Komputerowa wizualizacja i kwantyfikacja na dużą skalę masy wysepek trzustkowych, ich rozkładu wielkości oraz architektury

Podsumowanie

Opisano nowatorskie metody wspomagane komputerowo w zakresie wielkoskalowego pozyskiwania i analizy preparatów trzustki barwionych immunohistochemicznie: (1) rejestracja wirtualnych przekrojów (Virtual Slice) całego preparatu; (2) masowa analiza danych w dużej skali; (3) rekonstrukcja 2D wirtualnych przekrojów; (4) mapowanie 3D wysepek trzustkowych oraz (5) analiza matematyczna.

Streszczenie

Wyspa trzustkowa jest unikalnym mikroorganem składającym się z kilku wydzielających hormony komórek endokrynnych, takich jak komórki beta (insulina), komórki alfa (glukagon) i komórki delta (somatostatyna), które są osadzone w tkankach egzokrynnych i stanowią 1-2% całej trzustki. Istnieje ścisła korelacja między masą ciała a masą trzustki. Całkowita masa komórek beta również zwiększa się proporcjonalnie, aby zrekompensować zapotrzebowanie organizmu na insulinę. Wyjątkiem od tej proporcjonalnej ekspansji jest rozkład wielkości wysp. Duże zwierzęta, takie jak ludzie, mają podobny rozkład wielkości wysp co myszy, co sugeruje, że mikroorgan ten ma określoną granicę wielkości niezbędną do prawidłowego funkcjonowania. Niezdolność trzustek dużych zwierząt do generowania proporcjonalnie większych wysp jest rekompensowana przez zwiększenie liczby wysp oraz wzrost proporcji większych wysp w ogólnym rozkładzie ich wielkości. Ponadto wyspy wykazują uderzającą plastyczność w składzie komórkowym i architekturze pomiędzy różnymi gatunkami, a także w obrębie jednego gatunku w różnych warunkach patofizjologicznych. W niniejszym badaniu opisujemy nowe podejścia do analizy danych obrazowania biologicznego w celu ułatwienia automatyzacji procesów analitycznych, co pozwala na analizę dużych i heterogenicznych zbiorów danych w badaniach nad tak dynamicznymi procesami biologicznymi i złożonymi strukturami. Takie badania były utrudnione ze względu na trudności techniczne związane z bezstronnym próbkowaniem oraz generowaniem wielkoskalowych zestawów danych, które precyzyjnie oddawałyby złożoność procesów biologicznych w obrębie biologii wysp. Przedstawiamy tutaj metody zbierania bezstronnych, „reprezentatywnych” danych przy ograniczonej dostępności próbek (lub w celu zminimalizowania ich poboru) i w standardowych warunkach eksperymentalnych, a także precyzyjnej analizy złożonej trójwymiarowej struktury wyspy. Automatyzacja wspomagana komputerowo umożliwia gromadzenie i analizę wielkoskalowych zestawów danych, a także zapewnia bezstronną interpretację wyników. Ponadto precyzyjna kwantyfikacja rozkładu wielkości wysp i ich współrzędnych przestrzennych (tj. pozycji X, Y, Z) nie tylko prowadzi do dokładnej wizualizacji struktury i składu wyspy trzustkowej, ale pozwala nam również identyfikować wzorce podczas rozwoju i adaptacji do zmieniających się warunków za pomocą modelowania matematycznego. Metody opracowane w niniejszym badaniu mają zastosowanie również w badaniach nad wieloma innymi systemami i organizmami.

Protokół

1. Tworzenie wirtualnych przekrojów obrazów barwionych immunohistochemicznie

1. Otwórz program StereoInvestigator. Umieść czyste szkiełko z próbką w uchwycie mikroskopu i zwizualizuj ją w StereoInvestigator, klikając „Acquisition”, a następnie „Live Image” (Acquisition→ Live Image). Określ poziomy ekspozycji dla każdego kanału; w naszym przykładzie kanał 2 jest używany dla DAPI, kanał 3 dla GFP, kanał 4 dla RFP, kanał 5 dla Cy5, a kanał 6 dla Cy7. Do wyznaczenia poziomu ekspozycji użyj okna „Video Histogram”, które wyświetla intensywność fluorescencji. Odpowiednie intensywności fluorescencji są osiągane, gdy intensywność opada na prawym końcu histogramu wideo (Video Histogram). Poziomy ekspozycji można zmieniać w oknie „Camera Settings”. Histogram wideo można ustawić za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu.
2. Przed utworzeniem wirtualnego przekroju (Virtual Slice), obrysuj próbkę, klikając na ekranie w punkcie oddalonym od próbki, co wyznaczy punkt odniesienia, a następnie klikając wzdłuż obrysu próbki. Po zakończeniu obrysowywania kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz „Close Contour”, aby połączyć punkty początkowy i końcowy.
3. Po zamknięciu obrysu wykonaj wirtualny przekrój dla próbki (Acquisition→ Acquire Virtual Slice). Po otwarciu opcji okna wirtualnego przekroju wybierz „High Speed Acquire” oraz automatyczne ostrzenie, odznaczając pole obok opcji „Manual”. Zapisz plik.
4. Wstępne ostrzenie wirtualnego przekroju musi zostać skalibrowane poprzez wybieranie (prawy przycisk myszy→ Add to Focus Site List) i ręczne ustawianie ostrości w kilku losowych sekcjach, tj. miejscach (sites), w podglądzie wirtualnego przekroju. Po ustawieniu ostrości w kilku miejscach uruchom wirtualny przekrój (prawy przycisk myszy→ Start Virtual Slice with Prefocus). Po zakończeniu wirtualnego przekroju dla pierwszej próbki przełącz się na następny kanał i odpowiednio dostosuj ekspozycję. Powtórz kroki 4 i 5 dla każdego kanału.

2. Komputerowa analiza dwuwymiarowa

Ilościowe oznaczenie wysepek

1. Obrazy są następnie przetwarzane za pomocą makra ImageJ o nazwie „IHCVS”, które najpierw przygotowuje załadowane obrazy do analizy, a następnie kwantyfikuje cechy wysp, takie jak skład komórkowy (tj. pole powierzchni populacji komórek beta, alfa i delta oraz całkowita powierzchnia wyspy jako suma tych wartości). Stos obrazów jest dzielony w ImageJ na oddzielne kanały, z których każdy przedstawia osobny obraz na podstawie barwienia immunohistochemicznego. Następnie każdy obraz jest automatycznie poddawany progowaniu, w wyniku czego powstaje 8-bitowy obraz czarno-biały, czyli maska obrazu poddanego progowaniu. Obrazy z poszczególnych kanałów są następnie sumowane arytmetycznie w kompozytową maskę, a na tak otrzymanym obrazie kompozytowym przeprowadzana jest wbudowana w ImageJ analiza cząsteczek.
2. Następnie identyfikowane są obszary zainteresowania (ROI), z wyłączeniem cząsteczek mniejszych niż pojedyncza komórka beta (<170 μm²; powierzchnia obliczona przy założeniu średnicy ~15 μm; Hara et al., 2003). Wynikowe ROI są analizowane i kwantyfikowane za pomocą ImageJ; kwantyfikacja może obejmować obwód (odległość otaczającą obszar), kolistość (stopień zaokrąglenia, gdzie wartość 1,0 oznacza idealne koło), średnicę Fereta (najdłuższą odległość w obrębie obszaru) oraz współrzędne środka dla każdego analizowanego regionu, tak aby rozkład wysp mógł być analizowany matematycznie przy użyciu różnych kombinacji tych parametrów i przedstawiony na wykresie 3D, z którego dane zostaną wykorzystane do modelowania matematycznego. Analiza pojedynczego obrazu wirtualnego przekroju trwa 30 sekund. Wiele obrazów można analizować, osadzając skrypt przetwarzania i analizy obrazu w pętli obsługiwanej przez język makr ImageJ. Pętla otwiera wszystkie pliki w danym katalogu, analizuje obrazy i eksportuje wyniki do nowej lokalizacji w formie pliku Excel.
3. Zagregowane wyniki są zapisywane w arkuszu Excel, w którym przechowywane są dane takie jak powierzchnia, obwód, kolistość, średnica Fereta i środek każdej wyspy, wraz z odpowiadającymi im numerami naniesionymi na obrazie.

Analiza obliczeniowa i konfiguracja histogramu

1. Do przetwarzania zgromadzonych danych z arkuszy kalkulacyjnych, obejmujących setki tysięcy wpisów, wykorzystuje się skrypty Mathematica, które po uruchomieniu działają automatycznie. Jednym z kluczowych realizowanych procesów jest analiza częstotliwości, służąca do sporządzenia histogramu wykorzystywanego do badania rozkładu wielkości oraz wyznaczania wartości odstających w danych. Za pomocą skryptu mierzono całkowitą powierzchnię wysepek i porównywano ją z innymi parametrami, w szczególności z punktami czasowymi lub wiekiem trzustki, a następnie przedstawiano wyniki na wykresie.

3. Rekonstrukcja trójwymiarowa z dwuwymiarowych obrazów wirtualnych przekrojów barwionych immunohistochemicznie

Rekonstrukcja 3D wirtualnych przekrojów

1. Skopiuj skrypt („im_jp2_2_tiff”) do katalogu (folderu) zawierającego obrazy w formacie jp2. Uruchom skrypt w powłoce Linux, wpisując „./im_jp2_2_tiff” w konsoli i naciskając enter. Uruchomienie tego skryptu automatycznie przekonwertuje wszystkie obrazy jp2 w katalogu na pliki tiff, które są formatem wykorzystywanym do konstrukcji i kwantyfikacji stosów trójwymiarowych z wirtualnych przekrojów (Virtual Slices). (Uwaga: Jeśli skrypt się nie uruchamia, wpisz „chmod+x im_jp2_2_tiff”, co przekonwertuje plik tekstowy na skrypt, umożliwiając jego prawidłowe działanie).
2. Gdy wszystkie przechwycone obrazy zostaną przekonwertowane z formatu jp2 na pliki tiff, będą one gotowe do analizy w programie ImageJ.
3. W programie ImageJ otwórz wszystkie obrazy dla pierwszej próbki (w tym przypadku pięć obrazów: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) i połącz je w jeden obraz (Image→ Color→ Merge Channels). Powtórz ten proces dla każdej z próbek. Po połączeniu wszystkich próbek w pojedyncze obrazy, wyczyść je, zaznaczając niepożądane obszary narzędziem „Polygon Selections” i wypełniając je (Edit→ Fill). (W razie potrzeby zmień rozmiar obrazów na mniejszy). Następnie przekonwertuj każdy obraz na obraz kolorowy RGB (Image→ Type→ RGB color). Na koniec utwórz stos z obrazów (Image→ Stacks→ Image to Stacks), które w razie potrzeby można dalej wyrównać za pomocą wtyczki „Stack Reg”. Ostatecznie połączenie kanałów, a następnie zestawienie obrazów tworzy montaż 3D wszystkich wysepek w całej trzustce. Aby wyświetlić obraz, kliknij „Plugins”, a następnie „3D viewer”.

4. Mapowanie wysepek

Gromadzenie stosów obrazów

1. Umieść całe preparaty wyseczek trzustkowych pod mikroskopem.
2. Otwórz oprogramowanie Slidebook. Przejdź do sekcji „Capture and Focus Control”, naciskając „Ctrl+Shift+E”. W oknie „Focus Control” ustaw obiektyw na 20X lub 40X, w zależności od wielkości wysepek. Jeśli używasz obiektywu immersyjnego, zastosuj wodę.
3. Aby zlokalizować wysepki za pomocą okularu mikroskopu, w oknie „Focus Controls” ustaw „Bin” na 2X, a zestaw filtrów (Filter Set) na User1. „Emission Selection” powinno być ustawione na 100% Eyes, a Neutral Density na 1. Kliknij „GFP ey”, a następnie „Open Fluor”.
4. Aby zwizualizować próbkę w programie Slidebook, wróć do okna Focus Controls, przełącz „Filter Set” na „Live” i kliknij „GFP ds”. Użyj joysticka, aby jak najlepiej wycentrować wysepkę w oknie Camera 1. Ustaw ostrość na głębokości w pobliżu centrum wysepki, gdzie komórki są łatwo rozróżnialne.
5. W oknie „Focus Controls” wybierz zakładkę „Z”. Kliknij „set” w górnym lewym rogu okna, aby ustawić aktualną głębokość jako punkt odniesienia. Używając sterowania mikroskopem, przesuń się do najwyższej głębokości wysepki, w której cechy są wyraźnie widoczne, i kliknij „Set Top”. Przesuń się na dno wysepki i kliknij „Set Bottom”. Kliknij „Go”, aby powrócić do punktu odniesienia.
6. W oknie Capture ustaw „Bin Factor” na „2X” oraz „Filter Set” na „Live”. Ustaw „Capture Type” na „3D” (wyłącznie 3D). Po prawej stronie okna kliknij „Use Top and Bottom Positions”. Kliknij „Return to Reference Point After Capture”. Ustaw „Step Size” na „3”.
7. Pod polem „Filter Set” zaznacz DAPI dsu, GFP dsu, RFP dsu oraz Cy5 Dsu. Dla każdego z nich kliknij „Find Best” w sekcji „Adjust Exposure”, a następnie kliknij „Test”, aby upewnić się, że wybrany czas ekspozycji jest odpowiedni. Kliknij „Start”, aby rozpocząć akwizycję.
8. Po zakończeniu akwizycji dostosuj poziomy w razie potrzeby i zmień wyświetlany kolor dla RFP na biały. Zapisz preparat i przejdź do View→Export→TIFF series. Wpisz nazwę preparatu z myślnikiem na końcu i zapisz plik. Zostanie utworzono dziesiątki pojedynczych plików TIFF, dlatego pomocne może być przechowywanie stosu obrazów każdej wysepki w oddzielnym folderze.

Mapowanie stosów obrazów

1. Otwórz program Stereo Investigator. Zwizualizuj obraz, otwierając stosy obrazów (File→ Image Stack → Image Stack Open). W menu „Image Scaling” ustaw wartość „Distance Between Images” na 3.00 μm. Aby skorygować binning 2X w programie Slidebook, zaznacz opcje „Override X and Y Scaling” oraz „User Specified for Source of X and Y” Scaling, a następnie wprowadź wartość 0.65 dla X i Y.
2. Wycentruj obraz, klikając w środku analizowanego wysepki w oknie „Macro window”. Oznacz co najmniej jedną komórkę za pomocą odpowiedniego markera. Komórki beta będą miały kolor zielony, komórki alfa czerwony, a komórki delta biały; użyj Markera 2 (puste koło) do oznaczania komórek beta, Markera 5 (pusty trójkąt) dla komórek alfa oraz Markera 6 (pusty trójkąt) dla komórek delta. Komórki należy oznaczać w centrum ich jądra, które będzie miało kolor niebieski, jeśli próbka została zabarwiona DAPI.
3. Po oznaczeniu co najmniej jednej komórki wyświetl widok ortogonalny („Orthogonal View”), używając ikony w górnym menu. Zaznacz opcje „Z-Filter” oraz „Symmetric”. Zakres powinien zostać ustawiony na 15.00. Zaczynając od poziomu Z 0.0, przewijaj wysepkę za pomocą kółka myszy i oznaczaj każdą komórkę odpowiednim markerem. Każdą komórkę należy oznaczyć tylko raz, w centrum jej głębokości. Po zakończeniu oznaczania na wszystkich poziomach Z można odznaczyć pole „Z-filter”. Spowoduje to wyświetlenie wszystkich markerów ze wszystkich poziomów Z.
4. Po oznaczeniu wszystkich komórek zapisz plik jako plik „DAT”, a następnie przejdź do File→ Export Tracing. Zapisz obrys jako plik „TXT”. Kliknij „New Data File”, aby wyczyścić obszar roboczy przed przystąpieniem do mapowania nowych wysepek.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przygotowanie wirtualnych przekrojów (Virtual Slices) z immunohistochemicznie barwionej próbki trzustki pozwala na zbadanie wszystkich komórek endokrynnych (komórek alfa, beta i delta) w całej trzustce, zarówno wspólnie w obrębie wysp (Rysunek 1A), jak i indywidualnie w osobnych kanałach (Rysunek 1B). Dzięki zastosowaniu programów komputerowych i skryptów na tych wirtualnych przekrojach można przeprowadzić masową analizę wielkoskalowych danych. W szczególności analiza cząstek masek kompozytowych (Rysunek 1C) jest prezentowana w formie tabeli statystycznej zawierającej takie parametry jak pole powierzchni wyspy, obwód (dystans otaczający dany obszar), kolistość (stopień zaokrąglenia, gdzie 1,0 oznacza idealne koło) oraz średnica Fereta (najdłuższy dystans w obrębie obszaru) dla każdej wykrytej wyspy (Rysunek 1D). Wielkoskalowa analiza tych obrazów pozwala na wyznaczenie całkowitej liczby wysp i histogramów rozkładu wielkości, a także szczegółowe porównanie powierzchni komórek alfa, beta i delta. Dodatkowo każdy wirtualny przekrój jest pobierany z głębokości około 5 μm, a wszystkie poszczególne dwuwymiarowe wirtualne przekroje są następnie nakładane, aby stworzyć trójwymiarową rekonstrukcję całej próbki trzustki. Mapowanie wysp stanowi kolejny przykład nie tylko obrazowania wysp w 3D, ale także szczegółowej analizy wspomaganej komputerowo. Mapowanie wysp polega na uchwyceniu poszczególnych wysp (Rysunek 2A) i późniejszym znakowaniu komórek alfa, beta i delta w różnych płaszczyznach Z (Rysunek 2B) w celu wizualizacji wyspy w 3D (Rysunek 2C, D). Zautomatyzowana analiza matematyczna zmapowanych wysp obrazuje ich skład komórkowy i architekturę, w tym odległości między komórkami (Rysunek 2E) oraz skumulowane prawdopodobieństwa rozkładu odległości między komórkami (Rysunek 2F).

Rysunek 1. Wielkoskalowe obrazowanie i analiza rozkładu wysepek trzustkowych z wykorzystaniem techniki Virtual Slice. A. Widok wirtualnego przekroju sekcji trzustki ludzkiej. a. Barwienie immunohistochemiczne na insulinę (zielony), glukagon (czerwony), somatostatynę (biały) oraz DAPI (niebieski). b. Przekonwertowana maska 8-bitowa po automatycznym progowaniu. Obszar zaznaczony ramką został powiększony w części B. B. Widoki poszczególnych kanałów: a. komórki delta, b. komórki beta, c. komórki alfa oraz d. złączony obraz kompozytowy. C. Analiza cząstek wykonana na masce kompozytowej. Zwróć uwagę, że każda struktura wysepki, w tym małe skupiska komórek, została ponumerowana (podświetlenie niebieskie). D. Tabela statystyczna z różnymi parametrami zmierzonymi dla poszczególnych struktur, których identyfikatory odpowiadają znacznikom pokazanym w części C.

Rycina 2. Analiza wirtualnego przekroju immunohistochemicznego. A. Wykres rozrzutu 3D z Ryciny 1 przedstawiający rozkład wielkości i kształtu każdego wyspczeka według parametrów takich jak powierzchnia, kołowość i średnica Fereta. B. Wykres rozrzutu 3D z Ryciny 1 przedstawiający skład komórkowy i wielkość wyspeczków. C. Rozkład wielkości wyspeczków z analizy całego ludzkiego przekroju z Ryciny 1 dopasowany do lognormalnego rozkładu gęstości prawdopodobieństwa. D. Analiza matematyczna stosunków składu komórkowego (komórki beta na zielono, komórki alfa na czerwono i komórki delta na niebiesko) dla każdego przedziału efektywnej średnicy wyspeczków z Ryciny 1. E. a. Rozkład wielkości wyspeczków w analizie immunohistochemicznej opartej na losowym próbkowaniu (lewo). Rozkład wielkości wyspeczków w analizie wirtualnego przekroju (prawo). b. Porównanie wykresów log-normalnych analizy immunohistochemicznej opartej na losowym próbkowaniu (czerwony) oraz wirtualnego przekroju (niebieski).

Rycina 3. Mapowanie wysepek oraz analiza matematyczna składu i architektury komórkowej. A: Zrzut ekranu przedstawiający pojedynczą płaszczyznę ogniskową z 3D zrekonstruowanego stosu obrazów ludzkiej wyspki przesłanego do programu Stereo-Investigator (komórki beta na zielono, komórki alfa na czerwono, komórki delta na biało i jądra na niebiesko). B: Obrazy fluorescencyjne (po lewej) i odpowiadające im zmapowane dane (po prawej) w trzech różnych płaszczyznach ogniskowych przedstawionych w odstępach 10 μm. C: Reprezentatywny widok 3D zrekonstruowanych danych mapowania wysepek. D: Rekonstrukcja 3D wysepek pociętej na ćwiartki na podstawie współrzędnych uzyskanych z mapowania wysepek. E: Analiza matematyczna składu i architektury komórkowej. Po lewej: Częstość względna odległości międzykomórkowych dla dwóch komórek w obrębie jednej populacji komórek. Po prawej: Częstość względna odległości międzykomórkowych dla dwóch różnych populacji komórek. F: Test Kołmogorowa-Smirnowa (K-S). Po lewej: Prawdopodobieństwa skumulowane rozkładów odległości międzykomórkowych dla komórek alfa-alfa, beta-beta i delta-delta. Po prawej: Odległości K-S dla odpowiadających im trzech prawdopodobieństw skumulowanych.

Dyskusja

Zaprezentowana tutaj komputerowa wizualizacja i kwantyfikacja na dużą skalę dostarczają czterech kluczowych wniosków w badaniach nad wysepkami trzustkowymi: (1) Analiza preparatów trzustki na dużą skalę pozwala na kompleksowy wgląd w ogólny rozkład wielkości wysepek oraz ich architekturę. (2) Rekonstrukcja 3D i analiza matematyczna składu oraz architektury komórkowej dodatkowo ułatwiają badanie przestrzennego rozmieszczenia komórek endokrynnych wewnątrz wysepki. (3) Wyraźna plastyczność wysepek między różnymi gatunkami o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop fluorescencyjny	Mikroskop	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
Myszy MIP-GFP	Myszy	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook		Program	Olympus