Interferencja RNA u kleszczy

Podsumowanie

Opisano metodę interferencji RNA (RNAi) poprzez wstrzykiwanie dsRNA do niekarmionych kleszczy. RNAi jest najszerzej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy, w przypadku których zastosowanie innych metod manipulacji genetycznych było ograniczone.

Streszczenie

Kleszcze są obligatoryjnymi hematofagicznymi ektopasożytami zwierząt dzikich i domowych oraz ludzi i po komarach są uważane za drugie najważniejsze na świecie wektory chorób ludzkich¹ oraz za najważniejsze wektory wpływające na przemysł hodowli bydła na całym świecie². Kleszcze są klasyfikowane w podklasie Acari, rzędzie Parasitiformes, podrzędzie Ixodida i występują na całym świecie, od regionów arktycznych po tropikalne³. Pomimo wysiłków w celu opanowania infestacji kleszczami, ektopasożyty te pozostają poważnym problemem dla zdrowia ludzi i zwierząt^4,5.

Interferencja RNA (RNAi)⁶ to oparta na kwasach nukleinowych metoda genetyki odwrotnej, która polega na zaburzaniu ekspresji genów w celu określenia funkcji genu lub jego wpływu na ścieżkę metaboliczną. Małe interferujące RNA (siRNA) są cząsteczkami efektorowymi ścieżki RNAi, która jest inicjowana przez dwuniciowe RNA (dsRNA) i prowadzi do silnej, swoistej sekwencyjnie degradacji cytoplazmatycznych mRNA zawierających tę samą sekwencję co wyzwalacz dsRNA^7-9. Mechanizmy posttranskrypcyjnego wyciszania genów inicjowane przez dsRNA odkryto u wszystkich dotychczas badanych eukariotów, a RNAi zostało szybko rozwinięte w wielu organizmach jako narzędzie do badań z zakresu genomiki funkcjonalnej oraz innych zastosowań¹⁰.

RNAi stała się najszerzej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy i innych organizmów, w których alternatywne podejścia do manipulacji genetycznych są niedostępne lub niewiarygodne^5,11. Charakterystyka genetyczna kleszczy była ograniczona aż do niedawnego zastosowania RNAi^12,13. W krótkim czasie, odkąd RNAi jest dostępna, okazała się ona cennym narzędziem do badania funkcji genów kleszczy, charakterystyki interfejsu kleszcz-patogen oraz przesiewania i charakterystyki ochronnych antygenów kleszczy¹⁴. W niniejszym opracowaniu opisano metodę RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do niekarmionych kleszczy. Prawdopodobne jest, że wiedza uzyskana dzięki temu podejściu eksperymentalnemu w znacznym stopniu przyczyni się do zrozumienia podstawowych systemów biologicznych i opracowania szczepionek w celu zwalczania infestacji kleszczami oraz zapobiegania transmisji patogenów przenoszonych przez kleszcze^15-19.

Protokół

1. Generowanie dsRNA.

1. Zsyntetyzować startery oligonukleotydowe zawierające sekwencje promotora T7 do transkrypcji in vitro i syntezy dsRNA (na przykład dla subolesiny Dermacentor variabilis należy użyć starterów oligonukleotydowych D8AAT75:
   5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3' oraz D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3').
2. Amplifikować gen docelowy metodą RT-PCR, wykorzystując 10 pmol każdego startera oligonukleotydowego oraz 1-10 ng całkowitego RNA kleszcza.
3. Oczyścić produkt PCR.
4. Zsyntetyzować dsRNA, wykorzystując 8 μL oczyszczonego produktu PCR.
5. Oznaczyć ilość dsRNA za pomocą spektrometrii.

2. Iniekcja dsRNA do kleszczy.

2.1. Przygotowanie kleszczy do iniekcji.

1. W pierwszej kolejności kleszcze należy przemyć w serii roztworów, wstrząsając nimi w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mL, a następnie odlewać roztwór przez gęste sito z drucianej siatki umieszczone nad probówką, aby zatrzymać kleszcze. Kolejność roztworów do mycia kleszczy to: woda z kranu, 3% nadtlenek wodoru, dwa płukania wodą destylowaną, 70% etanol i kolejne dwa płukania wodą destylowaną.
2. Kleszcze należy osuszyć, odciskając je w ręczniki papierowe.
3. Kleszcze należy odliczyć w grupy od 20 do 50 osobników, w zależności od eksperymentu, a następnie umieścić kleszcze z każdej grupy w plastikowym kubku o pojemności 1,25 oz z dopasowaną szczelną pokrywką i oznaczyć numerem grupy eksperymentalnej.

2.2. Zespół do iniekcji kleszczy.

Zespół RNAi składa się z trzech osób: (1) jednej osoby, która umieszcza każdego kleszcza na dwustronnej taśmie klejącej przytwierdzonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego, (2) jednej osoby, która wykonuje iniekcje kleszczom oraz (3) jednej osoby, która monitoruje kleszcze po iniekcji, aktywuje je poprzez wydmuchiwanie CO₂ i przenosi żywe kleszcze do kubeczków oznaczonych numerem grupy eksperymentalnej. Wszyscy członkowie zespołu muszą nosić jednorazowe rękawiczki.

2.3. Umieszczenie kleszczy do iniekcji.

1. Chwyć kleszcza za pomocą precyzyjnej pęsety Dumont i umieść go stroną brzuszną do góry na dwustronnej taśmie klejącej przymocowanej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego o wymiarach 3" x 6". Kleszcze należy rozmieścić blisko siebie w grupach po 5 osobników.
2. Na aparat gębowy wszystkich 5 kleszczy nałóż niewielki pasek taśmy maskującej, aby dodatkowo je unieruchomić, pozostawiając jednocześnie większość ciała odsłoniętą, co umożliwi osobie wykonującej iniekcję obserwację procesu wstrzykiwania (Rycina 1).

2.4. Iniekcja kleszczy.

1. Kleszcze zostaną wstrzyknięte w dolnym prawym kwadrancie brzusznej powierzchni egzoszkieletu.
2. W pierwszej kolejności należy wykonać otwór w egzoszkielecie, używając strzykawki insulinowej Monoject z igłą o rozmiarze 29 G i długości ½" (Rycina 2a).
3. Niezwłocznie wstrzyknąć kleszczom 0,2-0.5 μL roztworu dsRNA (5 x 10¹⁰ - 5 x 10¹¹ cząsteczek na μL) przy użyciu specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona z igłą o długości 1 cala i średnicy 33 G z 45° ścięty czubek (rycina 2b). Igłę należy wprowadzić głęboko do jam ciała kleszcza, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie i utrzymanie się dsRNA. Część płynu prawdopodobnie wypłynie z miejsca wstrzyknięcia (rycina 2c). Należy uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużej ilości płynu, co spowodowałoby utratę hemolimfy i mogłoby doprowadzić do śmierci kleszcza.
4. Oczyść strzykawkę Hamiltona po zakończeniu iniekcji w każdej grupie eksperymentalnej, przed użyciem jej w kolejnej grupie. Napełnij strzykawkę z zlewki zawierającej 3% nadtlenek wodoru, a następnie wypuść zawartość do pojemnika na odpady; powtórz tę czynność 15 razy. Napełnij strzykawkę z zlewki zawierającej sterylną wodę, a następnie wypuść zawartość do pojemnika na odpady; powtórz tę czynność 15 razy. Należy uważać, aby nie wygiąć tłoka strzykawki Hamiltona, ponieważ w przypadku wygięcia tłok nie będzie poruszał się płynnie i nie będzie reagował na delikatny nacisk wymagany podczas iniekcji kleszczy.

2.5. Postępowe postępowanie z kleszczami po iniekcji.

1. Natychmiasty odbierz wstrzykniętego kleszcza z dwustronnej taśmy klejącej za pomocą pęsety precyzyjnej i umieść go w plastikowym pojemniku regeneracyjnym (o wymiarach około 6" x 6", oklejonym z brzegów taśmą maskującą, aby zapobiec ucieczce kleszczy). Kleszcze będą przez chwilę nieaktywne po wstrzyknięciu, ale wkrótce powinny zacząć pełzać po naczyniu.
2. Bezpośrednio po umieszczeniu kleszczy w pojemniku regeneracyjnym podaj im CO₂, aby pomóc im się aktywować. Gdy kleszcze zaczną pełzać i staną się aktywne, rana po wstrzyknięciu szybko się zagoi i prawdopodobnie przeżyją.
3. Odlicz kleszcze zgodnie z liczbą przewidzianą dla każdej grupy eksperymentalnej i umieść je w opisanym plastikowym kubku z dopasowaną, szczelną pokrywką. Należy wstrzyknąć kleszcze zastępcze w miejsce tych, które padły przed wstrzyknięciem kolejnej grupy eksperymentalnej.

2.6. Unieruchomienie kleszcza.

1. Umieścić kleszcze w komorze wilgotnościowej (fotoperiod 12h światła: 12h ciemności, temperatura 22-25°C i wilgotność względna 95%) i utrzymywać przez 1 dobę.
2. Umieścić kleszcze w komórkach do karmienia kleszczy, po jednej na grupę eksperymentalną, przyklejonych do owcy, i pozwolić im żerować wraz z równą liczbą nieoinfekowanych kleszczy samców lub samic (zależnie od tego, która płeć nie została poddana iniekcji). Zebrać i zważyć samice kleszczy, które najadły się do sytości, te, które zostały usunięte z owcy po 10 dniach żerowania lub w momencie, gdy samice z grupy kontrolnej oddzieliły się od żywiciela.
3. Umieścić kleszcze w kartonikach i przechowywać w komorze wilgotnościowej do zakończenia składania jaj. Ocenić proces składania jaj poprzez zważenie masy jaj produkowanych przez wszystkie kleszcze w grupie.

2.7. Analiza fenotypu kleszczy po RNAi.

1. Oceń fenotyp kleszczy po żerowaniu, określając liczbę przeżyłych osobników, masę kleszczy, liczbę złożonych jaj oraz ich żywotność. W zależności od badanego genu i celów badania można przeprowadzić również inne analizy.

3. Analiza potwierdzająca wyciszenie genu za pomocą RT-PCR.

1. Po karmieniu wypreparować gruczoły ślinowe i jelita z poszczególnych kleszczy z grup kontrolnej (wstrzykniętej roztworem kontrolnym) oraz grupy wstrzykniętej dsRNA.
2. Wyizolować całkowity RNA z poszczególnych próbek tkanek.
3. Przeprowadzić analizę transkryptów genów docelowych w poszczególnych tkankach za pomocą real-time RT-PCR i znormalizować poziomy RNA względem 16S rRNA kleszcza, stosując metodę genNorm (metoda ddCT zaimplementowana w Bio-Rad iQ5 Standard Edition, wersja 2.0).
4. Na koniec reakcji przeprowadzić analizę krzywych dysocjacji, aby upewnić się, że powstał tylko jeden amplikon i że amplikony denaturują spójnie w tym samym zakresie temperatur dla każdej próbki.
5. Porównać poziomy mRNA (znormalizowane wartości Ct) pomiędzy kleszczami z grupy kontrolnej a kleszczami wstrzykniętymi dsRNA, stosując test t-Studenta (P=0,05).

4. Reprezentatywne wyniki:

Opisany tutaj protokół był stosowany w naszym laboratorium do RNAi u wielu różnych gatunków kleszczy z rodziny Ixodidae (tabela 1). Ilość wstrzykiwanego do kleszczy dsRNA zależy od wielkości kleszcza; większe gatunki kleszczy mogą przyjąć większą objętość. Kleszcze kontrolne negatywne powinny zostać wstrzyknięte z niepowiązanym dsRNA. Jako kontrole pozytywne można wykorzystać kilka rodzajów dsRNA, takich jak subolesyna^{14-19,22-25,27-32,34} oraz beta-aktyna^20,21. Należy pamiętać, że ważne jest przemycie strzykawki pomiędzy zabiegami, aby uniknąć zmieszania roztworów dsRNA. Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, śmiertelność wynikająca z procedury wstrzykiwania po 24 godzinach powinna być niższa niż 5%. Typowy fenotyp po wyciszeniu genu u kleszczy przedstawiono na rysunku 3, ukazując grupę kleszczy wstrzykniętych z pulami dsRNA w celu przesiewania ochronnych antygenów kleszczy.

Gatunki kleszczy	wstrzyknięte dsRNA	Bibliografia
Ixodes scapularis	biblioteka cDNA, subolesyna, aktyna, nukleotydaza, NF-kB, akiryna	21, 22, 29, 30
Dermacentor variabilis	subolesyna, GST, ubikwityna, vATPase, selenoproteiny M i W2a, białko podobne do komórek macierzystych/progenitorowych układu krwiotwórczego, aktyna, podjednostka proteasomu 26S, ferrytyna 1, warysyna, akiryna	15, 19, 22, 24, 26, 30-32
Dermacentor marginatus	subolezyna	22
*Amblyomma americanum*	biblioteka cDNA, subolesyna, akiryna	17, 22, 30
*Amblyomma hebraeum*	subolesyna, voraksyna	28
Rhipicephalus sanguineus	Rs86, subolesyna	22, 23
Rhipicephalus microplus	GST, ubikwityna, selenoproteina, Bm86, Bm91, subolesyna, GI, GIII, EF1a, flagelliform silk protein, von Willebrand czynnik	16, 18, 25, 27
Rhipicephalus annulatus	ubikwityna, subolesyna, EF1a, GIII	16

Tabela 1. Gatunki kleszczy, w których zastosowano protokół RNAi.

Rycina 1. Umieszczenie kleszczy stroną brzuszną do góry na dwustronnej taśmie klejącej przyklejonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego. Kleszcze są rozmieszczone w grupach po 5 osobników, po czym nad aparatem gębowym umieszcza się mały pasek taśmy maskującej, aby dodatkowo unieruchomić kleszcze, umożliwiając jednocześnie osobie wykonującej iniekcję obserwację ciała kleszcza podczas wstrzykiwania.

Rysunek 2. Procedura iniekcji obejmuje (a) przebicie dolnego prawego kwadrantu egzoszkieletu kleszcza za pomocą strzykawki insulinowej z igłą G 29 w celu stworzenia miejsca wstrzyknięcia, (b) natychmiastową iniekcję dsRNA w tym miejscu za pomocą strzykawki Hamiltona z igłą G 33, co (c) najprawdopodobniej spowoduje niewielki wyciek hemolimfy/płynów kleszcza.

Rysunek 3. Panel sześciu grup kleszczy, w których zastosowano RNAi w celu przesiewania antygenów ochronnych kleszczy u Amblyomma americanum. Zmiany fenotypowe u kleszczy są widoczne w porównaniu z pozytywną kontrolą RNAi dla subolesyny oraz negatywną kontrolą z niespokrewnionym dsRNA. W tym doświadczeniu statystycznie przeanalizowano wpływ RNAi na śmiertelność, masę ciała i składanie jaj w każdej z grup kleszczy.

Dyskusja

Choć opisano inne metody RNAi u kleszczy^{14, 33}, iniekcja dsRNA opisana w niniejszym materiale jest najszerzej stosowana zarówno u kleszczy nieżywionych (Tabela 1), jak i żywionych^16,25,34. Wykazano, że RNAi jest cennym narzędziem do badania funkcji genów kleszczy, charakterystyki interfejsu kleszcz-patogen oraz przesiewania i charakterystyki ochronnych antygenów kleszczy^14,35. W szczególności RNAi stało się najcenniejszym narzędziem do analiz funkcjonalnych u kleszczy³⁵.

Pod względem metodologicznym RNAi prawdopodobnie ewoluuje w kierunku bardziej wydajnych metod, które mogą umożliwić wyciszanie genów u dużej liczby osobników. Mechanizm RNAi indukowanego przez dsRNA u kleszczy powinien zostać dopracowany, aby przyczynić się do lepszego zrozumienia i wykorzystania tego podejścia genetycznego u tego gatunku^35,36. Zakres efektów poza celowych (off-target) RNAi u kleszczy jest również istotną kwestią, która wymaga pełnego wyjaśnienia^14,27. Wreszcie, RNAi najprawdopodobniej wniesie znaczący wkład w badania nad regulacją genów i biologią systemową kleszczy oraz nad interakcjami na styku kleszcz-patogen, co może mieć wpływ na opracowanie szczepionek służących do zwalczania infestacji kleszczami oraz transmisji patogenów przenoszonych przez kleszcze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System do RT-PCR Access	Promega	A1250
Zestaw do oczyszczania PCR Purelink	Invitrogen	K3100-02
Zestaw Megascript RNAi	Ambion	AM1626M
Czerwony wosk dentystyczny	Electron Microscopy Sciences	72674
Kubki plastikowe z pokrywkami, 1,25 oz	Solo Cup Company, Urbana Ill.
Pęseta precyzyjna	Electron Microscopy Sciences	Różne
Strzykawka insulinowa	Monoject		Wyposażona w igłę ½", 29 G
Strzykawka Hamiltona	Hamilton	701SN,33/.375”/45DGR	Wykonana na zamówienie
TriReagent	Sigma	93289
Zestaw iScript One-Step RT-PCR z SYBR Green	Bio-Rad	170-8892
System do detekcji PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	Kilka	Prosimy odnieść się do http://www.bio-rad.com/