Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Układy węchowe owadów stwarzają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi wywołanych przez substancje zapachowe w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensilli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na czułku oraz neuronów znajdujących się w poszczególnych sensillach. Podejścia te zostały wykorzystane w celu lepszego zrozumienia komunikacji chemicznej owadów. Zidentyfikowane bodźce mogą następnie służyć jako atraktanty lub repelenty w strategiach zwalczania owadów szkodników.
Protokół
1. Owady
- Kolonia omacnicy migdałowej, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera:Pyralidae) w naszym laboratorium wywodzi się z ciem zebranych z drzew migdałowych w Fresno, CA. Nasza kolonia owadów jest utrzymywana w komorach klimatycznych (Percival Inc, IA) w temperaturze 28 ± 2°C, przy wilgotności względnej 75 ± 10% i w reżimie świetlnym 16:8h (światło:ciemność).
- Wylęgające się ćmy są codziennie zbierane, segregowane według płci i przenoszone do plastikowych pudełek (pojemnik na lunch 669 mL, 13 x 13 cm; wysokość 4,5 cm, Rubbermaid) z maksymalnie 10 warstwami nasączonych wodą ręczników papierowych (Thirsty Ultra Absorbent, 27,9 x 27,9 cm; Safeway). Pokrywy pudełek są perforowane, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Taka aranżacja zapewnia ~100% RH.
- Do pomiarów elektrofizjologicznych wykorzystujemy ćmy w wieku 2-4 dni od wylęgu, utrzymywane w warunkach wysokiej wilgotności.
2. Przygotowanie elektrofizjologiczne
- Ćmy (samce lub samice) są delikatnie wpychane do końcówki pipety (200 μL, USA Scientific Inc), której góra została odcięta, aby uzyskać dużą średnicę otworu (ok. 2 mm). Ćmę delikatnie przepycha się z drugiej strony za pomocą zwilżonego fragmentu chusteczki higienicznej, aż czułki i część głowy wystaną poza końcówkę.
- Odsłoniętą głowę unieruchamia się, pokrywając ją nie wysychającą glinką (Claytoon, Van Aken International, CA), pozostawiając odsłoniętą niewielką część jednego oka oraz dwa czułki. Tak przygotowany preparat umieszcza się na platformie mikromanipulatora EAG MP-12 (Syntech, Niemcy) pomiędzy dwoma uchwytami elektrod.
- Stosujemy elektrody szklane wykonane z kapilar borokrzemianowych o średnicy 1,0 mm z włóknem (WPI Inc, FL), wyciągane w wyciągaczu do mikropipet Model P-97 (Sutter Instruments, CA), aby uzyskać mikroelektrody o końcówce o średnicy mniejszej niż mikrometr. Elektrody są wypełniane od tyłu roztworem ringera dla limfy sensyli (Kaissling and Thorson 1980). Jedna elektroda zostaje wbita w odsłoniętą część oka pod mikroskopem (Leica MZ75) i służy jako elektroda referencyjna, natomiast elektroda rejestrująca obejmuje dwa czułki. Aby ułatwić kontakt, przed wsunięciem do elektrody rejestrującej odcina się 1-2 dystalne segmenty czułków. W przypadku rejestracji sygnałów z poszczególnych sensyli, nieco modyfikujemy tę konfigurację, w której elektroda rejestrująca jest wbijana pod mikroskopem (Olympus BX51WI; powiększenie 800x). Potencjały czynnościowe rejestruje się poprzez wprowadzenie szklanej elektrody do podstawy sensilla. Sygnały są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji (Syntech, Niemcy) i przekazywane do UB-IDAC w celu analizy off-line za pomocą oprogramowania AUTOSPIKE (Syntech, Niemcy). Sygnały AC są filtrowane pasmowo w zakresie 100-10 000 Hz, a potencjały czynnościowe są wyodrębniane komputerowo za pomocą algorytmu AUTOSPIKE, który odróżnia ich amplitudy szczyt-do-dołka od szumu. Odpowiedzi poszczególnych neuronów oblicza się jako wzrost (lub spadek) częstotliwości potencjałów czynnościowych (impulsy na sekundę) w stosunku do częstotliwości spontanicznej.
3. Bodźce chemiczne i protokół stymulacji
- Stosuje się odczynniki najwyższej czystości. Główny składnik mieszaniny feromonowej samic omacnicy jesionowej, (Z,Z)-11,13-hexadecadienal, został pozyskany z Bedoukian Research Inc, CT. Odczynniki rozcieńcza się (w/v) w heksanie destylowanym w szkle w celu przygotowania roztworów zapasowych o stężeniu 10 μg/ μL, a następnie wykonuje się rozcieńczenia dziesięciokrotne. Alikwot (10 μL) substancji stymulującej rozpuszczonej w heksanie nanosi się na pasek papieru filtracyjnego Whatman (8x40 mm); rozpuszczalnik odparowuje poprzez delikatne potrząsanie przez 10 s pod wyciągiem, a pasek umieszcza się w strzykawce polipropylenowej o pojemności 5 mL (BD Syringes, NJ), z której wypycha się różne objętości. Jako kontrolę stosuje się sam heksan oraz pustą strzykawkę.
- Preparat utrzymuje się w strumieniu nawilżonego powietrza dostarczanego przez kontroler bodźców Syntech (model CS-55; Syntech, Niemcy) z przepływem 20 mL/sec, do którego dodaje się impuls stymulujący o objętości 4 mL/s przez 500 ms. Sygnały rejestruje się przez 10 s, rozpoczynając pomiar 2 s przed wystąpieniem impulsu stymulującego. Preparat antenowy stymuluje się impulsem o czasie trwania 500 ms, podczas którego do głównego przepływu powietrza dodaje się ok. 2 mL oczyszczonego powietrza z polipropylenowej strzykawki 5 mL zawierającej bodziec. Po silnych odpowiedziach zachowuje się przerwę między stymulacjami wynoszącą co najmniej 1 min lub więcej.
4. Reprezentatywne wyniki
Czułki unieruchomionych ciem (Rysunek 1) stymulowane składnikiem feromonu żeńskiego, (Z,Z)-11,13-heksadekadienalem, generują silne odpowiedzi zależne od dawki (Rysunek 2). Ten główny składnik feromonu wywołuje również zależne od dawki odpowiedzi pobudzeniowe w długich sensyllach trichodea (Rysunek 3A), co ukazano na zapisach z rejestracji pojedynczych jednostek (Rysunek 3B).
Rysunek 1. Żywa ćma z gatunku navel orangeworm unieruchomiona z wyeksponowaną czułką
Rycina 2. Zależne od dawki odpowiedzi EAG wywołane w reakcji na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, główny składnik feromonu samic.
Rycina 3. Sensilla trichoid u samca ćmy z rodzaju navel orangeworm reagują na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal w sposób zależny od dawki. (A) Czułek samca ćmy z rodzaju navel orangeworm jest wieloczłonowy, a każdy człon ozdobiony jest dużą liczbą struktur przypominających włosy – sensilla. Mikrograf elektronowy skaningowy z powiększeniem szczegółów na wstawce (Paski skali wynoszą odpowiednio 200 i 50 μM). (B) Zewnątrzkomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek z sensillum trichoid.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta nowatorska metoda opracowana w celu unieruchomienia żywej ćmy z gatunku navel orangeworm w celu pomiaru sygnałów węchowych okazała się wytrzymała i bardzo niezawodna. Rutynowo stosujemy tę metodę do izolacji i identyfikacji nowych atraktantów z naturalnych podłoży gospodarzy, takich jak migdały i pistacje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wspierane przez USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177 oraz Bedoukian Research Incorporation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop | Olympus Corporation | model BX51WI | |
| Stereomikroskop | Leica Microsystems | MZ75 | |
| Kapilary borokrzemianowe 1,0 mm z włóknem | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Wytciągacz mikropipet | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Kontroler bodźców | Syntech | model CS-55 | |
| Przedwzmacniacze wysokiej impedancji (uniwersalna sonda jednostronna) | Syntech | ||
| Wzmacniacz / system akwizycji danych (USB-IDAC) | Syntech | ||
| Mikromanipulator EAG MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-heksadekadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Papier filtracyjny Whatman | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| Strzykawka polipropylenowa 5 mL | BD Biosciences | 309633 | |
| Koniec do pipety (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| Pojemnik lunchbox 669 mL, 13 x 13 cm; wysokość 4,5 cm | Rubbermaid | ||
| Ręcznik wysokochłonne Thirsty Ultra Absorbent, 27,9 x 27,9 cm | Safeway | ||
| Glina nietwardniejąca | Claytoon, Van Aken International, CA | 18150 | |
| Komora klimatyczna | model I-30BLL |
Bibliografia
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
