Techniki elektroprzędzenia pozwalają na tworzenie różnorodnych rusztowań nanowłóknistych do inżynierii tkankowej lub innych zastosowań. Opisujemy tutaj procedurę optymalizacji parametrów roztworu i aparatury do elektroprzędzenia w celu uzyskania włókien o pożądanej morfologii i orientacji. Przedstawiono również typowe problemy oraz techniki rozwiązywania problemów.
Artykuł metodologiczny
Podstawy elektroprzędzenia: optymalizacja parametrów roztworu i aparatury
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że rusztowania z nanowłókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia przyspieszają dojrzewanie, poprawiają wzrost i kierują migrację komórek in vitro. Elektroprzędzenie jest procesem, w którym naładowany strumień polimeru jest zbierany na uziemionym kolektorze; szybko rotujący kolektor prowadzi do powstania uporządkowanych nanowłókien, natomiast kolektory stacjonarne skutkują powstaniem mat z włóknami o losowej orientacji. Strumień polimeru tworzy się, gdy przyłożony ładunek elektrostatyczny pokonuje napięcie powierzchniowe roztworu. Dla danego polimeru istnieje minimalne stężenie, zwane krytycznym stężeniem zaplątania, poniżej którego nie można uzyskać stabilnego strumienia i nie powstają nanowłókna – choć możliwe jest uzyskanie nanocząstek (elekrospray). Stabilny strumień składa się z dwóch obszarów: segmentu laminarnego (streaming segment) i segmentu biczującego (whipping segment). Podczas gdy biczujący strumień jest zazwyczaj niewidoczny gołym okiem, segment laminarny jest często widoczny w odpowiednich warunkach oświetleniowych. Obserwacja długości, grubości, spójności i ruchu strumienia jest przydatna do przewidywania orientacji i morfologii tworzonych nanowłókien. Krótki, nierównomierny, niespójny i/lub oscylujący strumień wskazuje na szereg problemów, w tym na słabe uporządkowanie włókien, tworzenie się kropel (beading), rozpryskiwanie oraz powstawanie wzorów spiralnych lub falistych. Strumień można zoptymalizować poprzez dostosowanie składu roztworu oraz konfiguracji aparatury do elektroprzędzenia, optymalizując w ten sposób orientację i morfologię otrzymywanych włókien. W niniejszym protokole przedstawiamy procedurę konfiguracji podstawowej aparatury do elektroprzędzenia, empirycznego wyznaczania przybliżonego krytycznego stężenia zaplątania roztworu polimeru oraz optymalizacji procesu elektroprzędzenia. Dodatkowo omawiamy niektóre typowe problemy i techniki rozwiązywania usterek.
Protokół
1. Wybór polimeru
- Wybierz polimer (np. poli(L-mleczan) (PLLA), polikaprolakton (PCL), polistyren (PS) lub nylon) zgodnie z wymaganiami (np. biodegradowalny, termoplastyczny lub sieciowalny) oraz odpowiedni rozpuszczalnik dla tego polimeru. Dobierz odpowiednie środki ochrony osobistej w zależności od dokonanego wyboru.
- Wybierz podłoże w zależności od zastosowania (np. szkło, tworzywo sztuczne, metal lub wafle krzemowe).
2. Wybór kolektora
- Wybierz geometrię kolektora zgodnie ze swoimi specyfikacjami. Włókna przypadkowe można zbierać na płytkach stacjonarnych. Włókna uporządkowane można zbierać na szybko obracających się kołach, bębnach lub prętach, a także na płytkach równoległych.
- Kolektor musi być przewodzący i musi pozostać odizolowany od swojej osi w taki sposób, aby można go było uziemić bez jednoczesnego uziemiania sąsiednich przedmiotów, blatu stołu itp.
3. Empiryczne przybliżenie krytycznego stężenia splątania1
- Przygotować kilka wariantów stężeń polimeru (np. 4, 10, 15, 20, 30 wt%) i wybrać stężenie, które wykazuje właściwości płynne (roztwór powinien być lepką cieczą, a nie żelem), aby rozpocząć pracę.
- Przygotować aparat do elektroprzędzenia2,3,4,5 (patrz Rysunek 1)
- Załadować pompę strzykawkową i ustawić prędkość pompowania w taki sposób, aby każda kropla roztworu usunięta z końcówki była natychmiast zastępowana.
- Uziomić kolektor i przymocować przewód wysokiego napięcia do płyty przewodzącej (małego kwadratu materiału przewodzącego, np. folii aluminiowej, przez którą wystaje końcówka strzykawki).
- Uruchomić obrót koła.
- Przed włączeniem zasilacza upewnić się, że jest on ustawiony na zero.
- Obserwować strumień
- Powoli zwiększać napięcie i obserwować kroplę roztworu na końcówce igły.
- Dostosować napięcie tak, aby uzyskać długi i stabilny strumień. Jeśli nie udaje się uzyskać stabilnego strumienia, należy skorygować stężenie roztworu polimeru. Przykład podano w Tabeli 1.
4. Rozwiązywanie problemów – strumień:
- Problemy z widocznością strumienia
- Należy użyć ciemnego matowego tła i umieścić jednokierunkowe źródło światła (np. latarkę) pomiędzy obserwatorem a strumieniem (patrz Rysunek 2).
- Kapanie z końcówki strzykawki
- Jeśli roztwór polimeru kapie pionowo w dół, bez przyciągania do koła, należy upewnić się, że płyta przewodząca styka się z końcówką igły, a kolektor jest uziemiony.
- Jeśli kropla roztworu polimeru na końcówce strzykawki przechyla się w stronę koła, ale nie tworzy strumienia, należy zwiększyć napięcie. Jakość strumienia można regulować, zmieniając odległość i napięcie, aż do momentu uzyskania stabilnego strumienia. Sugerowane odległości wraz z odpowiadającymi im napięciami dla 4% roztworu PLLA i płyty przewodzącej o wymiarach 8x8 cm przedstawiono na Rysunku 3.
- Tworzenie się dużych grudek na końcówce strzykawki
- Gdy roztwór polimeru zaczyna gromadzić się i twardnieć na końcówce igły, należy usunąć grudkę za pomocą ręcznika papierowego przymocowanego do nieprzewodzącego patyczka.
- Oscylujące lub „wachlujące” strumienie
Gdy strumień gwałtownie waha się w górę i w dół, należy zmniejszyć napięcie lub zwiększyć odległość między końcówką strzykawki a kołem. Jeśli strumień nadal waha się, należy zastosować wyższe stężenie polimeru lub dodać niewielką ilość rozpuszczalnika o wolniejszym parowaniu. - Krótkie lub przerywane strumienie
Najwyższą jednorodność i wyrównanie uzyskuje się przy widocznych, stabilnych strumieniach, które stykają się z kołem obracającym się z wysoką prędkością obrotową. W przypadku strumieni krótkich i przerywanych, zwiększenie stężenia roztworu polimeru, dodanie większej ilości wolno parującego rozpuszczalnika oraz regulacja napięcia pozwolą poprawić długość i stabilność strumienia.
5. Rozwiązywanie problemów – morfologia włókien6,7,8 (patrz Rycina 4)
- Tworzenie się kulek (beading)
W przypadku pojawienia się kulek w włóknach należy zwiększyć stężenie roztworu polimeru oraz upewnić się, że płyta przewodząca utrzymuje stały kontakt z igłą, a uziemiona szczotka druciana ma stały kontakt z kołem. - Wstęgi i zlewające się włókna
Gdy włókna tworzą wstęgi lub zlewają się ze sobą, należy zastosować wyższe stężenie polimeru lub rozpuszczalnik o wyższej szybkości odparowania (bardziej lotny). - Włókna zwinięte w spirale lub faliste
Gdy włókna tworzą fale lub spirale, należy zwiększyć prędkość koła lub oddalić końcówkę igły od kolektora. Należy również sprawdzić, czy płyta przewodząca i kolektor nie wibrują. - Porowatość9
Jeśli pożądane są pory, należy zastosować szybko odparowujący rozpuszczalnik. Jeśli pory nie są pożądane, należy spróbować dodać niewielką ilość współrozpuszczalnika, który jest mniej lotny niż główny rozpuszczalnik. - Orientacja10
Gdy kolektor obraca się z niską prędkością (RPM) lub pozostaje w spoczynku, jakość orientacji włókien jest słaba. Można poprawić orientację poprzez zwiększenie prędkości obrotowej koła.
6. Reprezentatywne wyniki:
Przejdź do Rysunku 4, aby zobaczyć obrazy typowych wyników dla włókien.
Rysunek 1. Typowa konfiguracja do elektroprzędzenia. Roztwór polimeru (niebieski) jest dozowany z pompy strzykawkowej (pomarańczowa). Zasilacz wysokiego napięcia DC (zielony) uziemia szybko obracający się kolektor kołowy (szary), na którym zbierane są uporządkowane nanowłókna. Strumień polimeru między strzykawką a kolektorem składa się ze stabilnego segmentu przepływu oraz szybko oscylującego segmentu biczującego.
Rycina 2. Strumień stabilny jest widoczny przy wypływie z końcówki strzykawki; strumień niestabilny jest zbyt mały, aby był widoczny.
Wyznaczanie przybliżonego krytycznego stężenia splątania PLLA
| PLLA (% masy/objętości) | Obserwacja | Korekta stężenia |
| 0.5 | Kapanie; brak strumienia | Zwiększenie |
| 2.0 | Wyrzucanie małych kropel; brak strumienia | Niewielko zwiększyć |
| 4.0 | Stały strumień | Dobrze |
| 6.0 | Wyrzucanie dużych kropel lub grudek | Niewielko zmniejszyć |
| 12.0 | Agregacja na końcówce; brak strumienia | Zmniejszenie |
Tabela 1. Przykład przedstawiający wyznaczanie przybliżonego krytycznego stężenia splątania PLLA. Testowane są różne stężenia polimeru, a powstające strugi obserwuje się do momentu uzyskania stabilnego strumienia.
Rycina 3. Odległość między końcówką strzykawki a kolektorem musi być zrównoważona z przyłożonym napięciem, aby uzyskać stabilny strumień włókien. Nadmierne napięcie powoduje powstanie oscylującego lub „chybotliwego” strumienia, co skutkuje gorszym uporządkowaniem włókien. Gdy napięcie jest zbyt niskie, strumień nie powstanie, a roztwór będzie jedynie ściekać z końcówki strzykawki. Fioletowy obszar powyżej przedstawia zakres napięcia, w którym dla PLLA można uzyskać stabilny strumień, w zależności odległości strzykawki od kolektora.
Rycina 4. Włókna otrzymywane metodą elektroprzędzenia mogą wykazywać różnorodne morfologie, w tym obecność kropel (A), wstążek (B), zawijasów (C), porowatych grudek (D), dobrego uporządkowania (E) oraz słabego uporządkowania (F).
Dyskusja
Uwaga: Większość przedstawionych tutaj przykładów dotyczy elektroprzędzenia nanowłókien z kwasu poli-L-mlekowego (PLLA). Wynika to po prostu z faktu, że PLLA jest polimerem najczęściej przędzionym w naszym laboratorium. Pomyślnie stosowaliśmy jednak opisane metody do elektroprzędzenia innych polimerów (np. PLGA, PCL, PS) i uważamy, że zaprezentowane tutaj techniki można z łatwością zastosować do większości roztworów polimerów o średniej i wysokiej masie cząsteczkowej.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez NIH K08 EB003996 oraz grant 2573 z Paralyzed Veterans of America Research Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zasilacz DC wysokiego napięcia | Gamma High Voltage | ES40P-5W | |
| Pompa strzykawkowa | KD Scientific | KDS100 | |
| Folia aluminiowa | Reynolds Wrap | ||
| Tępe końcówki metalowe, 23ga | Fisher Scientific | 13-850-102 | |
| Strzykawka polipropylenowa | BD Biosciences | 309585 | |
| Kolektor obrotowy lub stacjonarny | Wykonanie własne | ||
| Różne żabki i przewody | |||
| Dimetyloformamid | Fisher Scientific | AC11622-0010 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC42355-0040 | |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| Taśma węglowa | Ted Pella, Inc. | 13073-1 |
Bibliografia
- Shenoy, S. L., Bates, W. D., Frisch, H. L., Wnek, G. E. Role of chain entanglements on fiber formation during electrospinning of polymer solutions: good solvent, non-specific polymer-polymer interaction limit. Polymer. 46, 3372-3384 (2005).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Yang, F., Murugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Li, W., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res. A. 60, 613-621 (2002).
- Kim, C. H., Jung, Y. H., Kim, H. Y., Lee, D. R. Effect of collector temperature on the porous structure of electrospun fibers. Macromol. Res. 14, 59-65 (2006).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
Przedruki i uprawnienia
