inhalacji)
- Gluconian chlorheksydyny 4% (antyseptyczny środek do mycia chirurgicznego)
- Sterylna stalowa nić chirurgiczna 2-0
- Igła o rozmiarze 25 X 5/8 A (autoklawowana)
- Kleszczyki hemostatyczne (autoklawowane)
- Stalowa nić chirurgiczna
Procedura chirurgiczna
- Przygotuj pole sterylne. Postępuj zgodnie z procedurą sterylną.
- Zanestezjować mysz przy użyciu 2–3% izofluranu.
- Umieść mysz na podkładce grzewczej.
- Umyj ogon roztworem chlorheksydyny.
- Zlokalizuj 5, 6 lub 7th przestrzeń międzykręgowa (między dwoma kostnymi wypustkami na ogonie, licząc od końca owłosienia ciała, u nasady ogona).
- Użyj hemostatu i igły 25G, aby wykonać otwór prowadzący między dwoma kręgami, w przestrzeni międzykręgowej.
- Za pomocą obcinaczek do drutu odetnij stalową nici szwy o długości 10 cm.
- Usuń igłę i przełóż stalową nicią przez otwór, pozostawiając 5 cm nici na obu końcach.
- Każda strona ogona powinna mieć dodatkowe 5 cm szwu.
- Przyłóż opuszkę kciuka do ogona.
- Używając wolnej ręki, nawiń stalową nić chirurgiczną na opuszkę kciuka i skręć końce, aby utworzyć dużą pętlę. Część okrągła lub pętla powinna mieć długość + 3 mm.
- Usuń kciuk.
- Zaciśnij jeden koniec nici chirurgicznej za pomocą hemostatu i wygnij go w mniejszą pętlę, której końcówkę należy przymocować jak najbliżej splotu pierwotnej dużej pętli.
- Odetnij nadmiar drutu i zegnij skręcony drut z powrotem.
- W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia można je zatamować za pomocą patyczków z azotanem srebra.
- Wyłącz isofluran i umieść mysz w pojedynczej klatce domowej w celu rekonwalescencji przez 5–7 dni przed odciążeniem kończyn tylnych. Pierścienie ogonowe mogą się zaplątać, jeśli w jednej klatce umieści się więcej niż jedną mysz.
1. Procedura odciążenia kończyn tylnych
Materiały
- Śruby maszynowe rozmiar 10-24 X 4, jedna na zwierzę.
- Nylonowa nakrętka samoblokująca rozmiar 10-24, jedna na zwierzę.
- Nakrętka motylkowa rozmiar 10 X 24, dwie na zwierzę.
- Podkładka rozmiar ¼ X 1, dwie na zwierzę.
- Krętlik wędkarski z karabińczykiem rozmiar #6, 1-11/16", jeden na zwierzę.
- Metalowa szpulka do maszyny do szycia. Jedna na zwierzę.
- Mały spinacz biurowy do wykonania haka w kształcie litery S, jeden na zwierzę.
- Szczypce.
- Gaza 2 x 2".
- Czarne metalowe żabki do papieru 2".
- Taśma armatnia/taśma laboratoryjna.
- Pozinkowany szczelinowy pręt stalowy 1-3/8", który wystaje nieco poza całkowitą długość klatki.
- Klatka 50cm X 40cm X 20cm (klatka dla szczurów).
- Butelka z wodą z wygiętą rurką.
- Drut ze stali nierdzewnej w kształcie litery U do podparcia butelki z wodą.
Przygotowanie klatek
- Połóż stalowy pręt szczelinowy o długości 1-38" na górnej części klatki i przymocuj go tymczasowo taśmą naprawczą.
- Nakręć jedną nakrętkę motylkową na śrubę maszynową, załóż podkładkę, a następnie przełóż śrubę maszynową przez szczelinową płytę stalową w odległości ok. 15 cm od krawędzi klatki.
- Dodaj kolejną podkładkę i nakrętkę motylkową. Dokręć obie nakrętki, ale nie rób tego całkowicie, ponieważ później konieczne będą regulacje.
- Przełóż śrubę maszynową przez otwór centralny szpulki.
- Aby zapobiec spadnięciu szpulki, nakręć nylonową nakrętkę samokontrującą na koniec śruby maszynowej. Szpulka powinna obracać się swobodnie.
- Przełóż karabińczyk z obrotu wędkarskiego przez dolną część szpulki.
- Używając szczypiec, uformuj z klipsa do papieru haczyk w kształcie litery S (odetnij 2 cm z klipsa, aby uformować haczyk).
- Wsuń jeden koniec haczyka w kształcie litery S przez otwór obrotu wędkarskiego i zaciśnij go szczypcami.
- Umieść drut w kształcie litery U równolegle do śruby maszynowej od wewnętrznej strony klatki i odegnij końce, aby mogły podtrzymać pełną butelkę z wodą.
- Wsuń butelkę z wodą w drut w kształcie litery U, tak aby kranek był skierowany w dół, ale nie dotykał dna.
- Odegnij 2" żabkę biurową tak, aby nie mogła się całkowicie zamknąć. Zastosuj na tyle napięcia, aby utrzymać w niej od 3 do 4 kawałków pokarmu bez ich wypadania. Zapobiegnie to zmiażdżeniu pokarmu przez siłę docisku żabki lub przytrzaśnięciu nosa myszy.
- Umieść od 3 do 4 kawałków karmy dla gryzoni w żabce biurowej.
Odciążenie kończyn tylnych myszy
- Wsuń otwarty koniec haka w kształcie litery S przez mniejszy pierścień obrączki ogonowej.
- Wyreguluj wysokość myszy, dokręcając lub luzując dolną nakrętkę skrzydłową na śrubie maszynowej. Kończyny dolne nie powinny przenosić ciężaru ciała. Po uzyskaniu optymalnej wysokości dokręć górną nakrętkę skrzydłową.
- Przestaw butelkę z wodą i drut w kształcie litery U w taki sposób, aby mysz nie mogła wspiąć się kończynami tylnymi na kranik. Przymocuj butelkę z wodą do boku klatki za pomocą taśmy Duct tape.
- Umieść zacisk sprężynowy z pokarmem na dnie klatki w taki sposób, aby mysz nie mogła się na niego wspiąć; przymocuj go taśmą Duct tape.
- Powtórz tę samą procedurę, jeśli po drugiej stronie klatki odciążone są kończyny tylne więcej niż jednego zwierzęcia. Umieść dwa zwierzęta w jednej klatce; rozmieść je tak, aby niemal mogły się ze sobą dotykać.
- Użyj gazy 2 X 2, aby luźno owinąć ogon myszy wokół obrotowej spławikowej kotwicy. Użyj małego kawałka taśmy, aby owinąć gazę, mocując ją do ogona. Krok ten jest istotny, aby zapobiec opadaniu ogona w dół, co mogłoby prowadzić do gromadzenia się krwi w jego końcówce i w konsekwencji do martwicy ogona.
- Wsyp do klatki niewielką ilość ściółki z kukurydzy (cob bedding). Nie dodawaj zbyt dużo ściółki, w przeciwnym razie mysz uformuje z niej kopiec i spróbuje obciążyć kończyny tylne na ściółce.
2. Reprezentatywne wyniki:
Aby potwierdzić skuteczność techniki HU z wykorzystaniem pierścienia na ogonie, zmierzono masę ciała zwierząt przed operacją założenia pierścienia, przed i po zastosowaniu HU oraz po regeneracji; masę mięśnia płaszczowatego oraz masę nadnerczy we wszystkich grupach.
Masa ciała myszy w trakcie całego eksperymentu przedstawiona jest na Rysunku 1. Masa ciała myszy przed operacją założenia pierścienia na ogonie (24,7 ± 3,5g) nie różniła się znacząco po 5 dniach rekonwalescencji po zabiegu (24,3 ± 2,9g) przed podaniem HU. Masa ciała nie spadła również istotnie bezpośrednio po 14 dniach HU (22,7 ± 1,9g), 28 dniach HU (21,3 + 2,1g) ani po 3 dniach rekonwalescencji po HU (24,0 ± 1,8g). Chociaż HU przez 14 i 28 dni spowodowało niewielki (-6,8% i 12%), ale nieistotny statystycznie spadek masy ciała, myszy całkowicie odzyskały masę ciała sprzed podania HU po 3 dniach rekonwalescencji. Zużycie pokarmu przez myszy kontrolne i myszy HU przedstawiono na Rysunku 3. Średnie dzienne spożycie pokarmu u myszy HU w ciągu 28 dni nie różniło się w porównaniu z grupą kontrolną.
Zaobserwowaliśmy znaczną atrofię mięśnia płaszczowatego po HU trwającej 14 i 28 dni (-39,1% oraz -46,6%), co wskazuje na skuteczność procedury HU (Rysunek 2). Co więcej, stopień tej atrofii jest zgodny z wartościami oczekiwanymi w literaturze dla 2–4 tygodni HU 2, 7, 8. Po 3 dniach regeneracji po HU masa mięśnia płaszczowatego znacząco wzrosła do 74% wartości grupy kontrolnej. Masa mięśnia płaszczowatego w grupie regeneracji była znacząco większa niż w obu grupach HU, lecz nadal znacząco mniejsza niż u zwierząt kontrolnych w stanie ambulatoryjnym.
Masy nadnerczy zmierzono jako wskaźnik stresu zwierząt; wycignięto i zważono oba nadnercza, lewy i prawy. Średnie masy były porównywalne dla myszy kontrolnych oraz myszy HU we wszystkich grupach (Rysunek 4).
Wcześniej wykazaliśmy u szczurów, że współczynnik sukcesu, określony jako liczba zwierząt na początku HU w stosunku do liczby zwierząt, które ukończyły HU bez wypadnięcia z aparatury zawieszeniowej (na skutek przegryzienia przez zwierzęta taśmy trakcyjnej ogona), wyniósł 10 z 12 przy zastosowaniu techniki Morey-Holton 1. Żadne z myszy (n=54) w niniejszym badaniu nie spadło z zawieszenia przed zakończeniem okresu HU. Odnotowaliśmy jednak przypadek jednej myszy, u której rozwinął się silny stan zapalny ogona. Gdy stan zapalny stał się widoczny, usunęliśmy pierścień ogonowy, aby umożliwić zagojenie się zapalonego obszaru, a następnie założyliśmy kolejny pierścień ogonowy, aby dokończyć czas trwania HU.
W przeszłości, stosując metodę Morey-Holtona w odniesieniu do HU, zazwyczaj eliminowaliśmy 1-2 myszy na grupę z powodu ich wydostania się z aparatury zawieszeniowej. Przy zastosowaniu metody z pierścieniem szlakowym nie odnotowano przypadków przypadkowego wydostania się myszy z aparatury HU podczas okresu HU trwającego 14 lub 28 dni (n=54 myszy).
Rysunek 1. Zmiany masy ciała (średnia ± SD). Skróty: CON: kontrolne myszy obciążone (n=76); Pre-HU: wszystkie myszy przed HU (n=54); HU14: myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); REC: myszy po odciążeniu kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). Nie zaobserwowano istotnych różnic w masie ciała pomiędzy grupami.
Rycina 2. Zanik mięśnia płaszczkowatego (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne obciążone (n=76); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); oraz REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). *Istotna różnica (p<0.001) w stosunku do grupy kontrolnej obciążonej (CON). δIstotna różnica (p<0.01) w stosunku do obu grup HU.
Rysunek 3. Spożycie pokarmu (średnia ± SD). Średnie dzienne spożycie pokarmu (g/dobę) podczas obciążania kończyn oraz odciążenia kończyn tylnych. Skróty: CON: myszy kontrolne obciążające kończyny (n=76); HU: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14–28 dni. Nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy grupami CON i HU.
Rycina 4. Masa nadnerczy (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne z obciążeniem kończyn (n=76); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); oraz REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami.
Dyskusja
Oceniliśmy alternatywną metodę odciążania kończyn tylnych u myszy, która w naszej ocenie okazała się bardzo skuteczna. Opisana tutaj metoda pierścienia ogonowego została zastosowana do długotrwałego zawieszenia kończyn tylnych oraz do badania regeneracji po HU. W każdym z tych przypadków nie stwierdzono braku adaptacji, co potwierdziły stabilne spożycie pokarmu, masa ciała oraz masa nadnerczy myszy. Ta technika HU z użyciem pierścienia ogonowego jest łatwa do wykonania i może zostać szybko wdrożona przy minimalnym doświadczeniu chirurgicznym.
Metoda pierścienia ogonowego posiada kilka zalet w porównaniu do tradycyjnej metody Morey-Holton 5, 6. Po pierwsze, skóra oraz miejsce implantacji pierścienia na ogonie są zawsze widoczne, dzięki czemu w przypadku wystąpienia problemów jest to zauważalne natychmiast, a nie dopiero pod koniec okresu zawieszenia. Po drugie, zwierzęta nie są w stanie wydostać się z aparatury do zawieszenia w żadnym momencie podczas HU, co eliminuje konieczność decydowania, czy dana mysz powinna pozostać w zbiorze danych. Ponadto myszy nie wykazują zainteresowania aparaturą pierścieniową i po zwolnieniu z HU w celu rekonwalescencji nie uszkadzają swoich ogonów, co pozwala na płynną fazę regeneracji po HU. Wreszcie, myszy z odciążonymi kończynami tylnymi przy zastosowaniu metody pierścienia ogonowego lepiej utrzymują masę ciała niż myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych techniką trakcji ogona Morey-Holton. W naszych badaniach po 14 dniach HU zaobserwowaliśmy niewielki (-6,8%), ale nieistotny statystycznie spadek masy ciała. Tymczasem Ingalls et al. zaobserwowali istotny spadek masy ciała o -12% u myszy po 14 dniach HU metodą Morey-Holton 3. Choć Ingalls nie podał masy nadnerczy, wydaje się, że nasza metoda pierścienia ogonowego wywołuje mniejszy stres u myszy (masa nadnerczy u naszych myszy HU nie różni się od grupy kontrolnej) i zapewnia lepsze utrzymanie masy ciała przez cały okres odciążenia kończyn tylnych.
Podsumowując, opracowano i przetestowano metodę odciążenia kończyn tylnych z wykorzystaniem pierścienia ogonowego na myszach poddanych HU przez 14 i 28 dni, a także na myszach poddanych 3-dniowej rekonwalescencji w klatkach po HU. Na podstawie masy nadnerczy, masy ciała oraz spożycia pokarmu można stwierdzić, że myszy dobrze zaadaptowały się do aparatury z pierścieniem ogonowym. Metoda odciążenia kończyn tylnych z użyciem pierścienia ogonowego stanowi użyteczną i prostą alternatywę dla tradycyjnej techniki odciążania kończyn tylnych Moreya-Holtona.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Andrew J. Dunnowi, wybitnemu studentowi studiów licencjackich prowadzącemu badania w naszym laboratorium, za pomoc techniczną i opiekę nad zwierzętami. Praca ta była finansowana z grantu National Institute of Health HD058834 oraz stypendium University of Missouri Life Sciences Fellowship.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Obcinaczki do drutu/kombinerki | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gaza | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Podkładka grzewcza | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Aplikatory z azotanu srebra | ARZOL | 0001-2 | |
| Izofluran, USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Gluconian chlorheksydyny 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterylna stalowa nić chirurgiczna 2-0 | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| Igła rozmiar 25 G, 5/8 cala | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/uchwyt do igieł | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Wkręty maszynowe rozmiar 10-24 X 4 | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylatowa nakrętka samokontrująca rozmiar 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Nakrętka motylkowa rozmiar 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Podkładka szeroka rozmiar ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Krętlik wędkarski z karabińczykiem rozmiar #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metalowa szpulka do maszyny do szycia | Singer Instruments | 45785 | |
| Spinacz do papieru | Office Depot | 221720 | |
| Czarne żabki do papieru 2” | Office Depot | 308957 | |
| Wielofunkcyjna taśma naprawcza Scotch Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| Pozłacana szczelinowa stalowa szyna 1-3/8” | Home Depot | 548932 | Wystaje nieco poza pełną długość klatki |
| Klatka 50cm X 40cm X 20cm (klatka dla szczurów) | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Butelka z wodą | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Drut ze stali nierdzewnej | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | Drut w kształcie litery U do podparcia butelki z wodą |
Bibliografia
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
- Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
- Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
- Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
- Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).
Przedruki i uprawnienia
