Alternatywna metoda dla tradycyjnego modelu odciążenia kończyn tylnych według NASA u myszy

Podsumowanie

Opracowaliśmy model naprzemiennego odciążenia kończyn tylnych u myszy. Główną zaletą naszej metody odciążania kończyn tylnych z wykorzystaniem pierścienia ogonowego w stosunku do konwencjonalnej techniki trakcji ogona Morey-Holton jest prosta i bezpośrednia procedura, która minimalizuje stres u zwierzęcia.

Streszczenie

Metoda Morey-Holton odciążania kończyn tylnych (HU) jest powszechnie akceptowanym modelem naziemnym Narodowej Agencji Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA) służącym do badania zaniku z nieużywania u gryzoni ^4-6. W naszym badaniu oceniono alternatywną metodę względem uznawanej za złoty standard techniki Morey-Holton HU polegającej na trakcji ogona u myszy. Pięćdziesiąt cztery samice myszy (w wieku 4-8 mies.) poddano procedurze HU przez 14 dni (n=34) lub 28 dni (n=20). Regenerację po HU oceniono po 3 dniach normalnego poruszania się w klatce po zakończeniu HU (n=22). Myszy w tym samym wieku (n=76) służyły jako kontrole obciążeniowe.

Przed HU utworzono pierścień ogonowy za pomocą sterylnego drutu chirurgicznego ze stali o rozmiarze 2-0, który przeprowadzono przez 5^., 6^. lub 7^. przestrzeń międzykręgową i uformowano w pierścień, na którym zawieszono myszy. Lokalizację kręgu dla pierścienia ogonowego wybrano tak, aby odpowiednio zrównoważyć masę ciała zwierzęcia, nie zakłócając procesu defekacji.

Skuteczność tej nowej techniki HU ocenialiśmy poprzez pomiar masy ciała przed i po HU, stopień zaniku mięśnia soleus oraz masę nadnerczy po HU. Masa ciała myszy przed HU (24,3 ± 2,9g) nie spadła znacząco bezpośrednio po 14 dniach HU (22,7 ± 1,9g), 28 dniach HU (21,3 + 2,1g) ani po 3 dniach rekonwalescencji (24,0 ± 1,8g). Masa mięśnia soleus uległa znacznemu spadkowi (-39,1% i -46,6%) odpowiednio po 14 i 28 dniach HU (p<0,001). Po 3 dniach rekonwalescencji masa mięśnia soleus znacząco wzrosła do 74% wartości kontrolnych. Masa nadnerczy myszy poddanych HU nie różniła się od masy nadnerczy myszy z grupy kontrolnej.

O skuteczności naszej nowej metody HU świadczy utrzymanie masy ciała zwierząt, porównywalna masa nadnerczy oraz zanik mięśnia soleus po zastosowaniu HU, co odpowiada oczekiwanym wartościom literaturowym ^{2, 7, 8}. Głównymi zaletami tej metody HU są: 1) łatwość badania ogona podczas zawieszenia; 2) zmniejszone prawdopodobieństwo wystąpienia sinicy, stanu zapalnego i/lub martwicy ogonów, często obserwowane przy mocowaniu ogona taśmą podczas HU; 3) brak możliwości przegryzienia przez myszy taśmy trakcyjnej i wypadnięcia z aparatury do zawieszenia; oraz 4) szybka rekonwalescencja i normalna aktywność w klatce bezpośrednio po HU.

Protokół

Instrumenty i materiały przedoperacyjne

• Obcinaczki do drutu/szczypce
• Gazy 2 x 2"
• Podkładka grzewcza
• Patyczki z azotanem srebra
• Sterylne rękawiczki chirurgiczne
• Isoflurane – anestetyk wziewny
• Gluconian chlorhexydyny 4% (antyseptyczny środek do mycia chirurgicznego)
• Sterylna stalowa nić chirurgiczna 2-0
• Igła o rozmiarze 25 X 5/8 A (autoklawowana)
• Kleszczyki hemostatyczne (autoklawowane)
• Stalowa nić chirurgiczna

Procedura chirurgiczna

1. Przygotuj sterylne pole. Postępuj zgodnie z procedurą sterylną.
2. Zanurz mysz w narkozie z użyciem 2 - 3% izofluranu.
3. Umieść mysz na podkładce grzewczej.
4. Przeszoruj ogon roztworem chlorheksydyny.
5. Zlokalizuj 5., 6. lub 7.^ną przestrzeń międzykręgową (między dwoma kostnymi wypustkami na ogonie, licząc od końca owłosienia ciała, u nasady ogona).
6. Użyj kleszczyków hemostatycznych i igły 25G, aby wykonać otwór pilotujący między dwoma kręgami, w przestrzeni międzykręgowej.
7. Użyj obcinaczy do drutu, aby odciąć stalową nici chirurgiczną o długości 10 cm.
8. Wyjmij igłę i wprowadź stalową nić przez otwór, tak aby po obu stronach ogona pozostało po 5 cm nici.
9. Z każdej strony ogona powinno wystawać + 5 cm nici.
10. Przyłoź opuszkę kciuka do ogona.
11. Wolną ręką nawiń stalową nić na opuszkę kciuka i skręć końce, aby utworzyć dużą pętlę. Część okrężna powinna mieć długość + 3 mm.
12. Zabierz kciuk.
13. Zaciśnij kleszczykami hemostatycznymi jeden koniec nici i zegnij go w mniejszą pętlę, której koniec zostanie przymocowany jak najbliżej splotu oryginalnej dużej pętli.
14. Odetnij nadmiar drutu i zegnij skręcony drut z powrotem.
15. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia można je zatamować za pomocą patyczków z azotanem srebra.
16. Wyłącz dopływ izofluranu i umieść mysz w pojedynczej klatce, aby mogła dojść do siebie przez 5-7 dni przed odciążeniem kończyn tylnych. Pierścienie na ogonach mogą się zaplątać, jeśli w jednej klatce przebywa więcej niż jedna mysz.

1. Procedura odciążenia kończyn tylnych

Materiały

• Śruby maszynowe rozmiar 10-24 X 4, jedna na zwierzę.
• Nylony nakrętka samokontrująca rozmiar 10-24, jedna na zwierzę.
• Nakrętka motylkowa rozmiar 10 X 24, dwie na zwierzę.
• Podkładka rozmiar ¼ X 1, dwie na zwierzę.
• Wirnik wędkarski z karabińczykiem rozmiar #6, 1-11/16", jeden na zwierzę.
• Metalowa szpulka do maszyny do szycia. Jedna na zwierzę.
• Mały spinacz biurowy jako hak w kształcie litery S, jeden na zwierzę.
• Szczypce.
• Gaza 2 x 2".
• Czarne klamry do papieru 2".
• Taśma naprawcza/taśma laboratoryjna.
• Ocynkowany szczelinowy pręt stalowy 1-3/8", wystający nieco poza całkowitą długość klatki.
• Klatka 50cm X 40cm X 20cm (klatka dla szczurów).
• Butelka z wodą z wygiętą rurką.
• Drut ze stali nierdzewnej w kształcie litery U do podtrzymywania butelki z wodą.

Przygotowanie klatek

1. Połóż poszpaltowaną stalową szynę o długości 1-38" na górnej części klatki i przymocuj ją tymczasowo taśmą naprawczą.
2. Nakręć jedną nakrętkę motylową na śrubę maszynową, załóż podkładkę, a następnie przełóż śrubę maszynową przez otwór w poszpaltowanej stalowej szynie w odległości ± 15 cm od krawędzi klatki.
3. Załóż kolejną podkładkę i nakrętkę motylową. Dokręć obie nakrętki motylowe, ale nie rób tego całkowicie, ponieważ później konieczne będą regulacje.
4. Wsuń śrubę maszynową przez otwór centralny szpulki.
5. Aby zapobiec spadnięciu szpulki, nakręć nylonową nakrętkę samokontrującą na koniec śruby maszynowej. Szpulka powinna obracać się swobodnie.
6. Wsuń karabińczyk z obrotka wędkarskiego przez dolną część szpulki.
7. Za pomocą szczypiec uformuj z klipsa do papieru haczyk w kształcie litery S. (Odetnij 2 cm klipsa, aby utworzyć haczyk).
8. Wsuń jeden koniec haczyka w kształcie litery S przez otwór obrotka wędkarskiego i zaciśnij go szczypcami.
9. Umieść drut w kształcie litery U równolegle do śruby maszynowej od wewnętrznej strony klatki i zegnij końce do tyłu, aby mogły podtrzymać pełną butelkę z wodą.
10. Wsuń butelkę z wodą w drut w kształcie litery U tak, aby kurek był skierowany w dół, ale nie dotykał dna.
11. Rozegnij 2" zacisk biurowy tak, aby nie mógł się całkowicie zamknąć. Napięcie powinno być wystarczające, aby utrzymać 3 do 4 kawałków pokarmu bez ich wypadania. Zapobiegnie to zmiażdżeniu pokarmu przez siłę zacisku lub przytrzaśnięciu nosa myszy.
12. Umieść 3 do 4 kawałków karmy dla gryzoni w zacisku biurowym.

Odciążenie kończyn tylnych myszy

1. Wprowadź otwarty koniec haczyka w kształcie litery S przez mniejszy pierścień obręczy ogonowej.
2. Wyreguluj wysokość myszy, dokręcając lub luzując dolną nakrętkę skrzydłową na śrubie maszynowej. Kończyny dolne nie powinny przenosić ciężaru ciała. Po osiągnięciu optymalnej wysokości dokręć górną nakrętkę skrzydłową.
3. Ustaw butelkę z wodą i drut w kształcie litery U w taki sposób, aby mysz nie mogła wspiąć się tylnymi kończynami na kranik. Przymocuj butelkę z wodą do boku klatki za pomocą taśmy naprawczej.
4. Umieść zacisk biurowy z pokarmem na dnie klatki w taki sposób, aby mysz nie mogła się na niego wspiąć; przymocuj go taśmą naprawczą.
5. Powtórz tę samą procedurę, jeśli po drugiej stronie klatki odciążone są tylne kończyny więcej niż jednego zwierzęcia. Umieść dwa zwierzęta w jednej klatce; rozmieść je tak, aby niemal się dotykały.
6. Użyj gazy 2 X 2, aby luźno owinąć ogon myszy wokół obrotowego ogniwa wędkarskiego. Użyj małego kawałka taśmy, aby owinąć gazę i przymocować ją do ogona. Krok ten jest istotny, aby zapobiec opadaniu ogona w dół, co mogłoby prowadzić do zastoju krwi w jego końcówce i martwicy ogona.
7. Wsyp do klatki niewielką ilość ściółki z kukurydzy. Nie dodawaj zbyt dużo ściółki, w przeciwnym razie mysz uformuje z niej kopiec i będzie próbowała oprzeć na nim tylne kończyny.

2. Reprezentatywne wyniki:

Aby potwierdzić skuteczność techniki podawania HU poprzez pierścień ogonowy, zmierzono masę ciała zwierząt przed operacją wszczepienia pierścienia, a także przed i po podaniu HU oraz po regeneracji; zmierzono również masę mięśnia płaszczowatego oraz masę nadnerczy we wszystkich grupach.

Masa ciała myszy w trakcie trwania eksperymentu została przedstawiona na Rysunku 1. Masa ciała myszy przed operacją założenia pierścienia na ogonie (24.7 ± 3.5g) nie różniła się istotnie po 5 dniach rekonwalescencji po zabiegu (24.3 ± 2.9g) przed zastosowaniem HU. Masa ciała nie spadła również istotnie bezpośrednio po 14 dniach HU (22.7 ± 1.9g), 28 dniach HU (21.3 + 2.1g) ani po 3 dniach rekonwalescencji po HU (24.0 ± 1.8g). Chociaż HU przez 14 i 28 dni spowodowały niewielki (-6.8% i 12%), lecz nieistotny spadek masy ciała, myszy całkowicie powróciły do masy ciała sprzed HU po 3 dniach rekonwalescencji. Zużycie pokarmu u myszy kontrolnych poruszających się oraz myszy poddanych HU przedstawiono na Rysunku 3. Średnie dzienne spożycie pokarmu u myszy HU w ciągu 28 dni nie różniło się w porównaniu z grupą kontrolną.

Zaobserwowano istotny zanik mięśnia płaszczowatego po 14 i 28 dniach HU (-39,1% oraz -46,6%), co wskazuje na skuteczność procedury HU (Rycina 2). Ponadto stopień tego zaniku jest zgodny z oczekiwanymi wartościami literaturowymi dla 2–4 tygodni HU ^{2, 7, 8}. Po 3 dniach regeneracji po HU masa mięśnia płaszczowatego istotnie wzrosła do 74% wartości kontrolnych. Masa mięśnia płaszczowatego w grupie regeneracyjnej była istotnie większa niż w obu grupach HU, lecz wciąż istotnie mniejsza niż u zwierząt kontrolnych poruszających się swobodnie.

Masę nadnerczy zmierzono jako wskaźnik stresu zwierząt; wycięto i zważono oba nadnercza (lewy i prawy). Średnie masy były porównywalne dla myszy kontrolnych i myszy HU we wszystkich grupach (Rysunek 4).

Wcześniej wykazaliśmy u szczurów, że wskaźnik sukcesu, określony jako liczba zwierząt na początku HU w stosunku do liczby zwierząt, które ukończyły HU bez wypadnięcia z aparatury zawieszeniowej (na skutek przegryzienia przez zwierzęta taśmy trakcyjnej ogona), wyniósł 10 z 12 przy zastosowaniu techniki Morey-Holtona ¹. Żadne z myszy (n=54) w niniejszym badaniu nie spadło z zawieszenia przed zakończeniem okresu HU. Odnotowaliśmy jednak przypadek jednej myszy, u której rozwinął się silny stan zapalny ogona. Gdy stan zapalny stał się widoczny, usunęliśmy pierścień ogonowy, aby umożliwić zagojenie się zmienionego obszaru, a następnie założyliśmy kolejny pierścień ogonowy, aby dokończyć czas trwania HU.

W przeszłości, stosując metodę Morey-Holton w badaniach HU, zazwyczaj eliminowaliśmy 1-2 myszy na grupę z powodu ich wydostania się z aparatury zawieszeniowej. W przypadku metody z pierścieniem prowadzącym nie odnotowano żadnych przypadków przypadkowego wydostania się myszy z aparatury HU podczas okresu HU trwającego 14 lub 28 dni (n=54 myszy).

Rycina 1. Zmiany masy ciała (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne obciążone (n=76); Pre-HU: wszystkie myszy przed HU (n=54); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). Nie zaobserwowano istotnych różnic w masie ciała pomiędzy grupami.

Rysunek 2. Zanik mięśnia płaszczowatego (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne obciążone (n=76); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); oraz REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). *Istotnie różni się (p<0,001) od kontroli obciążonej (CON). δIstotnie różni się (p<0,01) od obu grup HU.

Rysunek 3. Spożycie pokarmu (średnia ± SD). Średnie dzienne spożycie pokarmu (g/dobę) podczas obciążania kończyn oraz odciążenia kończyn tylnych. Skróty: CON: myszy kontrolne obciążające kończyny (n=76); HU: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14–28 dni. Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami CON i HU.

Rycina 4. Masa nadnerczy (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne obciążone kończynami (n=76); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20) oraz REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami.

Dyskusja

Oceniliśmy alternatywną metodę odciążania kończyn tylnych u myszy, która w naszej ocenie okazała się bardzo skuteczna. Opisana tutaj metoda pierścienia ogonowego została zastosowana do długotrwałego zawieszenia kończyn tylnych oraz do badania regeneracji po HU. W każdym z tych przypadków nie stwierdzono braku adaptacji, co potwierdziły stabilne spożycie pokarmu, masa ciała oraz masa nadnerczy myszy. Ta technika HU z użyciem pierścienia ogonowego jest łatwa do wykonania i może zostać szybko wdrożona przy minimalnym doświadczeniu chirurgicznym.

Metoda pierścienia ogonowego posiada kilka zalet w porównaniu do tradycyjnej metody Morey-Holton ^{5, 6}. Po pierwsze, skóra oraz miejsce implantacji pierścienia na ogonie są zawsze widoczne, dzięki czemu w przypadku wystąpienia problemów jest to zauważalne natychmiast, a nie dopiero pod koniec okresu zawieszenia. Po drugie, zwierzęta nie są w stanie wydostać się z aparatury do zawieszenia w żadnym momencie podczas HU, co eliminuje konieczność decydowania, czy dana mysz powinna pozostać w zbiorze danych. Ponadto myszy nie wykazują zainteresowania aparaturą pierścieniową i po zwolnieniu z HU w celu rekonwalescencji nie uszkadzają swoich ogonów, co pozwala na płynną fazę regeneracji po HU. Wreszcie, myszy z odciążonymi kończynami tylnymi przy zastosowaniu metody pierścienia ogonowego lepiej utrzymują masę ciała niż myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych techniką trakcji ogona Morey-Holton. W naszych badaniach po 14 dniach HU zaobserwowaliśmy niewielki (-6,8%), ale nieistotny statystycznie spadek masy ciała. Tymczasem Ingalls et al. zaobserwowali istotny spadek masy ciała o -12% u myszy po 14 dniach HU metodą Morey-Holton ³. Choć Ingalls nie podał masy nadnerczy, wydaje się, że nasza metoda pierścienia ogonowego wywołuje mniejszy stres u myszy (masa nadnerczy u naszych myszy HU nie różni się od grupy kontrolnej) i zapewnia lepsze utrzymanie masy ciała przez cały okres odciążenia kończyn tylnych.

Podsumowując, opracowano i przetestowano metodę odciążenia kończyn tylnych z wykorzystaniem pierścienia ogonowego na myszach poddanych HU przez 14 i 28 dni, a także na myszach poddanych 3-dniowej rekonwalescencji w klatkach po HU. Na podstawie masy nadnerczy, masy ciała oraz spożycia pokarmu można stwierdzić, że myszy dobrze zaadaptowały się do aparatury z pierścieniem ogonowym. Metoda odciążenia kończyn tylnych z użyciem pierścienia ogonowego stanowi użyteczną i prostą alternatywę dla tradycyjnej techniki odciążania kończyn tylnych Moreya-Holtona.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obcinaczki do drutu/kombinerki	Ace Hardware	84-056
Gaza	Fisher Scientific	22-037-901
Podkładka grzewcza	Sunbeam	Z-1228-001
Aplikatory z azotanu srebra	ARZOL	0001-2
Izofluran, USP	Novaplus	NDC 0409-3292-49
Gluconian chlorheksydyny 4%	Purdue Products L.P.	NDC 67618-200-01
Sterylna stalowa nić chirurgiczna 2-0	Ethicon Inc.	SS-28
Igła rozmiar 25 G, 5/8 cala	Terumo Medical Corp.	NN 2516R
Hemostat/uchwyt do igieł	Fine Science Tools	12500-12
Wkręty maszynowe rozmiar 10-24 X 4	Hillman The Fastener Center	90272
Nylatowa nakrętka samokontrująca rozmiar 10 X 24	Hillman The Fastener Center	180141
Nakrętka motylkowa rozmiar 10 X 24	Hillman The Fastener Center	180243
Podkładka szeroka rozmiar ¼ X 1	Hillman The Fastener Center	290012
Krętlik wędkarski z karabińczykiem rozmiar #6, 1-11/16”	Bass Pro Shop	38-481-554-01
Metalowa szpulka do maszyny do szycia	Singer Instruments	45785
Spinacz do papieru	Office Depot	221720
Czarne żabki do papieru 2”	Office Depot	308957
Wielofunkcyjna taśma naprawcza Scotch Duct Tape	Office Depot	790710
Pozłacana szczelinowa stalowa szyna 1-3/8”	Home Depot	548932	Wystaje nieco poza pełną długość klatki
Klatka 50cm X 40cm X 20cm (klatka dla szczurów)	Alternative Design Manufacturing	RC88D-PC
Butelka z wodą	Alternative Design Manufacturing	WB16FS
Drut ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.	SWX-4029	Drut w kształcie litery U do podparcia butelki z wodą