Interferencja RNA u kleszczy

Summary

Opisano metodę interferencji RNA (RNAi) poprzez wstrzyknięcie dsRNA do niekarmionych kleszczy. RNAi jest najczęściej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy, u których zastosowanie innych metod manipulacji genetycznej zostało ograniczone.

Abstract

Kleszcze są obowiązkowymi hematofagicznymi ektopasożytami dzikich i domowych zwierząt oraz ludzi, i są uważane za drugie na świecie po komarach wektory chorób ludzkich¹ i najważniejsze wektory wpływające na przemysł hodowlany na całym świecie². Kleszcze są klasyfikowane w podklasie Acari, rząd Parasitiformes, podrząd Ixodida i występują na całym świecie od Arktyki do regionów tropikalnych³. Pomimo wysiłków zmierzających do opanowania inwazji kleszczy, te ektopasożyty pozostają poważnym problemem dla zdrowia ludzi i zwierząt^4,5.

Interferencja RNA (RNAi)⁶ to metoda odwrotnej genetyki opartej na kwasach nukleinowych, która polega na zakłóceniu ekspresji genów w celu określenia funkcji genu lub jego wpływu na szlak metaboliczny. Małe interferujące RNA (siRNA) są cząsteczkami efektorowymi szlaku RNAi, który jest inicjowany przez dwuniciowy RNA (dsRNA) i powoduje silną, specyficzną dla sekwencji degradację cytoplazmatycznych mRNA zawierających tę samą sekwencję, co wyzwalacz dsRNA^7-9. Potranskrypcyjne mechanizmy wyciszania genów inicjowane przez dsRNA zostały odkryte u wszystkich badanych do tej pory eukariontów, a RNAi zostało szybko rozwinięte w różnych organizmach jako narzędzie do badań genomiki funkcjonalnej i innych zastosowań¹⁰.

RNAi stało się najczęściej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy i innych organizmów, gdzie alternatywne metody manipulacji genetycznej nie są dostępne lub są niewiarygodne.^5,11. Charakterystyka genetyczna kleszczy była ograniczona do czasu niedawnego zastosowania RNAi^12,13. W krótkim czasie, w którym RNAi było dostępne, okazało się cennym narzędziem do badania funkcji genów kleszczy, charakterystyki granicy faz kleszcz-patogen oraz badań przesiewowych i charakterystyki antygenów ochronnych przed kleszczami¹⁴. W niniejszym artykule opisano metodę RNAi poprzez wstrzyknięcie dsRNA do niekarmionych kleszczy. Jest prawdopodobne, że wiedza uzyskana dzięki temu eksperymentalnemu podejściu znacząco przyczyni się do zrozumienia podstawowych systemów biologicznych i opracowania szczepionek w celu zwalczania inwazji kleszczy i zapobiegania przenoszeniu patogenów przenoszonych przez kleszcze^15-19.

Protocol

1. Generacja dsRNA.

1. Synteza starterów oligonukleotydowych zawierających sekwencje promotora T7 do transkrypcji in vitro i syntezy dsRNA (na przykład w przypadku subolezyny Dermacentor variabilis należy użyć starterów oligonukleotydowych D8AAT75:
   5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3' i D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGACTACTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGAGGAGGAGG').
2. Amplifikuj gen docelowy metodą RT-PCR przy użyciu 10 pmol każdego startera oligonukleotydowego i 1-10 ng całkowitego RNA kleszcza.
3. Oczyść produkt PCR.
4. Zsyntetyzować dsRNA przy użyciu 8 μl oczyszczonego produktu PCR.
5. Określ ilościowo dsRNA za pomocą spektrometrii.

2. Wstrzykiwanie kleszczy z dsRNA.

2.1. Przygotowanie kleszczy do wstrzyknięcia.

1. Najpierw umyj kleszcze w serii roztworów, potrząsając nimi w każdym roztworze w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, dekantując roztwór przez sito z drutu o drobnych oczkach nad górną częścią probówki, aby zatrzymać kleszcze. Sekwencja roztworów do mycia kleszczy to woda z kranu, 3% nadtlenek wodoru, dwa przemycia wodą destylowaną, 70% etanolu i dwa kolejne płukania wodą destylowaną.
2. Osusz kleszcze na ręcznikach papierowych.
3. Policz kleszcze w grupy od 20 do 50, w zależności od eksperymentu, umieść kleszcze z każdej grupy w plastikowym kubku o pojemności 1,25 uncji z ciasno dopasowaną pokrywką i oznacz numerem grupy eksperymentalnej.

2.2. Zespół iniekcji kleszczy.

Zespół RNAi składa się z trzech osób: (1) jedna osoba, która umieszcza każdego kleszcza na podwójnej taśmie klejącej przymocowanej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego, (2) jedna osoba, która wstrzykuje kleszcze i (3) jedna osoba, która monitoruje kleszcze po wstrzyknięciu, wdycha CO₂ na kleszcze, aby je aktywować i liczy żywe kleszcze do kubków oznaczonych numerem grupy eksperymentalnej. Wszyscy członkowie zespołu muszą nosić rękawiczki jednorazowe.

2.3. Rozmieszczenie kleszczy do wstrzyknięcia.

1. Złap kleszcza za pomocą cienkich kleszczyków Dumont i umieść go brzuszną stroną do góry na podwójnej taśmie klejącej przymocowanej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego o wymiarach 3 x 6 cali. Kleszcze są ustawione blisko siebie w grupach po 5 kleszczy.
2. Umieść mały pasek taśmy maskującej na aparatach gębowych wszystkich 5 kleszczy, aby jeszcze bardziej je powstrzymać, ale pozostawiając większość ciała odsłoniętą, tak aby proces wstrzykiwania mógł być obserwowany przez wstrzykiwacz kleszczy (ryc. 1).

2.4. Wstrzykiwanie kleszczy.

1. Kleszcze zostaną wstrzyknięte w prawy dolny kwadrant brzusznej powierzchni egzoszkieletu.
2. Najpierw przebij otwór w egzoszkielecie za pomocą strzykawki insulinowej Monoject wyposażonej w igłę o rozmiarze 1/2 cala i rozmiarze 29 (ryc. 2a).
3. Natychmiast wstrzyknąć kleszcze 0,2-0,5 μl roztworu dsRNA (5 x 10¹⁰ - 5 x 10¹¹ cząsteczek na μl) za pomocą specjalnie wykonanej strzykawki Hamilton z igłą o średnicy 1 cala i rozmiarze 33 z punktem ściętym pod kątem 45° (ryc. 2b). Igła powinna być dobrze umieszczona w jamie kleszcza, aby zapewnić umieszczenie i zatrzymanie dsRNA. Istnieje prawdopodobieństwo, że część płynu wydostanie się z miejsca wstrzyknięcia (ryc. 2c). Należy uważać, aby nie wstrzyknąć kleszcza zbyt głęboko, ponieważ spowodowałoby to utratę hemolimfy i mogłoby spowodować śmierć kleszcza.
4. Oczyścić strzykawkę Hamiltona po zakończeniu wstrzyknięć w każdej grupie eksperymentalnej. przed użyciem w innej grupie eksperymentalnej. Najpierw napełnić strzykawkę ze zlewki zawierającej 3% nadtlenku wodoru, a następnie wyrzucić do pojemnika na odpady i powtórzyć 15 razy. Napełnić strzykawkę ze zlewki zawierającej jałową wodę, a następnie wylać do pojemnika na odpady i powtórzyć czynność 15 razy. Należy uważać, aby nie zginać tłoka strzykawki Hamiltona, ponieważ w przypadku zgięcia tłok nie będzie się poruszał płynnie i nie będzie reagował na delikatny dotyk wymagany do wstrzyknięcia kleszczy.

2.5. Leczenie kleszczy po wstrzyknięciu.

1. Za pomocą cienkich kleszczyków należy natychmiast podnieść wstrzykniętego kleszcza z podwójnej taśmy klejącej i umieścić go w plastikowym pojemniku do odzyskiwania (około 6 "x 6" i otoczonym taśmą maskującą, aby zapobiec ucieczce kleszczy). Kleszcze będą na krótko nieaktywne po wstrzyknięciu, ale wkrótce powinny zacząć pełzać po naczyniu.
2. Wdychać CO₂ na kleszcze natychmiast po umieszczeniu ich w pojemniku do odzyskiwania, aby pomóc w aktywacji kleszczy. Gdy kleszcze pełzają i są aktywne, rana po wstrzyknięciu szybko się zagoi i najprawdopodobniej przeżyją.
3. Policz kleszcze zgodnie z liczbą w każdej grupie eksperymentalnej i umieść je w oznaczonym plastikowym kubku z ciasno dopasowaną pokrywką. Zastępcze kleszcze powinny być wstrzykiwane w celu zastąpienia tych, które zmarły przed wstrzyknięciem następnej grupy eksperymentalnej.

2.6. Trzymanie znaczników.

1. Umieść kleszcze w komorze wilgotnościowej (12 godzin światła: 12 godzin ciemnego fotoperiodu w temperaturze 22-25°C i wilgotności względnej 95%) i przytrzymaj przez 1 dzień.
2. Umieść kleszcze w komórkach żywiących się kleszczami, po jednej na grupę eksperymentalną, przyklejonych do owcy i pozwól im żerować równą liczbą niewstrzykniętych samców lub samic kleszczy (w zależności od płci, której nie wstrzyknięto). Samice kleszczy, które żerują do syta, te, które są usuwane z owiec po 10 dniach karmienia lub gdy samice kontrolne opuściły żywiciela, są zbierane i ważone.
3. Umieść kleszcze w kartonach i trzymaj w komorze wilgotnościowej do zakończenia składania jaj. Oceń składanie jaj, ważąc masę jaj wytwarzaną przez wszystkie kleszcze w grupie.

2.7. Analiza fenotypu kleszcza po RNAi.

1. Oceń fenotyp kleszcza po karmieniu, określając liczbę kleszczy, które przeżyły, masę kleszcza, składanie jaj i płodność jaj. Jednak w zależności od docelowego genu i celów badania można przeprowadzić inne analizy.

3. Analiza potwierdzająca wyciszenie genów za pomocą RT-PCR.

1. Wypreparuj gruczoły ślinowe i jelita od pojedynczych kleszczy z grup kontrolnych i wstrzykniętych dsRNA po karmieniu.
2. Ekstrakcja całkowitego RNA z pojedynczych próbek tkanek.
3. Analizuj docelowe transkrypty genów w poszczególnych tkankach za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym i normalizuj poziomy RNA względem rRNA kleszcza 16S za pomocą metody genNorm (metoda ddCT zaimplementowana przez Bio-Rad iQ5 Standard Edition, wersja 2.0).
4. Uruchomić krzywe dysocjacji na końcu reakcji, aby upewnić się, że powstaje tylko jeden amplikon i że amplikony ulegają denaturacji w sposób spójny w tym samym zakresie temperatur dla każdej próbki.
5. Porównaj poziomy mRNA (znormalizowane wartości Ct) między kleszczami, którym wstrzyknięto kontrolę, a kleszczami, którym wstrzyknięto dsRNA, za pomocą testu t Studenta (P = 0,05).

4. Reprezentatywne wyniki:

Protokół opisany tutaj został wykorzystany w naszym laboratorium dla RNAi u wielu różnych gatunków kleszczy ixodid (Tabela 1). Ilość dsRNA wstrzykniętego do kleszczy zmienia się w zależności od wielkości kleszcza; Większe gatunki kleszczy mogą pomieścić większą objętość. Kleszcze kontroli ujemnej należy wstrzyknąć z niepowiązanym dsRNA. Kilka dsRNA, takich jak subolezyna^{14-19,22-25,27-32,34} i beta-aktyna^20,21, może być stosowanych jako kontrole pozytywne. Należy pamiętać, że ważne jest, aby umyć strzykawkę między zabiegami, aby uniknąć mieszania roztworów dsRNA. Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, po 24 godzinach należy uzyskać mniej niż 5% śmiertelności po zabiegu wstrzyknięcia. Typowy fenotyp po knockknocku genu u kleszczy pokazano na rycinie 3 z panelem kleszczy, którym wstrzyknięto pule dsRNA w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku antygenów ochronnych przed kleszczami.

Gatunki kleszczy wstrzyknięte dsRNA Odwołania Ixodes scapularis (Ixodes łopatka) biblioteka cDNA, subolezyna, aktyna, nukleotydaza, NF-kB, akiryna 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis (Dermacentor variabilis) subolezyna, GST, ubikwityna, vATPaza, selenoproteiny M i W2a, hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe białkopodobne, podjednostka aktyny Proteasom 26S, ferrytyna1, waryna, akiryna 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolezyna 22 Rozdział 22 Amblyomma americanum biblioteka cDNA, subolezyna, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolezyna, woraksyna 28 Rhipicephalus sanguineus (rhipicephalus sanguineus) Rs86, subolezyna 22, 23 Rhipicephalus microplus (rhipicephalus microplus) GST, ubikwityna, selenoproteina, Bm86, Bm91, subolezyna, GI, GIII, EF1a, białko jedwabiu wiciowego, von Willebrand
czynnik 16, 18, 25, 27 Rhipicephalus annulatus (rhipicephalus annulatus) ubikwityna, subolezyna, EF1a, GIII 16

Tabela 1.Gatunki kleszczy, w których zastosowano protokół RNAi.

Rysunek 1. Umieszczenie kleszczy, brzuszną stroną do góry, na podwójnej taśmie klejącej przyklejonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego. Kleszcze umieszcza się w grupach po 5 sztuk, po czym na aparaty gębowe umieszcza się mały pasek taśmy maskującej w celu dalszego zabezpieczenia kleszczy, jednocześnie umożliwiając wstrzykiwaczowi obserwację ciała kleszcza podczas wstrzykiwania.

Rysunek 2. Procedura iniekcji obejmuje (a) przekłucie prawego dolnego kwadrantu egzoszkieletu kleszcza strzykawką insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 w celu stworzenia miejsca wstrzyknięcia, (b) natychmiastowe wstrzyknięcie dsRNA w to miejsce za pomocą strzykawki Hamiltona z igłą o rozmiarze 33, co (c) najprawdopodobniej spowoduje wyciek hemolimfy/płynów kleszczowych.

Rysunek 3. Panel sześciu grup kleszczy, w których RNAi użyto do badań przesiewowych antygenów ochronnych przed kleszczami w Amblyomma americanum. Zmiany fenotypowe u kleszczy można zaobserwować w porównaniu z dodatnią kontrolą RNAi subolezyny i ujemną kontrolą niepowiązanego dsRNA. W tym eksperymencie przeanalizowano statystycznie wpływ RNAi na śmiertelność kleszczy, wagę i składanie jaj w każdej grupie.

Discussion

Chociaż inne metody zostały opisane dla RNAi u kleszczy^{14, 33}, opisane tutaj wstrzyknięcie dsRNA jest najczęściej stosowane zarówno u kleszczy niekarmionych (Tabela 1), jak i karmionych^16,25,34. Wykazano, że RNAi jest cennym narzędziem do badania funkcji genów kleszczy, charakterystyki interfejsu kleszcz-patogen oraz badań przesiewowych i charakterystyki antygenów ochronnych przed kleszczami^14,35. W szczególności RNAi stał się najcenniejszym narzędziem do analiz funkcjonalnych w tickach³⁵.

Metodologicznie RNAi prawdopodobnie przekształci się w bardziej wydajne metody, które mogą pozwolić na knockdown genu u dużej liczby osób. Mechanizm RNAi indukowanego przez dsRNA u kleszczy powinien zostać udoskonalony, aby przyczynić się do lepszego zrozumienia i wykorzystania tego podejścia genetycznego u tego gatunku^35,36. Zakres niezamierzonych efektów RNAi u kleszczy jest również ważnym pytaniem, na które należy w pełni odpowiedzieć^14,27. Wreszcie, RNAi najprawdopodobniej wniesie kompleksowy wkład w badania nad regulacją genów kleszczy i biologią systemową oraz interfejsem kleszcz-patogen, a także może mieć wpływ na opracowanie szczepionek do kontroli inwazji kleszczy i przenoszenia patogenów przenoszonych przez kleszcze.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uzyskaj dostęp do systemu RT-PCR	Promega	A1250
Zestaw do oczyszczania Purelink PCR	Invitrogen	K3100-02
Zestaw Megascript RNAi	Ambion	AM1626M
Czerwony wosk dentystyczny	Mikroskopia elektronowa	Sciences 72674
Plastikowe kubki, 1.25 uncji i pokrywki	Solo Cup Company, Urbana Ill.
Drobne kleszcze	Mikroskopia elektronowa Nauki	Różne
Strzykawka insulinowa	Monoject		Wyposażona w ½ ", Igła o rozmiarze 29
Strzykawka Hamilton	Hamilton	701SN,33/.375”/45DGR	Wykonany na zamówienie
TriReagent	Sigma	93289
iScript One-Step RT-PCR Kit z SYBR Green	Bio-Rad	170-8892
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	Kilka	Proszę zapoznać się z http:// www.bio-rad.com/