Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Streszczenie

Neurogeneza w mózgu postnatalnym zależy od utrzymania trzech zdarzeń biologicznych: proliferacji komórek progenitorowych, migracji neuroblastów oraz różnicowania i integracji nowych neuronów z istniejącymi obwodami neuronalnymi. W przypadku neurogenezy postnatalnej w opłatyczkach węchowych zdarzenia te są rozdzielone pomiędzy trzy anatomicznie odrębne domeny: proliferacja zachodzi głównie w strefie podependymalnej (SEZ) komór bocznych, migrujące neuroblasty przemieszczają się przez rostralny strumień migracyjny (RMS), a nowe neurony różnicują się i integrują w obrębie opłatyczków węchowych (OB). Te trzy domeny stanowią idealne platformy do badania mechanizmów komórkowych, molekularnych i fizjologicznych, które w odrębny sposób regulują każde z tych zdarzeń biologicznych. Niniejsza praca opisuje zoptymalizowany dla postnatalnej tkanki mózgowej test na organotypowych skrawkach, w którym warunki zewnątrzkomórkowe ściśle naśladują środowisko in vivo dla migrujących neuroblastów. Wykazujemy, że nasz test zapewnia jednolity, zorientowany i szybki ruch neuroblastów w obrębie RMS. Test ten będzie bardzo przydatny do badania autonomicznej i nieautonomicznej regulacji migracji neuronalnej z wykorzystaniem metod transplantacji krzyżowej u myszy o różnych podłożach genetycznych.

Protokół

I. Procedury

Poniższe techniki należy przeprowadzać w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu wysterylizowanych narzędzi.

Przygotowanie naczyń z szklanym dnem do skrawków organotypowych

1. Naczynia muszą być przygotowane w środowisku sterylnym i przy użyciu wysterylizowanych narzędzi.
2. Na środku szklanego dna naczynia umieszcza się kroplę 150μL medium do skrawków (patrz przepisy), dbając o to, aby w medium nie powstały pęcherzyki powietrza.
3. Za pomocą jednorazowej strzykawki z igłą 23 Gauge w kilku punktach na kwadratowych krawędziach sąsiadujących z okrągłym szkiełkiem podstawowym, które zajmuje centrum naczynia hodowlanego, nanosi się klej (Rubber Cement - Elmer's, kat# E904), pozostawiając jedną stronę niezaklejoną w celu wymiany płynów (Rysunek 1). Wymieniony rodzaj kleju nie jest toksyczny dla skrawków ani komórek w sposób zastosowania opisany w tym protokole. Należy uważać, aby nie nanieść kleju na szklane szkiełko podstawowe, ponieważ utrudni to i zablokuje późniejszy obrazowanie skrawków. Na szklanym szkiełku podstawowym umieszcza się membranę nukleoporową (średnica 25mm, rozmiar porów 8,0μm - Whatman, kat# 110614), wykorzystując kropki kleju do jej zamocowania. Należy to zrobić za pomocą mikropincety, upewniając się, że między szkiełkiem podstawowym a membraną nie uwięziono pęcherzyków powietrza.
4. Na membranę dodaje się 1 mL medium do skrawków. Naczynia umieszcza się w inkubatorze na 30 minut, a następnie na lodzie do momentu użycia.

Wyobcowanie mózgów wczesnych okresów postnatalnych

Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy skrawki są przygotowywane z młodych myszy postnatalnych (P1-P10).

1. Szczenięta zostają poddane anestezji terminalnej (przedawkowaniu) przy użyciu izofluranu lub innych zatwierdzonych metod. Głowę można spryskać 70% etanolem w celu zwiększenia sterylności, a następnie przeprowadzić szybką dekapitację za pomocą ostrych nożyczek.
2. Głowę stabilizuje się, zaciskając żuchwę mikro-pincetą. Skórę wycina się podłużnie od szyi do pyska. Czaszkę przecina się podłużnie i przednio, zaczynając od cysterny wielkiej, wykonując 1 cięcie przyśrodkowe i 2 cięcia boczne (po jednym z każdej strony – Rycyna 2A). Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować kontakt z podległą tkanką korową podczas usuwania płatów czaszki z dala od mózgu.
3. Aby zwiększyć stabilność tkanki podczas krojenia w wibratomie, najbardziej boczne części mózgu usuwa się, wykonując dwa cięcia strzałkowe. Usuwa się również część tylną mózgu, wykonując cięcie u rostralnej podstawy móżdżku (Rycina 2B).
4. Dwie półkule rozdziela się, wykonując gładkie cięcie wzdłuż szczeliny środkowej, a następnie ostrożnie wydobywa się je z czaszki i umieszcza powierzchnią przyśrodkową do dołu w formie do zatapiania (Ryc. 2C-D).

Przecinanie mózgu gospodarza

1. Dwie półkule w formie do zatapiania są niezwłocznie przykrywane stopionym 3% niskotopliwym żelem agarozowym klasy DNA (Fisher, kat# BP1360-100) rozpuszczonym w buforze do przygotowania tkanki utrzymywanym w temperaturze 37°C (patrz przepisy). Po 2 minutach stabilizacji na płaskiej poziomej powierzchni w celu zapewnienia równomiernego stwardnienia agarozy, formy są umieszczane na lodzie w celu całkowitego zastygnięcia.
2. Gdy żel zawierający półkule zastygnie, zostaje on wyjęty z formy i przycięty, pozostawiając 2-3mm żelu wokół tkanki mózgowej.
3. Tkanka zatopiona w żelu jest następnie montowana na dysku do preparatów w wibrotomie, powierzchnią przyśrodkową do góry, i zabezpieczana klejem cyjanoakrylowym (Krazy glue lub odpowiednik). Należy uważać, aby stosować minimalne ilości kleju, ponieważ nadmiar będzie miał toksyczny wpływ na skrawki i migrujące komórki. Nadmiar kleju na bokach bloku będzie również utrudniał cięcie, co może spowodować uszkodzenia tkanki.
4. Dysk jest instalowany w tacy do preparatów wibrotomu wypełnionej lodowatym medium do przygotowania tkanki.
5. Tkanka jest przecinana na skrawki o grubości 150μm, przy prędkości wibrotomu ustawionej w zakresie od wolnej do średniej (zależy to od używanego wibrotomu, dlatego należy to ustalić niezależnie w celu uzyskania optymalnych wyników). W naszej praktyce częstotliwość drgań jest optymalna przy maksymalnym ustawieniu. Pierwsze kilka skrawków można odrzucić.
6. Gdy tylko skrawki zawierające RMS zostaną uwolnione z ostrza (RMS jest widoczny gołym okiem jako szara struktura w kształcie litery U rozciągająca się od SEZ do OB), są one ostrożnie wyjmowane z formy żelowej i pobierane za pomocą małej płaskiej szpatułki. Skrawki są umieszczane na membranie nukleoporowej w naczyniach z dna szklanego zawierających medium do skrawków (Rycina 3A-B). Typowy mózg myszy wczesno postnatalny dostarczy około 2-3 przekrojów RMS na półkulę przy cięciu na 150 μm. Krytyczne jest ograniczenie manipulacji skrawkami do minimum, ponieważ są one bardzo kruche. Naczynia ze skrawkami są następnie przenoszone do inkubatora.

Przygotowanie przekrojów mózgu dawcy i transplantacja RMS

1. Mózgi dawców (mózgi wykazujące ekspresję fluorescencyjnych reporterów w migrujących neuroblastach) są przecinane na plastry o grubości 250μm, a następnie zbierane do lodowatego buforu do przygotowania tkanek.
2. Plastry bezzwłocznie umieszcza się pod mikroskopem stereoskopowym z funkcją epifluorescencji i delikatnie mikrodyssekuje RMS, używając mikropincet. Jedną pincetą stabilizuje się plaster, podczas gdy drugą wykonuje małe nacięcia wokół RMS, aż zostanie on uwolniony z plastra. Wycięty RMS jest następnie dzielony na małe eksplantaty (o średnicy około 200-500 μm) przed transplantacją.
3. Szalki z dna szklanego zawierające plastry biorcy umieszczone na filtrach nukleoporowych są wyjmowane z inkubatora i ustawiane pod mikroskopem stereoskopowym. Przy użyciu światła widzialnego precyzyjnie identyfikuje się RMS i wykonuje małe nacięcie w jego początkowym odcinku.
4. Za pomocą pipety wyposażonej w końcówkę 20 μL pojedynczy eksplantat RMS od dawcy jest przenoszony w miejsce nacięcia w RMS biorcy. Eksplantat jest delikatnie wpychany do nacięcia, aby nawiązać kontakt między obiema tkankami. Aby zapewnić stabilność tego kontaktu, eksplantaty są lekko dociskane pomiędzy plaster a membranę nukleoporową.
5. Po przeprowadzeniu transplantacji we wszystkich plastrach biorców zawierających RMS, szalki są zwracane do inkubatora na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić osadzenie się przekrojów na membranie. Neuroblasty powinny zacząć migrować z eksplantatu do RMS biorcy po około 1-2 godzinach.

Obrazowanie poklatkowe migracji neuronów

1. Szalki z szklanym dnem przenosi się z inkubatora do komory inkubacyjnej mikroskopu (Rysunek 3C). Obrazowanie fluorescencyjnych neuroblastów można przeprowadzać w odstępach od 0 do 10 minut, w zależności od pożądanego rodzaju analizy. Na przykład, w celu obrazowania dynamiki cytoszkieletu podczas cyklu migracyjnego poszczególnych neuroblastów, ustawiamy odstępy na mniej niż lub równo 2,5 minuty. Natomiast dynamikę populacyjną, taką jak orientacja i prędkość migracji, lepiej rejestrować w odstępach od 5 do 10 minut. Wybór obiektywów jest bardzo zróżnicowany w zależności od marki mikroskopu. W przypadku konfokalnego mikroskopu Nikon C1 stwierdzono, że najbardziej odpowiednim do naszych analiz jest obiektyw suchy 20x (Nikon Pan Fluor, N.A. 0,75, W.D. 0,35mm). Aby uzyskać najlepsze wyniki w tym systemie konfokalnym, przysłonę (pinhole) otwiera się do średniej wielkości (średnica 60μm). Aby uzyskać najbardziej odpowiednie zachowanie migracyjne, obrazowanie ogranicza się do komórek znajdujących się głęboko w grubości RMS, co najmniej 20 μm od którejkolwiek z przeciętych powierzchni skrawka. Moc lasera powinna być zoptymalizowana tak, aby była minimalna, ale szczegóły poszczególnych neuroblastów pozostawały widoczne.
2. Po zakończeniu obrazowania skrawki można utrwalić lodowatym, świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydem, poddać immunobarwieniu i zamontować na szkiełkach do dalszego obrazowania. Ponieważ nie pokrywamy membran żadnymi podłożami adhezyjnymi, takimi jak laminina, skrawki zazwyczaj odrywają się od membrany po zanurzeniu w buforach barwiących. Przekroje obrazuje się przy zachowaniu ich grubości 150 μm. Możliwe jest również kriokonserwowanie i zamrażanie skrawków, a następnie użycie kriotomu w celu uzyskania cieńszych sekcji z oryginalnych skrawków. Będzie to jednak skutkować zwiększeniem liczby artefaktów w barwieniu oraz zmianą integralności tkanki.

II. Materiały/sprzęt

Przygotowanie naczyń z szklanym dnem do skrawków organotypowych

• Małe strzykawki (1 mL)
• Igły G23
• Membrana Nucleopore Track-Etch – średnica 25mm, rozmiar porów 8.0μm – Whatman, kat# 110614
• Naczynia hodowlane z szklanym dnem – szalka Petriego 35mm, mikrowarzywo 14mm, lamella nr 1.5 – MatTech, kat# P35G-1.5-14-C
• Klej gumowy – Elmer's, kat# E904
• Podłoże podstawowe Eagle (Basal Medium Eagle) – Gibco, kat# 21010
• 1M Hepes (pH7.4)
• 1M D-glukoza
• 100mM CaCl₂
• 100mM MgSO₄
• 1M NaHCO₃
• dH₂O
• 200mM L-glutamina
• Penicylina-streptomycyna

Wyjmowanie i zatapianie mózgu

• Środek anestetyczny (izofluran itp.)
• Kuchenka mikrofalowa
• Agaroza o niskiej temperaturze topnienia - Fisher, kat# BP1360-100
• Klej typu Krazy glue - kat#KG585
• Jednorazowe formy do zatapiania typu Peel-A-Way (R-40) - prostokątne 22 mm x 40 mm, głębokość 20 mm - Polysciences, kat# 18646C

Przecinanie mózgu i transplantacja RMS

• Wibratom - Leica VT1000S oraz wszystkie komponenty pomocnicze do przygotowywania skrawków
• 10X zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) - Gibco, kat# 14185
• Pęseta do mikrosekcji #5 - Roboz, kat# RS-4976
• Mikroszpatułka - Fisher, kat# 21-401-15
• Stereomikroskop

Obrazowanie time-lapse skrawków organotypowych

• Inkubator z nawilżaczem, 5% CO₂
• Mikroskop odwrócony wyposażony w komorę inkubacyjną i obiektywy z dużą odległością roboczą (NA 0,6 lub wyższa)

III. Procedury

Roztwór buforowy do wycinania tkanek i przygotowania skrawków (bufor do przygotowania tkanek)

Roztwór stokowy	Tom	Stężenie końcowe
10X HBSS	50 ml	1X
1M Hepes (pH 7,4)	1,25 ml	2,5 mM
1M D-glukoza	15 mL	30 mM
1M CaCl22	0,5 ml	1 mM
1 M MgSO₄4	0,5 ml	1 mM
1M NaHCO33	2 mL	4 mM
dH2O	430,75 ml

Przefiltruj przez filtr 0,2 μm w celu sterylizacji i przechowuj w temperaturze 4°C.

Pożywka hodowlana do organotypowych plastrów, transplantacji tkanek i obrazowania (pożywka do plastrów)

Roztwór zapasowy	Objętość	Stężenie końcowe
Podłoże podstawowe Eagle (Basal Medium Eagle)	35 mL
Bufor do przygotowania tkanek	12.9 mL
1M D-glukoza	1.35 mL	20mM
200mM L-glutamina	0.25 mL	1mM
Penicylina-streptomycyna	0.5 mL	100units/mL penicyliny i 0.1mg/mL streptomycyny

Przefiltrować przez filtr 0.2 μm w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze 4°C.

Przygotowanie żelu z agarozy o niskiej temperaturze topnienia

Agarozę o niskiej temperaturze topnienia rozcieńcza się w buforze do przygotowania tkanek w stężeniu 0,3g/mL w 50 mL probówce stożkowej (patrz przepisy). Probówkę podgrzewa się w mikrofalówce w odstępach 5-10 sekund przy wysokiej mocy. Liczba cykli zależy od całkowitej objętości; dla 10 mL wystarczające powinny być trzy cykle (odpowiednio 10, 8 i 5 sekund). Między cyklami grzania należy ostrożnie odkręcać korek probówki, aby uwolnić ciśnienie powietrza i uniknąć rozsadzenia probówki. Należy zachować ostrożność, ponieważ zawartość probówki będzie bardzo gorąca. Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy probówkę utrzymuje się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez co najmniej 5 minut, aby temperatura ustabilizowała się przed użyciem. Długotrwałe wystawienie na temperaturę pokojową spowoduje stwardnienie żelu. Choć należy tego unikać w miarę możliwości, stwardniały żel można ponownie podgrzać i stopić do natychmiastowego użycia w ciągu 24 godzin od początkowego przygotowania.

Immunohistochemia na skrawkach organotypowych

Po obrazowaniu na mikroskopie konfokalnym skrawki można utrwalać przez noc w temperaturze 4°C przy użyciu 4% formaldehydu w PBS. Następnie sekcje poddaje się blokowaniu przez noc w temperaturze 4°C w 10% serum kozim z dodatkiem 1% Triton X (Sigma, kat. nr S26-36-23) w PBS, po czym następuje inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4°C. Do wizualizacji stosuje się znakowane fluorescencyjnie wtórne przeciwciała kozie (wszystkie rozcieńczone 1:1000, inkubacja przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej). Oznakowane skrawki należy dokładnie przemyć 5-6 razy lodowatym PBS przed zamontowaniem na szkiełkach przedmiotowych i przykryciem szkiełkiem nakrywką.

IV. Reprezentatywne wyniki

Nasz protokół hodowli organotypowych przekrojów był dokładnie testowany i optymalizowany przez ostatnie kilka lat w celu zapewnienia spójności wzorców i orientacji migracji. Analiza komórek emigrujących z eksplantów uzyskanych od myszy, w których ekspresja czerwonego białka fluorescencyjnego, Td-tomato, jest indukowana pod promotorem Nestin (Nestin-Td tomato), wykazuje silnie zorientowaną i szybką migrację neuroblastów tdTomato+ do RMS gospodarza (Rycina 4A). Analiza time-lapse przy dużym powiększeniu obrazuje doskonałą rozdzielczość całej długości migrującego neuroblasta podczas 20-minutowej sesji obrazowania (Rycina 4B).

Przekroje zawierające komórki donora Td-tomato+ utrwalono i poddano immunobarwieniu w celu wykazania różnych komponentów komórkowych w obrębie RMS. Astrocyty GFAP+ oraz naczynia krwionośne CD31+ wykazano za pomocą fluorescencyjnej immunohistochemii (Rycina 5A). Analiza przekrojów w dużym powiększeniu, barwionych na białka cytoszkieletu – aktynę i tubulinę, ujawniła nierównomierną ekspresję tych komponentów w komórce znajdującej się w trakcie migracji (Rycina 5B).

Przeciwciała użyte w tych przykładach: królicze anty-RFP (Abcam, 1:250), królicze anty-GFAP (Dako, 1:1000), szczurze anty-CD31 (BD Pharmigen, 1:100), mysie anty-aktyna (Santa Cruz, 1:500), królicze anty-tubulina (Sigma, 1:1000), kozie anty-mysie Cy3 (Chemicon, 1:1000), kozie anty-królicze AlexaFluor 647 (Invitrogen, 1:1000), kozie anty-szczurze AlexaFluor 488 (Invitrogen, 1:1000), kozie anty-królicze AlexaFluor 488 (Invitrogen, 1:1000).

Rycina 1. Przygotowanie naczyń z szklanym dnem do plastrów organotypowych. Wokół okrągłego szklanego dna naczynia (czerwony) naniesiono kilka kropel kleju, pozostawiając jedną stronę otwartą w celu wymiany medium spod filtra. Na środku szklanego nakrycia naczynia umieszczono 150μL kroplę medium do plastrów. Następnie nałożono membranę nukleoporową (niebieska) błyszczącą stroną do dołu, dbając o to, aby między szklanym nakryciem a membraną nie pozostały pęcherzyki powietrza. Na wierzchu membrany rozprowadzono jeden mililitr medium do plastrów (szary), a naczynia inkubowano w temperaturze 37°C przed użyciem.

Rycina 2. Wydobycie mózgu i przygotowanie do cięcia. (A) Czaszkę odsłania się poprzez nacięcie skóry głowy od karku do pyska (linia przerywana wzdłuż linii środkowej). Następnie czaszkę przecina się wzdłużnie i przednio, zaczynając od cysterny wielkiej, wykonując jedno cięcie przyśrodkowe i dwa boczne (po jednym z każdej strony; 2A). (B) Najbardziej boczny obszar kory oraz tylną część OUN resekuje się w celu poprawy stabilności tkanki podczas cięcia w wibrotomie. (C-D) Dwie półkule zostają następnie rozdzielone i umieszczone stroną przyśrodkową do dołu w formie do zatapiania przed aplikacją 3% żelu agarozowego rozpuszczonego w buforze do przygotowania tkanek.

Rycina 3. Sekcjonowanie mózgu i transplantacja krzyżowa. (A) Tkanka gospodarza jest sekcjonowana na plastry o grubości 150μm, a sekcje zawierające RMS są ostrożnie rozkładane płasko na membranie nukleoporowej w chłodzonych naczyniach z dna szklanego. (B) Mózgi dawców (mózgi wykazujące ekspresję reporterów fluorescencyjnych w RMS) są sekcjonowane na plastry o grubości 250μm, a następnie zbierane do lodowatego buforu do przygotowania tkanki. RMS dawcy jest mikrodissekowany i pocięty na małe eksplantaty. Przy użyciu pipetora z końcówką 20 μL poszczególne eksplantaty RMS są przenoszone do nacięcia w RMS gospodarza. (C) Po 1–2 godzinach inkubacji naczynia są przenoszone na inkubowaną platformę mikroskopu konfokalnego, a migracja jest rejestrowana za pomocą obrazowania time-lapse. Fotomikrografia przedstawia reprezentacyjny obraz o niskim powiększeniu typowego plastra (szary), przygotowanego 1 godzinę po transplantacji (czerwony eksplantat z tdTomato+ RMS myszy dawcy; czerwone linie przerywane wyznaczają obszar RMS w plastrze gospodarza).

Rysunek 4. Migracja neuroblastów z eksplantów do RMS gospodarza. (A) Neuroblasty Nestin-tdTomato+ (czerwone) migrują z eksplantów do RMS gospodarza (przerywana zielona linia) 1 godzinę po transplantacji. Komórki tdTomato+ naciekające RMS w organotypowych skrawkach gospodarza poruszają się w sposób wysoce zorientowany i szybki, oddalając się od SEZ w kierunku OB. (B) Cykl migracyjny można zaobserwować na obrazach time-lapse neuroblasta przy dużym powiększeniu w okresie około 20 minut. Pasek skali = 10 μm.

Rycina 5. Ocena immunohistochemiczna przekrojów organotypowych. Wyeksplantowane neuroblasty (czerwone) zostały utrwalone w trakcie migracji 12 godzin po transplantacji. (A) Fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne przekroju ujawnia gęstą pulę astrocytów GFAP+ (niebieskie) i rozproszone naczynia krwionośne CD31+ (zielone) w obrębie RMS w przekroju gospodarza. (B) Cytoszkielet wyizolowanej migrującej komórki tdTomato+ (czerwona) w RMS gospodarza został uwidoczniony poprzez wspólne barwienie z użyciem przeciwciał przeciwko aktynie (niebieska) i tubulinie (zielona).

Dyskusja

Migracja neuronów w RMS jest istotnym elementem postnatalnej neurogenezy w opolpowych cebulkach węchowych ¹. Migracja przez RMS odbywa się w płaszczyźnie stycznej do powierzchni mózgu. Neuroblasty migrujące stycznie różnią się od komórek migrujących radialnie lokalizacją źródłowych komórek progenitorowych, a także odmiennym losem końcowych produktów neuronalnych ^{1, 2, 3}. Stosunkowo czysta populacja komórek migrujących stycznie w postnatalnym RMS sprawia, że ten anatomicznie zdefiniowany obszar stano...