$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Owady
- Kolonia moli pędowych, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera:Pyralidae), w naszym laboratorium pochodzi od ciem zebranych z drzew migdałowca w Fresno, CA. Nasza kolonia owadów jest utrzymywana w komorach klimatycznych (Percival Inc, IA) w temperaturze 28 ± 2°C, przy wilgotności względnej 75 ± 10% oraz w reżimie oświetleniowym 16:8h (światło:ciemność).
- Wylęgające się ćmy są codziennie zbierane, segregowane według płci i przenoszone do plastikowych pudełek (lunchbox 669 mL, 13 x 13 cm; wysokość 4,5 cm, Rubbermaid) wyposażonych w maksymalnie 10 warstw nasączonych wodą ręczników papierowych (Thirsty Ultra Absorbent, 27,9 x 27,9 cm; Safeway). Pokrywy pudełek są perforowane, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Taki układ zapewnia ~100% RH.
- Do pomiarów elektrofizjologicznych wykorzystujemy ćmy w wieku 2-4 dni po wylęgnięciu, utrzymywane w warunkach wysokiej wilgotności.
2. Przygotowanie elektrofizjologiczne
- Ćmy (samce lub samice) są delikatnie wpychane do końcówki pipety (200 μL, USA Scientific Inc), której górna część została odcięta, aby uzyskać dużą średnicę otworu (ok. 2 mm). Ćmę delikatnie przepycha się przez drugi koniec za pomocą zwilżonego fragmentu papierowej chusteczki, aż czułki i część głowy wystaną z końcówki.
- Odsłoniętą głowę unieruchamia się, pokrywając ją nie wysychającą glinką (Claytoon, Van Aken International, CA), pozostawiając odsłonięty niewielki fragment jednego oka oraz dwa czułki. Tak przygotowany preparat umieszcza się na platformie mikromanipulatora EAG MP-12 (Syntech, Niemcy) pomiędzy dwoma uchwytami elektrod.
- Używamy szklanych elektrod wykonanych z kapilar borokrzemianowych o średnicy 1,0 mm z włóknem (WPI Inc, FL), wyciąganych w wyciągaczu do mikropipet Model P-97 (Sutter Instruments, CA), aby uzyskać mikroelektrody o końcówce o średnicy mniejszej niż mikrometr. Elektrody wypełnia się od tyłu roztworem Ringera do limfy sensylli (Kaissling and Thorson 1980). Jedna elektroda jest wprowadzana w odsłonięty obszar oka pod mikroskopem (Leica MZ75) i służy jako elektroda referencyjna, natomiast elektroda rejestrująca obejmuje oba czułki. Aby ułatwić kontakt, przed wprowadzeniem do elektrody rejestrującej odcina się dystalne 1-2 segmenty czułka. W celu rejestracji sygnałów z pojedynczych sensylli nieco modyfikujemy ten układ, w którym elektrodę rejestrującą wprowadza się pod mikroskopem (Olympus BX51WI; powiększenie 800x). Potencjały czynnościowe rejestruje się poprzez wprowadzenie szklanej elektrody u podstawy sensyllum. Sygnały są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji (Syntech, Niemcy) i przekazywane do UB-IDAC w celu analizy offline za pomocą oprogramowania AUTOSPIKE (Syntech, Niemcy). Sygnały AC są filtrowane pasmowo w zakresie 100 -10,000 Hz, a potencjały czynnościowe są wyodrębniane komputerowo przy użyciu algorytmu AUTOSPIKE, który odróżnia ich amplitudy szczyt-do-dołka od szumu. Odpowiedzi pojedynczych neuronów oblicza się jako wzrost (lub spadek) częstotliwości potencjałów czynnościowych (impulsy na sekundę) względem częstotliwości spontanicznej.
3. Bodźce chemiczne i protokół stymulacji
- Stosuje się odczynniki o najwyższej czystości. Główny składnik mieszaniny feromonów samic omacnicy pąszowej, (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, został pozyskany z Bedoukian Research Inc, CT. Odczynniki rozcieńcza się (w/v) heksanem destylowanym w szkle w celu przygotowania roztworów zapasowych o stężeniu 10 μg/ μL, a następnie wykonuje się rozcieńczenia dziesięciokrotne. Alikwot (10 μL) substancji stymulującej rozpuszczonej w heksanie nanosi się na pasek papieru filtracyjnego Whatman (8x40 mm), rozpuszczalnik odparowuje poprzez delikatne potrząsanie przez 10 s pod wyciągiem, a pasek umieszcza się w polipropylenowej strzykawce o pojemności 5 mL (BD Syringes, NJ), z której wypuszcza się różne objętości. Jako kontrolę stosuje się sam heksan oraz pustą strzykawkę.
- Preparat utrzymuje się w nawilżonym strumieniu powietrza dostarczanym przez kontroler bodźców Syntech (model CS-55; Syntech, Niemcy) z przepływem 20 mL/sec, do którego dodaje się impuls stymulujący o objętości 4 mL/s przez 500 ms. Sygnały rejestruje się przez 10 s, rozpoczynając pomiar 2 s przed rozpoczęciem impulsu stymulującego. Preparat antenalny stymuluje się impulsem 500 ms, podczas którego do głównego przepływu powietrza dodawane jest ok. 2 mL oczyszczonego powietrza z polipropylenowej strzykawki 5 mL zawierającej substancję stymulującą. Po wystąpieniu silnych odpowiedzi zachowuje się przerwę między stymulacjami wynoszącą co najmniej 1 min lub więcej.
4. Reprezentatywne wyniki
Czułki unieruchomionych ciem (Rycina 1) stymulowane składnikiem feromonu żeńskiego, (Z,Z)-11,13-heksadekadienalem, generują silne odpowiedzi zależne od dawki (Rycina 2). Ten główny składnik feromonu wywołuje również zależne od dawki odpowiedzi pobudzeniowe w długich sensylach trichodea (Rycina 3A), co przedstawiono na zapisach z rejestracji pojedynczych jednostek (Rycina 3B).
Rysunek 1. Unieruchomiona żywa ćma z gatunku navel orangeworm z odsłoniętą anteną
Rysunek 2. Zależne od dawki odpowiedzi EAG wywołane w reakcji na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, główny składnik feromonu samic.
Rysunek 3. Sensilla trichoid u samca ciemnicy pępkowej reagują na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal w sposób zależny od dawki. (A) Czułek samca ciemnicy pępkowej jest wieloczłonowy, a każdy człon pokryty jest licznymi strukturami przypominającymi włoski, czyli sensillami. Mikrografia z elektronowego mikroskopu skaningowego, ze szczegółami na wstawce (paski skali wynoszą odpowiednio 200 i 50 μM). (B) Pozakomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek z sensilli trichoid.