Artykuł metodologiczny

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

15.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2477

⸱

11 kwietnia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Oakland University

W tym artykule

Podsumowanie

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Streszczenie

Przesiewanie genetyczne jest jedną z najpotężniejszych dostępnych metod pozwalających na uzyskanie wglądu w złożone procesy biologiczne 1. Na przestrzeni lat opracowano wiele ulepszeń i narzędzi do manipulacji genetycznych u Drosophila 2. Wkrótce po odkryciu dokonanym przez Frie i Mello 3, że dwuniciowy RNA może być wykorzystany do wyciszenia aktywności pojedynczych genów u Caenorhabditis elegans, wykazano, że interferencja RNA (RNAi) stanowi potężne podejście genetyki odwrotnej do analizy funkcji genów w rozwoju organów Drosophila 4, 5.

Wiele organów, w tym płuca, nerki, wątroba i układ naczyniowy, składa się z rozgałęzionych sieci cewkowych, które transportują żywotne płyny lub gazy 6, 7. Analiza formowania się cewii u Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania morfogenezy innych organów cewkowych 8. Projekt genomu Drosophila realizowany w Berkeley ujawnił setki genów eksprymowanych w układzie cewii. Aby zbadać molekularne i komórkowe mechanizmy formowania cewek, kluczowym wyzwaniem jest zrozumienie roli tych genów w rozwoju układu cewii. W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółową metodę wstrzykiwania dsRNA do embrionów Drosophila w celu wyciszenia ekspresji poszczególnych genów. Pomyślnie wyciszyliśmy endogenną ekspresję genu dysfusion(dys) poprzez wstrzyknięcie dsRNA. Dys jest białkiem bHLH-PAS eksprymowanym w komórkach fuzji cewii i jest niezbędne do fuzji odgałęzień cewii 9, 10. dys-RNAi całkowicie wyeliminowało ekspresję dys, co doprowadziło do defektu fuzji cewii. Ta stosunkowo prosta metoda dostarcza narzędzia do identyfikacji genów niezbędnych do rozwoju tkanek i organów u Drosophila.

Protokół

1. Pobieranie zarodków

  1. Przygotować klatki w temperaturze 25°C, używając much w wieku 2-4 dni szczepu w1118. Pożywki z sokiem z winogron należy wymieniać co godzinę w ciągu dnia, aby zsynchronizować zbieranie jaj w okresie 1-2 dni przed właściwą kolekcją
  2. Zbierać embriony przez 1 h w temperaturze 25°C
  3. Wyciąć prostokątny kawałek agaru z sokiem z winogron i lekko naciąć go w środku żyletką, pozostawiając linię w agarze
  4. Za pomocą metalowej sondy przenieść embriony z płytki z sokiem z winogron na przygotowany kawałek agaru, ustawiając je w prostej linii tak, aby dłuższa oś embrionu tworzyła kąt 45 stopni względem linii w środku agaru. Ułożyć prostą linię z około 50 embrionów. Upewnić się, że wszystkie embriony są skierowane w tę samą stronę, z końcem tylnym skierowanym w stronę przeciwną do linii
  5. Wyciąć prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej i przykleić go do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18x18 mm
  6. Podnieść embriony za pomocą dwustronnej taśmy na szkiełku nakrywkowym
  7. Położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i suszyć embriony na powietrzu przez około 10 min
  8. Przykryć embriony cienką warstwą oleju Halocarbon 700; w tym momencie są one gotowe do iniekcji

2. Igła do pobierania

Wykonaj igły do mikroiniekcji poprzez wyciąganie szklanych rurek kapilarnych. Używamy wyciągarki do igieł firmy World Precision Instrument (Model PUL-1). Parametry programu wyciągarki to: heat: 1, delay 4.

3. Napełnianie igieł

Napełnij igły od tyłu, używając pipety Eppendorf p20 z końcówkami Eppendorf Microloader, ładując zazwyczaj 1.5-2 μL dsRNA

4. Przełamanie igieł

  1. Przed odłamaniem igły umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym.
  2. Przygotuj szkiełko przedmiotowe, umieszczając kroplę oleju w jego środkowej części.
  3. Włącz mikropompę Picospritzer III, aby dostosować ciśnienie powietrza.
  4. Odłam napełnioną igłę o krawędź szkiełka nakrywkowe, tworząc ostry czubek.
  5. Po odłamaniu końcówki naciśnij pedał mikropompy Picospritzer III, aby z czubka igły wypłynęło nieco dsRNA.
  6. Wyjmij szkiełko przedmiotowe z nakrywką.
  7. Wprowadź igłę pod kroplę oleju w centrum wcześniej przygotowanego szkiełka przedmiotowego.
  8. Dostosuj ustawienia mikropompy Picospritzer III tak, aby po naciśnięciu pedału wydzielono 100-200pl dsRNA. dsRNA powinno być widoczne jako mała kropelka.

5. Wstrzykiwanie

  1. Zbliż końcówkę igły do tylnej części pierwszego embrionu w stadium blastodermy, doprowadzając ją do tej samej płaszczyzny ogniskowej, a następnie wykonaj wstrzyknięcie poza centrum, w odległości około 30-50% długości jaja.
  2. Po naciśnięciu pedału pompy mikroprzepływowej Picospritzer III, w miejscu wstrzyknięcia pojawi się niewielka ilość dsRNA w postaci małej kropki.

6. Analiza fenotypowa

  1. Po wstrzyknięciu umieść szkiełko w przykrytej wilgotnej komorze (plastikowej płytce Petriego) w temperaturze 18°C, aż embriony osiągną pożądany stopień rozwoju zarodkowego.
  2. Za pomocą sondy usuń embriony z dwustronnej taśmy i przesuń je do krawędzi szkiełka nakrywkowe.
    Zmyj embriony ze szkiełka do probówki zbiorczej z nylonowym sitkiem na dnie, używając heptanu, a następnie przemyj 3 razy roztworem PBT.
    Przeprowadź dechorionację embrionów w 50% wybielaczu przez 5 min, a następnie przemyj 3 razy roztworem PBT.
    Przenieś embriony z probówki zbiorczej na fragment nylonowej siatki, a następnie zanurz siatkę w roztworze utrwalającym (5ml heptanu, 4,5ml PBS, 0,5ml 37% formaldehydu), aby uwolnić embriony. Utrwalaj embriony w roztworze utrwalającym przez 30min.
    Przeprowadź dewitellinizację embrionów metanolem, przenieś embriony do probówki typu Eppendorf i przeprowadź immunobarwienie embrionów zgodnie ze standardowymi protokołami.
  3. Embriony mogą również rozwijać się do odpowiedniego stadium larwalnego.
  4. Przygotuj szkiełko z kroplą oleju Halocarbon 700 na środku.
  5. Przenieś jedną larwę na szkiełko i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.
  6. Obserwuj larwy pod mikroskopem w świetle przechodzącym.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykład wyciszenia genu dysfusion (dys) za pomocą dsRNA w embrionie Drosophila przedstawiono na Rys. 1. Embriony z wstrzykniętym GFP-dsRNA stanowią kontrolę negatywną. Dys jest czynnikiem transkrypcyjnym bHLH PAS wykazującym ekspresję w komórkach fuzji tchawkowych. Embriony z wstrzykniętym GFP-dsRNA wykazują prawidłową fuzję tchawkową, a białko Dys jest obecne w komórkach fuzji (Rysunek 1A). Z kolei embriony z wstrzykniętym dys-dsRNA wykazują niepowodzenie fuzji odgałęzień, a białka Dys nie są obecne w komórkach fuzji (Rysunek 1B). Po rozwoju embrionów z wstrzykniętym dsRNA do stadium larwalnego, larwy z wstrzykniętym dys-dsRNA wykazały brak fuzji odgałęzień (Rys. 1D) w porównaniu do kontroli negatywnej z wstrzykniętym GFP-dsRNA (Rysunek 1C). Wyniki te wykazały skuteczne wyciszenie endogennej ekspresji genu dys poprzez wstrzyknięcie dsRNA do embrionów Drosophila

figure-protocol-1
Rycina 1. Usunięcie dys poprzez dys-RNAi ujawnia defekty fuzji tchawic. Zarodki blastodermy (w1118) wstrzyknięto GFP-dsRNA (kontrola negatywna) lub dys-dsRNA, a następnie przebadano pod kątem defektów tchawic. (A) Zarodek w stadium 16 wstrzyknięty GFP-dsRNA i barwiony α-Dys oraz MAb 2A12, który barwi światło tchawic. Wyraźnie widoczny jest zrośnięty boczny pień. Strzałki wskazują komórki fuzji bocznego pnia wykazujące obecność Dys. (B) Zarodek w stadium 16 wstrzyknięty dys-dsRNA i barwiony α-Dys oraz MAb 2A12. Zarodek wykazał brak fuzji bocznego pnia (gwiazdka wskazuje normalną lokalizację fuzji bocznego pnia w zarodkach kontrolnych). Nie zaobserwowano komórek wykazujących obecność Dys, co wskazuje, że dys-RNA skutecznie zniosło ekspresję białka Dys. (C do D) Larwy drugiego stadium z GFP-dsRNA lub dys-dsRNA przebadano pod kątem defektów tchawic za pomocą mikroskopii w polu jasnym. (C) Miejsca fuzji są zaznaczone gwiazdką w larwach kontrolnych wstrzykniętych GFP-dsRNA. (D) W larwach wstrzykniętych dys-RNA nie doszło do fuzji bocznego pnia; (*) wskazuje normalną lokalizację fuzji bocznego pnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda wstrzykiwania dsRNA umożliwia bardzo czułą i szybką analizę funkcji genów w rozwoju cewy oddechowej Drosophila. Metodę tę można potencjalnie zastosować do analizy funkcji genów w rozwoju innych tkanek i narządów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Stephenowi Crewsowi za cDNA dysfusion, przeciwciało Dys oraz muchy w1118.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Olej halowęglowy 700Sigma-AldrichH8898
Pikopompa Picospritzer IIIParker Hannifin Corporation051-0500-900
MikropipetyFisher Scientific21170M
MikroładowniceEppendorf930001007

Bibliografia

  1. St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
  3. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  4. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  5. Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
  6. Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
  7. Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
  8. Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
  9. Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
  10. Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interferencja RNAwyciszenie genurozw j tchawkizbieranie zarodk wtechnika mikroiniekcjimikroskopia w polu jasnymbarwienie przeciwcia amirozw j organ w

Powiązane artykuły