Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Podsumowanie

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Streszczenie

Przesiewanie genetyczne jest jedną z najpotężniejszych dostępnych metod pozwalających na uzyskanie wglądu w złożone procesy biologiczne ¹. Na przestrzeni lat opracowano wiele ulepszeń i narzędzi do manipulacji genetycznych u Drosophila ². Wkrótce po odkryciu dokonanym przez Frie i Mello ³, że dwuniciowy RNA może być wykorzystany do wyciszenia aktywności pojedynczych genów u Caenorhabditis elegans, wykazano, że interferencja RNA (RNAi) stanowi potężne podejście genetyki odwrotnej do analizy funkcji genów w rozwoju organów Drosophila ^{4, 5}.

Wiele organów, w tym płuca, nerki, wątroba i układ naczyniowy, składa się z rozgałęzionych sieci cewkowych, które transportują żywotne płyny lub gazy ^{6, 7}. Analiza formowania się cewii u Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania morfogenezy innych organów cewkowych ⁸. Projekt genomu Drosophila realizowany w Berkeley ujawnił setki genów eksprymowanych w układzie cewii. Aby zbadać molekularne i komórkowe mechanizmy formowania cewek, kluczowym wyzwaniem jest zrozumienie roli tych genów w rozwoju układu cewii. W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółową metodę wstrzykiwania dsRNA do embrionów Drosophila w celu wyciszenia ekspresji poszczególnych genów. Pomyślnie wyciszyliśmy endogenną ekspresję genu dysfusion(dys) poprzez wstrzyknięcie dsRNA. Dys jest białkiem bHLH-PAS eksprymowanym w komórkach fuzji cewii i jest niezbędne do fuzji odgałęzień cewii ^{9, 10}. dys-RNAi całkowicie wyeliminowało ekspresję dys, co doprowadziło do defektu fuzji cewii. Ta stosunkowo prosta metoda dostarcza narzędzia do identyfikacji genów niezbędnych do rozwoju tkanek i organów u Drosophila.

Protokół

1. Pobieranie zarodków

1. Przygotować klatki w temperaturze 25°C, używając 2-4 dniowych much w¹¹¹⁸. Podłoża z sokiem z winogron wymieniać co godzinę w ciągu dnia, aby zsynchronizować zbiór jaj w okresie 1-2 dni przed właściwym pobraniem
2. Zbierać embriony przez 1 h w temperaturze 25°C
3. Wyciąć prostokątny kawałek agaru z sokiem z winogron, naciąć go lekko w środku żyletką, pozostawiając linię w agarze
4. Za pomocą metalowej sondy przenieść embriony z płytki z sokiem z winogron na przygotowany kawałek agaru, ustawiając je w prostej linii, tak aby dłuższa oś embrionu była pod kątem 45 stopni względem linii w środku agaru. Ułożyć prostą linię z około 50 embrionów. Upewnić się, że wszystkie embriony są skierowane w tym samym kierunku, z końcem tylnym skierowanym na zewnątrz od linii
5. Wyciąć prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej i przykleić go do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18x18 mm
6. Pobrać embriony za pomocą dwustronnej taśmy na szkiełku nakrywkowym
7. Położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym i suszyć embriony na powietrzu przez około 10 min
8. Przykryć embriony cienką warstwą oleju Halocarbon 700; są one teraz gotowe do iniekcji

2. Wyciąganie igły

Przygotować igły do mikroiniekcji poprzez wyciąganie szklanych kapilar. Używamy wyciągarki do igieł firmy World Precision Instrument (Model PUL-1). Specyfikacja programu wyciągarki to: heat: 1, delay 4.

3. Napełnianie igieł

Napełnij igły od tyłu, używając pipety Eppendorf p20 z końcówkami Eppendorf Microloader, zazwyczaj nabierając 1.5-2 μL dsRNA

4. Przełam igły

1. Przed złamaniem igły umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym.
2. Przygotuj szkiełko przedmiotowe z kroplą oleju w jego środkowej części.
3. Włącz mikropompę Picospritzer III, aby wyregulować ciśnienie powietrza.
4. Złam wypełnioną igłę o krawędź szkiełka nakrywkowe, tworząc ostry czubek.
5. Po złamaniu końcówki nacisnąć pedał sterujący mikropompy Picospritzer III, aby z końcówki igły wypłynęła niewielka ilość dsRNA.
6. Wyjmij szkiełko z nakrywką.
7. Wprowadź igłę pod kroplę oleju w środku wcześniej przygotowanego szkiełka przedmiotowego.
8. Dostosuj ustawienia mikropompy Picospritzer III tak, aby po naciśnięciu pedału wydzielano 100-200pl dsRNA. dsRNA powinno być widoczne jako mała kropelka.

5. Iniekcja

1. Zbliż końcówkę igły do tylnej części zarodka w stadium pierwszej blastodermy, dopasowując ją do tej samej płaszczyzny ogniskowej, a następnie wykonaj wtryskiwanie poza centrum, w odległości około 30-50% długości jaja.
2. Po naciśnięciu pedału pompy piko-mikropompowej Picospritzer III, niewielka ilość dsRNA pojawi się w miejscu wstrzyknięcia w postaci małej kropki.

6. Analiza fenotypowa

1. Po wstrzyknięciu umieść szkiełko w przykrytej wilgotnej komorze (plastikowa szalka Petriego) w temperaturze 18°C, aż embriony rozwiną się do pożądanego stadium embrionalnego.
2. Za pomocą sondy usuń embriony z dwustronnej taśmy i przesuń je do krawędzi szkiełka nakrywkowego.
   Zmyj embriony ze szkiełka do probówki zbiorczej z nylonowym sitkiem na dnie, używając heptanu, a następnie przemyj 3 razy roztworem PBT.
   Przeprowadź dechorionację embrionów w 50% wybielaczu przez 5 min, a następnie przemyj 3 razy roztworem PBT.
   Przenieś embriony z probówki zbiorczej na fragment nylonowego sitka, a następnie zanurz sitko w roztworze utrwalającym (5ml heptanu, 4.5ml PBS, 0.5ml 37% formaldehydu), aby uwolnić embriony. Utrwalaj embriony w roztworze utrwalającym przez 30min.
   Przeprowadź dewitellinizację embrionów za pomocą metanolu, przenieś embriony do probówki typu Eppendorf i przeprowadź immunobarwienie embrionów zgodnie ze standardowymi protokołami.
3. Embriony mogą być również rozwijane do odpowiedniego stadium larwalnego.
4. Przygotuj szkiełko z kroplą oleju Halocarbon 700 na środku.
5. Przenieś jedną larwę na szkiełko i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.
6. Obserwuj larwy pod mikroskopem w polu jasnym.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykład wyciszenia genu dysfusion (dys) za pomocą dsRNA w embrionie Drosophila przedstawiono na Rys. 1. Embriony wstrzyknięte z GFP-dsRNA stanowią kontrolę negatywną. Dys jest czynnikiem transkrypcyjnym bHLH PAS eksprymowanym w komórkach fuzji tchawki. Embriony wstrzyknięte z GFP-dsRNA wykazują prawidłową fuzję tchawki, a białko Dys jest obecne w komórkach fuzji (Rysunek 1A). Z kolei embriony wstrzyknięte z dys-dsRNA wykazują brak fuzji odgałęzień, a białka Dys nie są obecne w komórkach fuzji (Rysunek 1B). Gdy embriony po wstrzyknięciu dsRNA rozwinęły się do stadium larwalnego, larwy po wstrzyknięciu dys-dsRNA wykazywały brak fuzji odgałęzień (Rys. 1D) w porównaniu do kontroli negatywnej po wstrzyknięciu GFP-dsRNA (Rysunek 1C). Wyniki te wykazały skuteczne wyciszenie endogennej ekspresji genu dys poprzez wstrzyknięcie dsRNA do embrionów Drosophila

Rysunek 1. Usunięcie funkcji dys poprzez dys-RNAi ujawnia defekty fuzji tchawic. Zarodki w stadium blastodermy (w¹¹¹⁸) wstrzyknięto GFP-dsRNA (kontrola negatywna) lub dys-dsRNA, a następnie poddano analizie pod kątem defektów tchawic. (A) Zarodek w stadium 16 po wstrzyknięciu GFP-dsRNA, barwiony przeciwciałami α-Dys oraz MAb 2A12 barwiącymi światło tchawic. Wyraźnie widoczny jest zrośnięty boczny pień. Strzałki wskazują komórki fuzji pnia bocznego wykazujące obecność Dys. (B) Zarodek w stadium 16 po wstrzyknięciu dys-dsRNA, barwiony przeciwciałami α-Dys oraz MAb 2A12. W zarodku stwierdzono brak fuzji pnia bocznego (gwiazdka wskazuje normalną lokalizację fuzji pnia bocznego w zarodkach kontrolnych). Nie zaobserwowano komórek wykazujących obecność Dys, co wskazuje, że dys-RNA skutecznie zniosło ekspresję białka Dys. (C do D) Larwy drugiego stadium po wstrzyknięciu GFP-dsRNA lub dys-dsRNA zbadano pod kątem defektów tchawic za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. (C) Miejsca fuzji są zaznaczone gwiazdką w larwach kontrolnych po wstrzyknięciu GFP-dsRNA. (D) W larwach po wstrzyknięciu dys-RNA nie doszło do fuzji pnia bocznego; (*) wskazuje normalną lokalizację fuzji pnia bocznego.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda wstrzykiwania dsRNA umożliwia bardzo czułą i szybką analizę funkcji genów w rozwoju cewy oddechowej Drosophila. Metodę tę można potencjalnie zastosować do analizy funkcji genów w rozwoju innych tkanek i narządów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Olej halowęglowy 700	Sigma-Aldrich	H8898
Pikopompa Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Mikropipety	Fisher Scientific	21170M
Mikroładownice	Eppendorf	930001007