Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Streszczenie

Neurogeneza w mózgu postnatalnym zależy od utrzymania trzech zdarzeń biologicznych: proliferacji komórek progenitorowych, migracji neuroblastów oraz różnicowania i integracji nowych neuronów z istniejącymi obwodami neuronalnymi. W przypadku neurogenezy postnatalnej w opłatyczkach węchowych zdarzenia te są rozdzielone pomiędzy trzy anatomicznie odrębne domeny: proliferacja zachodzi głównie w strefie podependymalnej (SEZ) komór bocznych, migrujące neuroblasty przemieszczają się przez rostralny strumień migracyjny (RMS), a nowe neurony różnicują się i integrują w obrębie opłatyczków węchowych (OB). Te trzy domeny stanowią idealne platformy do badania mechanizmów komórkowych, molekularnych i fizjologicznych, które w odrębny sposób regulują każde z tych zdarzeń biologicznych. Niniejsza praca opisuje zoptymalizowany dla postnatalnej tkanki mózgowej test na organotypowych skrawkach, w którym warunki zewnątrzkomórkowe ściśle naśladują środowisko in vivo dla migrujących neuroblastów. Wykazujemy, że nasz test zapewnia jednolity, zorientowany i szybki ruch neuroblastów w obrębie RMS. Test ten będzie bardzo przydatny do badania autonomicznej i nieautonomicznej regulacji migracji neuronalnej z wykorzystaniem metod transplantacji krzyżowej u myszy o różnych podłożach genetycznych.

Protokół

I. Procedury

Poniższe techniki należy przeprowadzać w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając wysterylizowanych narzędzi.

Przygotowanie szalek z szklanym dnem do skrawków organotypowych

1. Szalki należy przygotować w środowisku sterylnym, używając wysterylizowanych narzędzi.
2. W centrum szklanego dna szalki umieszcza się ostrożnie kroplę 150μL pożywki do plastrów (patrz przepisy), dbając o to, aby w pożywce nie powstały pęcherzyki powietrza.
3. Za pomocą jednorazowej strzykawki z igłą 23 Gauge w kilku miejscach nanosi się klej (Rubber Cement - Elmer's, kat# E904) na kwadratowe krawędzie przylegające do okrągłego szkiełka nakrywkowego znajdującego się w centrum naczynia hodowlanego, pozostawiając jedną stronę niezaklejoną w celu umożliwienia wymiany płynów (Rycina 1). Wymieniony rodzaj kleju nie jest toksyczny dla plastrów ani komórek w zastosowaniu zgodnie z niniejszym protokołem. Należy uważać, aby nie nanieść kleju na szklane szkiełko nakrywkowe, ponieważ utrudni to i przeszkodzi w późniejszym obrazowaniu plastrów. Na szklane szkiełko nakrywkowe nakłada się membranę nukleoporową (średnica 25mm, wielkość porów 8,0μm - Whatman, kat# 10614), wykorzystując kropki kleju do jej utrwalenia. Czynność tę należy wykonać za pomocą mikropincety, upewniając się, że między szkiełkiem nakrywkowym a membraną nie uwięzły pęcherzyki powietrza.
4. Na membranę dodaje się 1 mL pożywki do plastrów. Szalki umieszcza się w inkubatorze na 30 minut, a następnie na lodzie do momentu użycia.

Wyizolowanie mózgów wczesnopostnatalnych

Najlepsze wyniki uzyskuje się, przygotowując skrawki z młodych myszy ponatalnych (P1-P10).

1. Szczenięta zostają poddane anestezji terminalnej (przedawkowaniu) przy użyciu izofluranu lub innych zatwierdzonych metod. Głowę można spryskać 70% etanolem w celu zwiększenia sterylności, a następnie przeprowadzić szybką dekapitację za pomocą ostrych nożyczek.
2. Głowę stabilizuje się poprzez uchwycenie żuchwy mikropincetą. Skórę wycina się wzdłużnie od szyi do pyszczka. Czaszkę przecina się wzdłużnie i przednio, zaczynając od cysterny wielkiej (cisterna magna), wykonując jedno cięcie przyśrodkowe i dwa boczne (po jednym z każdej strony – Rysunek 2A). Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować kontakt z leżącą poniżej tkanką korową podczas usuwania płatów czaszki od mózgu.
3. Aby zwiększyć stabilność tkanki podczas krojenia na wibratomie, usuwa się najbardziej bocznie położone fragmenty mózgu, wykonując dwa cięcia strzałkowe. Usuwa się również tylną część mózgu, wykonując cięcie u podstawy móżdżku od strony rostralnej (Rysunek 2B).
4. Dwie półkule rozdziela się, wykonując gładkie cięcie wzdłuż szczeliny środkowej, a następnie ostrożnie wyjmuje się je z czaszki i umieszcza powierzchnią przyśrodkową dołu w formie do zatapiania (Rys. 2C-D).

Przecinanie mózgu gospodarza

1. Dwie półkule w formie do zatapiania są natychmiast przykrywane stopionym 3% niskotopliwym żelem agarozy klasy DNA (Fisher, kat# BP1360-10) rozpuszczonej w buforze do przygotowania tkanek utrzymywanym w temperaturze 37°C (patrz przepisy). Po 2 minutach stabilizacji na płaskiej poziomej powierzchni w celu zapewnienia równomiernego utwardzenia agarozy, formy są umieszczane na lodzie do całkowitego zastygnięcia.
2. Po zastygnięciu żelu zawierającego półkule, zostaje on wyjęty z formy i przycięty, pozostawiając 2-3mm żelu wokół tkanki mózgowej.
3. Tkanka zatopiona w żelu jest następnie montowana na dysku do preparatów w wibrotomie, powierzchnią przyśrodkową do góry i mocowana za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Krazy glue lub odpowiednik). Należy zachować ostrożność i nakładać minimalne ilości kleju, ponieważ nadmiar może wywierać toksyczny wpływ na skrawki i migrujące komórki. Zbyt duża ilość kleju na bokach bloku będzie również utrudniać cięcie, co może spowodować uszkodzenie tkanki.
4. Dysk jest instalowany w tacy na preparaty wibrotomu wypełnionej lodowatym medium do przygotowania tkanek.
5. Tkankę tnie się na skrawki o grubości 150μm, przy prędkości wibrotomu ustawionej w zakresie od niskiej do średniej (zależnie od używanego wibrotomu, co należy ustalić niezależnie w celu uzyskania optymalnych wyników). W naszych doświadczeniach optymalna częstotliwość drgań jest osiągana przy maksymalnym ustawieniu. Pierwsze kilka skrawków może zostać odrzuconych.
6. Gdy tylko skrawki zawierające RMS zostaną zwolnione z ostrza (RMS jest widoczny gołym okiem jako szara struktura w kształcie litery U rozciągająca się od SEZ do OB), są one ostrożnie wyjmowane z formy żelowej i nabierane za pomocą małej szpatułki z płaskim grotem. Skrawki są umieszczane na membranie nukleoporowej naczyń z szklanym dnem zawierających medium do skrawków (Rycina 3A-B). Typowy mózg myszy we wczesnym okresie postnatalnym pozwala na uzyskanie około 2-3 sekcji RMS na półkulę przy cięciu 150 μm. Krytyczne jest ograniczenie manipulacji skrawkami do minimum, ponieważ są one bardzo kruche. Naczynia ze skrawkami są następnie przenoszone do inkubatora.

Sekcjonowanie mózgu dawcy i transplantacja RMS

1. Mózgi dawców (mózgi wykazujące ekspresję fluorescencyjnych reporterów w migrujących neuroblastach) są przecinane na plastry o grubości 250μm, a plastry są zbierane w lodowatym buforze do przygotowania tkanek.
2. Plastry są bezzwłocznie umieszczane pod mikroskopem stereoskopowym z możliwością epifluorescencji, a RMS jest delikatnie mikrodissekowany za pomocą mikropincet. Jedna pęseta służy do stabilizacji plastra, podczas gdy druga jest używana do wykonywania małych nacięć wokół RMS, aż zostanie on oddzielony od plastra. Wycięty RMS jest następnie dzielony na małe eksplanty (o średnicy około 20-500 μm) przed transplantacją.
3. Szalki z szklanym dnem zawierające plastry gospodarza umieszczone na filtrach nukleoporowych są wyjmowane z inkubatora i umieszczane pod mikroskopem stereoskopowym. Przy użyciu światła widzialnego wyraźnie identyfikuje się RMS i wykonuje małe nacięcie w początkowym odcinku RMS.
4. Za pomocą pipetora wyposażonego w końcówkę 20 μL pojedynczy eksplant RMS dawcy jest przenoszony do miejsca nacięcia w RMS gospodarza. Eksplant jest delikatnie wpychany w nacięcie, aby ustanowić kontakt między obiema tkankami. Aby zapewnić stabilność tego kontaktu, eksplanty są lekko dociskane pomiędzy plaster a membranę nukleoporową.
5. Po dokonaniu transplantacji do wszystkich plastrów gospodarza z RMS, szalki są zawracane do inkubatora na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić osadzenie się przekrojów na membranie. Neuroblasty powinny zacząć migrować z eksplantu do RMS gospodarza po około 1-2 godzinach.

Obrazowanie pokrzykowe (time-lapse) migracji neuronów

1. Szalki z szklanym dnem przenosi się z inkubatora do komory inkubacyjnej mikroskopu (Rysunek 3C). Obrazowanie fluorescencyjnych neuroblastów można przeprowadzać w odstępach od 0 do 10 minut, w zależności od pożądanego rodzaju analizy. Na przykład dynamikę cytoszkieletu podczas cyklu migracyjnego poszczególnych neuroblastów obrazujemy, ustawiając odstępy na wartość mniejszą lub równą 2,5 minut. Natomiast dynamika populacyjna, taka jak orientacja i prędkość migracji, jest lepiej uchwycona w odstępach od 5 do 10 minut. Wybór obiektywów jest bardzo zróżnicowany w zależności od marki mikroskopu. W przypadku konfokalnego mikroskopu Nikon C1 stwierdziliśmy, że obiektyw suchy 20x (Nikon Pan Fluor, N.A. 0,75, W.D. 0,35mm) jest najbardziej odpowiedni do naszych analiz. Aby uzyskać najlepsze rezultaty w tym systemie konfokalnym, otwór pinhole ustawia się na średnią wielkość (średnica 60μm). Aby uzyskać najbardziej reprezentatywne zachowania migracyjne, obrazowanie ogranicza się do komórek znajdujących się głęboko w obrębie RMS, w odległości co najmniej 20 μm od obu przeciętych powierzchni skrawka. Moc lasera powinna być zoptymalizowana tak, aby była minimalna, ale szczegóły poszczególnych neuroblastów pozostały widoczne.
2. Po zakończeniu obrazowania skrawki można utrwalić w lodowatym, świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie, poddać immunohistochemii i osadzić na szkiełkach do dalszego obrazowania. Ponieważ nie powlekamy naszych membran żadnymi substratami adhezyjnymi, takimi jak laminina, skrawki zazwyczaj odrywają się od membrany po zanurzeniu w buforach barwiących. Sekcje są obrazowane z zachowaniem ich grubości 150 μm. Możliwe jest również kriokonserwowanie i zamrażanie skrawków oraz użycie kriosztatu do uzyskania cieńszych sekcji z oryginalnych skrawków. Będzie to jednak skutkować zwiększeniem częstotliwości występowania artefaktów barwienia oraz zmianą integralności tkanki.

II. Materiały/sprzęt

Przygotowanie szalek z szklanym dnem do skrawków organotypowych

• Małe strzykawki (1 mL)
• Igły G23
• Membrana Nucleopore Track-Etch - średnica 25mm, rozmiar porów 8.0μm - Whatman, kat# 110614
• Szalki hodowlane z szklanym dnem - szalka Petriego 35mm, mikrootwór 14mm, szkiełko nakrywowe nr 1.5 - MatTech, kat# P35G-1.5-14-C
• Klej gumowy - Elmer's, kat# E904
• Podłoże podstawowe Eagle - Gibco, kat# 21010
• 1M Hepes (pH7.4)
• 1M D-glukoza
• 10mM CaCl₂
• 10mM MgSO₄
• 1M NaHCO₃
• dH₂O
• 20mM L-glutamina
• Penicylina-streptomycyna

Wyjęcie i zatapianie mózgu

• Środek znieczulający (izofluran itp.)
• Kuchenka mikrofalowa
• Agaroza o niskiej temperaturze topnienia - Fisher, kat# BP1360-10
• Klej błyskawiczny (Krazy glue) - kat#KG585
• Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way (R-40) - prostokątne 2mmx40mm, głębokość 20mm - Polysciences, kat# 18646C

Sekcjonowanie mózgu i transplantacja RMS

• Vibratom - Leica VT10S oraz wszystkie komponenty akcesoryjne do przygotowania skrawków
• 10X zrównoważony roztwór soli Hank’a - Gibco, kat# 14185
• Pinceta do mikrodissekcji #5 - Roboz, kat# RS-4976
• Mikroszpatułka - Fisher, kat# 21-401-15
• Stereomikroskop

Obrazowanie time-lapse przekrojów organotypowych

• Inkubator z nawilżaczem, 5% CO₂
• Mikroskop odwrócony wyposażony w komorę inkubacyjną i obiektywy z dużą odległością roboczą (NA 0,6 lub wyższa)

III. Receptury

Roztwór buforowy do sekcji tkanek i przygotowania skrawków (bufor do przygotowania tkanek)

Roztwór zapasowy	Tom	Stężenie końcowe
10X HBSS	50 ml	1X
1M Hepes (pH 7,4)	1,25 ml	2,5 mM
1M D-glukoza	15 ml	30mM
1 M CaCl22	0,5 ml	1 mM
1M MgSO44	0,5 ml	1 mM
1M NaHCO33	2 ml	4 mM
dH2O	430,75 ml

Przefiltruj przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji i przechowuj w temperaturze 4°C.

Pożywka hodowlana dla skrawków organotypowych, transplantacji tkanek i obrazowania (pożywka do skrawków)

Roztwór zapasowy	Objętość	Stężenie końcowe
Basal Medium Eagle	35 mL
Bufor do przygotowania tkanek	12.9 mL
1M D-Glucose	1.35 mL	20mM
20mM L-glutamine	0.25 mL	1mM
Penicillin-streptomycin	0.5 mL	10units/ mL penicyliny i 0.1mg/ mL streptomycyny

Przefiltruj w celu sterylizacji przez filtr 0,2 μm i przechowuj w temperaturze 4°C.

Przygotowanie żelu z agarozy o niskiej temperaturze topnienia

Agarozę o niskiej temperaturze topnienia rozcieńczono w buforze do przygotowania tkanek w stężeniu 0,3 g/mL w 50 mL probówce stożkowej (patrz przepisy). Probówkę podgrzewano w mikrofalówce w interwałach 5–10 sekund przy wysokiej mocy. Liczba interwałów zależy od całkowitej objętości; dla 10 mL wystarczające powinny być trzy interwały (odpowiednio 10, 8 i 5 sekund). Między poszczególnymi etapami podgrzewania należy ostrożnie odkręcać zakrętkę probówki, aby wyrównać ciśnienie powietrza i zapobiec rozsadzeniu probówki. Należy zachować ostrożność, ponieważ zawartość probówki będzie bardzo gorąca. Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy probówkę utrzymywano w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez co najmniej 5 minut, aby temperatura ustabilizowała się przed użyciem. Długotrwałe wystawienie na temperaturę pokojową spowoduje stwardnienie żelu. Choć należy tego unikać w miarę możliwości, stwardniały żel można ponownie podgrzać i roztopić do natychmiastowego użycia w ciągu 24 godzin od początkowego przygotowania.

Immunohistochemia na przekrojach organotypowych

Po obrazowaniu za pomocą mikroskopu konfokalnego przekroje można utrwalać przez noc w temperaturze 4°C w 4% formaldehydzie w PBS. Następnie sekcje blokuje się przez noc w temperaturze 4°C w 10% surowicy koziej z 1% Triton X (Sigma, Cat. # S26-36-23) w PBS, po czym przeprowadza się inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4°C. Do wizualizacji stosuje się znakowane fluorescencyjnie wtórne przeciwciała kozie (wszystkie rozcieńczone 1:10, inkubacja przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej). Znakowane przekroje płucze się dokładnie 5-6 razy w lodowatym PBS przed zamontowaniem na szkiełkach przedmiotowych i przykryciem szkiełkami nakrywkowymi.

IV. Reprezentatywne wyniki

Nasz protokół organotypowej hodowli plastrów był dokładnie testowany i optymalizowany przez ostatnie kilka lat w celu zapewnienia spójności wzorca i orientacji migracji. Analiza komórek emigrujących z eksplantów uzyskanych od myszy, w których ekspresja czerwonego białka fluorescencyjnego, Td-tomato, jest indukowana pod promotorem Nestin (Nestin-Td tomato), wykazuje silnie zorientowaną i szybką migrację neuroblastów tdTomato+ do RMS gospodarza (Ryc. 4A). Analiza time-lapse przy dużym powiększeniu obrazuje doskonałą rozdzielczość całej długości migrującego neuroblasta podczas 20-minutowej sesji obrazowania (Ryc. 4B).

Przekroje zawierające komórki dawcy Td-tomato+ utrwalono i poddano immunobarwieniu w celu wykazania różnych komponentów komórkowych w obrębie RMS. Astrocyty GFAP+ oraz naczynia krwionośne CD31+ zidentyfikowano za pomocą fluorescencyjnej immunohistochemii (Rysunek 5A). Analiza przekrojów w dużym powiększeniu, barwionych na białka cytoszkieletu – aktynę i tubulinę – ujawniła niejednorodną ekspresję tych komponentów w komórce znajdującej się w trakcie migracji (Rysunek 5B).

Przeciwciała użyte w tych przykładach: królicze anty-RFP (Abcam, 1:250), królicze anty-GFAP (Dako, 1:10), szczurze anty-CD31 (BD Pharmigen, 1:100), mysie anty-aktyna (Santa Cruz, 1:50), królicze anty-tubulina (Sigma, 1:10), kozie anty-mysie Cy3 (Chemicon, 1:10), kozie anty-królicze AlexaFluor 647 (Invitrogen, 1:10), kozie anty-szczurze AlexaFluor 48 (Invitrogen, 1:100), kozie anty-królicze AlexaFluor 48 (Invitrogen, 1:100).

Rycina 1. Przygotowanie naczyń z szklanym dnem do organotypowych skrawków. Wokół okrągłego komponentu naczynia z szklanym dnem (czerwonego) naniesiono kilka kropel kleju, pozostawiając jedną stronę otwartą w celu umożliwienia wymiany medium od spodu filtra. 150μL Kroplę pożywki do plastrów nanosi się na środek szkiełka podstawowego. Następnie nakłada się membranę Nucleopore (kolor niebieski) błyszczącą stroną dołu, dbając o to, aby pomiędzy szkiełkiem a membraną nie uwięzione zostały pęcherzyki powietrza. Na górnej powierzchni membrany rozprowadza się jeden mililitr pożywki do plastrów (kolor szary), a następnie naczynia inkubuje się w 37° C przed użyciem.

Rysunek 2. Ekstrakcja mózgu i przygotowanie do sekcjonowania. (A) Czaszkę odsłania się poprzez nacięcie skóry głowy od karku aż do pyska (linia przerywana wzdłuż linii środkowej). Następnie czaszkę przecina się wzdłużnie i przednio, zaczynając od cysterny wielkiej (cisterna magna), wykonując jedno cięcie przyśrodkowe i dwa boczne (po jednym z każdej strony; 2A). (B) W celu poprawy stabilności tkanki podczas krojenia w wibrotomie usuwa się najbardziej boczne fragmenty kory oraz tylną część OUN. (C-D) Następnie obie półkule są rozdzielane i umieszczane stroną przyśrodkową do dołu w formie do zatapiania przed nałożeniem 3% żelu agarozowego rozpuszczonego w buforze do przygotowania tkanek.

Rysunek 3. Przecinanie mózgu i transplantacja krzyżowa. (A) Tkankę gospodarza przecina się w poziomie 150μm grubość, a sekcje zawierające RMS są ostrożnie i płasko umieszczane na membranie nukleoporowej w chłodnych naczyniach z szklanym dnem. (B) Przecinanie mózgów dawców (mózgów wykazujących ekspresję reporterów fluorescencyjnych w RMS) odbywa się w przekroju 250μm grubości, a plastry zbierane są do lodowatego buforu do przygotowania tkanek. Donorskie RMS poddawane są mikrodysekcji i cięte na małe eksplantaty. Przy użyciu pipetora wyposażonego w 20 μL końcówka, poszczególne eksplanty RMS są przenoszone do naciętego miejsca w RMS gospodarza. (C) Po 1–2 godzinach inkubacji płytki przenosi się na inkubator do mikroskopu konfokalnego, a migrację rejestruje za pomocą obrazowania poklatkowego. Fotomikrografia przedstawia reprezentatywny obraz przy małym powiększeniu typowego skrawka (szary), przygotowanego 1 godzinę po transplantacji (czerwony eksplant z RMS myszy dawcy tdTomato+; czerwone linie przerywane wyznaczają RMS w skrawku biorcy).

Rysunek 4. Migracja neuroblastów z eksplantów do RMS gospodarza. (A) Neuroblasty Nestin-tdTomato+ (czerwone) migrują z eksplantatów do prądu węchowego (RMS) gospodarza (zielona przerywana linia) 1 godzinę po transplantacji. Komórki tdTomato+ naciekające RMS organotypowych skrawków organu gospodarza przemieszczają się w sposób wysoce ukierunkowany i szybki, oddalając się od strefy podkomorowej (SEZ) w kierunku opary węchowej (OB). (B) Cykl migracyjny można zaobserwować na obrazach poklatkowych o wysokiej rozdzielczości przedstawiających neuroblast w okresie około 20 minut. Pasek skali = 10 μm.

Rysunek 5. Ocena immunohistochemiczna skrawków organotypowych. Wypreparowane neuroblasty (czerwone) utrwalono w trakcie migracji 12 godzin po transplantacji. (A) Fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne skrawka ujawnia gęstą populację astrocytów GFAP+ (niebieski) oraz rozproszone naczynia krwionośne CD31+ (zielony) w obrębie RMS skrawka gospodarza. (B) Cytoszkielet wyizolowanej migrującej komórki tdTomato+ (czerwona) w gospodarczym RMS ujawniono poprzez wspólne barwienie immunologiczne z użyciem przeciwciał przeciwko aktynie (niebieska) i tubulinie (zielona).

Dyskusja

Migracja neuronów w RMS jest istotnym elementem postnatalnej neurogenezy w opolpowych cebulkach węchowych ¹. Migracja przez RMS odbywa się w płaszczyźnie stycznej do powierzchni mózgu. Neuroblasty migrujące stycznie różnią się od komórek migrujących radialnie lokalizacją źródłowych komórek progenitorowych, a także odmiennym losem końcowych produktów neuronalnych ^{1, 2, 3}. Stosunkowo czysta populacja komórek migrujących stycznie w postnatalnym RMS sprawia, że ten anatomicznie zdefiniowany obszar stano...