$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Owady
- Kolonia mącznika brzoskwiniowego, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera:Pyralidae), w naszym laboratorium pochodzi od ciem zebranych z drzew migdałowca w Fresno, CA. Nasza kolonia owadów jest utrzymywana w komorach klimatycznych (Percival Inc, IA) w temperaturze 28 ± 2°C, przy wilgotności względnej 75 ± 10% i w reżimie świetlnym 16:8h (światło:ciemność).
- Wylęgające się ćmy są zbierane codziennie, rozdzielane według płci i przenoszone do plastikowych pudełek (pojemniki lunchbox 669 mL, 13 x 13 cm; wysokość 4,5 cm, Rubbermaid) wyposażonych w maksymalnie 10 warstw nasączonych wodą ręczników papierowych (Thirsty Ultra Absorbent, 27,9 x 27,9 cm; Safeway). Pokrywy pudełek są perforowane, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Taki układ zapewnia ~100% RH.
- Do pomiarów elektrofizjologicznych wykorzystujemy ćmy w wieku 2-4 dni od wylęgnięcia, utrzymywane w warunkach wysokiej wilgotności.
2. Przygotowanie elektrofizjologiczne
- Ćmy (samce lub samice) są delikatnie wpychane do końcówki pipety (200 μL, USA Scientific Inc), której górna część została odcięta, aby uzyskać dużą średnicę otworu (ok. 2 mm). Ćmę delikatnie przesuwa się przez drugi koniec za pomocą wilgotnego fragmentu ręcznika papierowego, aż czułki i część głowy wystaną z końcówki.
- Odsłoniętą głowę unieruchamia się, pokrywając ją nie wysychającą glinką (Claytoon, Van Aken International, CA), pozostawiając odsłoniętą niewielką część jednego oka oraz dwa czułki. Tak przygotowany preparat umieszcza się na platformie mikromanipulatora EAG MP-12 (Syntech, Niemcy) pomiędzy dwoma uchwytami elektrod.
- Stosujemy elektrody szklane wykonane z kapilar borokrzemianowych o średnicy 1,0 mm z włóknem (WPI Inc, FL), wyciągane w wyciągaczu do mikropipet Model P-97 (Sutter Instruments, CA), aby uzyskać mikroelektrody o średnicy końcówki mniejszej niż mikrometr. Elektrody są wypełniane od tyłu roztworem Ringera dla limfy sensilli (Kaissling and Thorson 1980). Jedna elektroda, pod kontrolą mikroskopu (Leica MZ75), jest wprowadzana w odsłonięty obszar oka i służy jako elektroda odniesienia, natomiast elektroda rejestrująca obejmuje oba czułki. Aby ułatwić kontakt, przed wprowadzeniem do elektrody rejestrującej odcina się dystalnie 1-2 segmenty czułka. W celu rejestracji sygnałów z poszczególnych sensilli nieco modyfikujemy ten układ, w którym elektroda rejestrująca jest wprowadzana pod mikroskopem (Olympus BX51WI; powiększenie 800x). Potencjały czynnościowe są rejestrowane poprzez wprowadzenie szklanej elektrody u podstawy sensillum. Sygnały są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji (Syntech, Niemcy) i przekazywane do UB-IDAC w celu analizy off-line za pomocą oprogramowania AUTOSPIKE (Syntech, Niemcy). Sygnały AC są filtrowane pasmowo w zakresie 100–10 000 Hz, a potencjały czynnościowe są wyodrębniane komputerowo za pomocą algorytmu AUTOSPIKE, który odróżnia ich amplitudę szczyt-do-dołka od szumu. Odpowiedzi poszczególnych neuronów oblicza się jako wzrost (lub spadek) częstotliwości potencjałów czynnościowych (impulsy na sekundę) względem częstotliwości spontanicznej.
3. Bodźce chemiczne i protokół stymulacji
- Stosuje się odczynniki o najwyższej czystości. Główny składnik mieszaniny feromonów samic omacznicy pstrokrążkowej, (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, został pozyskany z Bedoukian Research Inc, CT. Odczynniki rozcieńcza się (w/v) w heksanie destylowanym w kolbie szklanej w celu przygotowania roztworów stokowych o stężeniu 10 μg/ μL, a następnie wykonuje się rozcieńczenia dziesięciokrotne. Alikwot (10 μL) substancji stymulującej rozpuszczonej w heksanie nanosi się na pasek papieru filtracyjnego Whatman (8x40 mm), rozpuszczalnik odparowuje poprzez delikatne wstrząsanie przez 10 s pod wyciągiem, a pasek umieszcza się w polipropylenowej strzykawce o pojemności 5 mL (BD Syringes, NJ), z której wydziela się różne objętości. Jako kontrolę stosuje się sam heksan oraz pustą strzykawkę.
- Preparat utrzymuje się w strumieniu nawilżonego powietrza dostarczanego przez kontroler bodźców Syntech (model CS-55; Syntech, Niemcy) z przepływem 20 mL/sec, do którego dodaje się impuls stymulujący o przepływie 4 mL/s przez 500 ms. Sygnały rejestruje się przez 10 s, rozpoczynając pomiar 2 s przed początkiem impulsu stymulującego. Preparat antenalny stymuluje się impulsem 500 ms, podczas którego ok. 2 mL oczyszczonego powietrza z polipropylenowej strzykawki 5 mL zawierającej bodziec jest dodawane do głównego przepływu powietrza. Po silnych odpowiedziach zachowuje się przerwę między stymulacjami wynoszącą co najmniej 1 min lub więcej.
4. Reprezentatywne wyniki
Czułki unieruchomionych ciem (Rysunek 1) stymulowane składnikiem feromonu żeńskiego, (Z,Z)-11,13-heksadekadienalem, generują wyraźne odpowiedzi zależne od dawki (Rysunek 2). Ten główny składnik feromonu wywołuje również zależne od dawki odpowiedzi pobudzeniowe w długich sensillach trichodea (Rysunek 3A), co przedstawiono na zapisach z rejestracji pojedynczych jednostek (Rysunek 3B).
Rysunek 1. Żywa ćma z gatunku navel orangeworm unieruchomiona z odsłoniętą czułkiem
Rysunek 2. Zależne od dawki odpowiedzi EAG wywołane w odpowiedzi na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, główny składnik feromonu samic.
Rysunek 3. Sensilla trichoid u samca pomnika pstroplamistości reagują na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal w sposób zależny od dawki. (A) Czułek samca pomnika pstroplamistości jest wieloczłonowy, a każdy człon ozdobiony jest dużą liczbą struktur przypominających włoski, sensilli. Mikrografia elektronowa skaningowa, szczegóły pokazane na wstawce (paski skali wynoszą odpowiednio 200 i 50 μM). (B) Zewnątrzkomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek z sensillum trichoid.