Artykuł metodologiczny

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

40.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2496

⸱

18 marca 2011

 , 
1Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 2Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Streszczenie

Długość życia jest procesem biologicznym regulowanym przez kilka szlaków genetycznych. Jedną ze strategii badania biologii starzenia się jest analiza zwierząt posiadających mutacje w komponentach szlaków regulujących wiek. Jeśli mutacje te zaburzają funkcję szlaku regulującego wiek, a w konsekwencji zmieniają długość życia całego organizmu, dostarczają one istotnych informacji o mechanizmach tych procesów1-3.

Inną strategią badania regulacji długości życia jest wykorzystanie małych cząsteczek do zaburzania szlaków regulujących starzenie. Do tej pory zidentyfikowano szereg cząsteczek, które wydłużają życie w różnych organizmach modelowych i są wykorzystywane jako narzędzia do badania biologii starzenia4-16. Liczba dotychczas zidentyfikowanych cząsteczek jest niewielka w porównaniu z genetycznym „zestawem narzędzi” dostępnym do badania biologii starzenia.

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych modeli wykorzystywanych do badania starzenia się ze względu na doskonałe właściwości genetyczne oraz krótki, trwający trzy tygodnie cykl życia. W ostatnim czasie C. elegans stał się organizmem modelowym w badaniach przesiewowych leków opartych na fenotypie5,7,16-20 dzięki niewielkim rozmiarom oraz możliwości hodowli na płytkach mikrotitracyjnych.

Przedstawiamy tutaj metodę pomiaru długości życia C.elegans na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Metoda ta została opracowana i z sukcesem zastosowana do przesiewania dużych bibliotek w celu znalezienia cząsteczek wydłużających życie C.elegans7. Niezawodność testu oceniono w kilku próbach: po pierwsze, mierząc długość życia zwierząt typu dzikiego hodowanych w różnych temperaturach; po drugie, mierząc długość życia mutantów o zmienionej długości życia; po trzecie, mierząc zmiany w długości życia w odpowiedzi na różne stężenia leku przeciwdepresyjnego mirtazapiny. Wcześniej wykazano, że mirtazapina wydłuża życie C.elegans7. Wyniki tych testów pokazują, że metoda ta pozwala na replikację wcześniejszych odkryć z innych analiz i ma charakter ilościowy. Format mikrotitracyjny sprawia również, że ten test długości życia jest kompatybilny z zautomatyzowanymi systemami do dozowania cieczy i umożliwia integrację z platformami automatycznymi.

Protokół

Przegląd: Protokół jest podzielony na cztery części. Część 1 opisuje sposób przygotowania bakterii paszowych. Część 2 opisuje sposób przygotowania hodowli nicieni. Część 3 opisuje sposób oceny długości życia. Część 4 przedstawia reprezentatywne wyniki, a część 5 opisuje sposób przygotowania wymaganych roztworów. Eksperymenty dotyczące długości życia trwają kilka tygodni. Dla każdego kroku protokołu podano tydzień, dzień i porę dnia, aby ułatwić planowanie. Stadium L4 (Dzień 0) służy jako punkt odniesienia dla całego protokołu.

1. Przygotowanie bakterii karmowych

W tej sekcji opisano przygotowanie bakterii stanowiących pożywkę. Specyficzny szczep E. coli wykorzystywany do karmienia C.elegans nazywa się OP50. Przed przystąpieniem do niniejszego protokołu, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej hodowli nicieni innymi bakteriami, szczep OP50 został uczyniony opornym na karbenycylinę i ampicylinę21. Szczep OP50 należy przygotować od czterech do pięciu dni wcześniej. Wszystkie materiały mające kontakt z OP50 muszą być sterylne.

Dzień -7: Czwartek (tydzień 1): Zaszczepić 5 mL TB zawierającego 100 μg/mL ampicyliny i 0,1 μg/mL amfoterycyny B pojedynczą kolonią OP50 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem.

Dzień -6: piątek (tydzień 1).

Godzina 8:30 rano. Zaszczep kulturę wcześnie, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie przez nią stanu saturacji

  1. Rozcieńczyć kulturę nocną OP50 w stosunku 1:2000 w 300 mL pożywki TB zawierającej 50 μg/mL ampicyliny. Inkubować kulturę w wytrząsarce bakteryjnej przez 8-12 godzin w temperaturze 37°C aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Nie dopuszczać do wzrostu kultury powyżej 14 godzin.
  2. Przenieść OP50 do sterylnej, uprzednio zważonej probówki do wirowania. Odwirować OP50 przez 10 min przy 3500 rpm (2200 x g) w wirówce stołowej w celu uzyskania osadu.
  3. Odlać nadsącz i resuspender osad OP50 w sterylnej wodzie, a następnie ponownie odwirować. Powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie.
  4. Po drugim płukaniu ostrożnie usunąć całą pozostałą wodę. W probówce nie powinna pozostać żadna woda. Zważyć probówkę do wirowania z osadem i odjąć masę pustej probówki, aby wyznaczyć masę osadu.
  5. Dokładnie resuspender osad w pożywce S-complete do uzyskania stężenia 100 mg/mL. Nie powinny pozostać żadne grudki.
  6. Stężenie 100 mg/mL OP50 powinno odpowiadać 2 x1010 bakterii/mL. Użyć spektrofotometru do wyznaczenia liczby bakterii na mL, jeżeli znana jest zależność między gęstością optyczną a liczbą bakterii na mL. W razie potrzeby dostosować stężenie roztworu karmowego OP50 do poziomu 2 x1010 bakterii/mL.
  7. Przechowywać roztwór OP50 w temperaturze 4°C aż do momentu wykorzystania go do hodowli nicieni.

2. Przygotowanie zsynchronizowanej hodowli nicieni

W tej sekcji opisano przygotowanie hodowli nicieni. Jej celem jest uzyskanie populacji nicieni o zsynchronizowanym wieku. Wszystkie materiały mające kontakt z C.elegans po zabiegu wybielaniem w kroku 5 muszą być sterylne. Płytki przechowuje się w temperaturze 20°C, chyba że wskazano inaczej.

Dzień -6: Piątek (tydzień 1), godz. 16:00: Przenieść zwierzęta na nową płytkę

  1. Pobierz 5-10 dniową płytkę NGM, na której większość populacji nicieni stanowią zagłodzone larwy L1.
  2. Zesterylizuj metalną szpatułkę, krótko podgrzewając ją nad palnikiem Bunsena. Pozostaw do ostygnięcia. Za pomocą schłodzonej szpatułki wytnij kawałki agaru z płytki zawierającej zagłodzone nicienie. Przenieś kilka takich kawałków na nową płytkę NGM o średnicy 10 cm zaszczepioną szczepem OP50. Inkubuj przez około 65 godzin w temperaturze 20 °C, aż większość populacji nicieni będą stanowiły zapłodnione dorosłe osobniki. Czas potrzebny na wzrost zagłodzonych zwierząt L1 do stadium zapłodnionych osobników dorosłych może różnić się w zależności od szczepu.

Dzień -3: Poniedziałek (tydzień 2) godz. 10:00: Utworzenie synchronicznej populacji

  1. Zebrać nicienie z płytki 10 cm, spłukując je z powierzchni 5-10 mL sterylnej wody. Przenieść zawiesinę nicieni w wodzie do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.
  2. Przemyć nicienie, wirując przez 2 min w wirówce stołowej przy 1200 rpm (280 x g). Odlać nadsącz i dodać 10 mL wody. Powtórzyć czynność.
  3. Usunąć nadsącz i dodać 5 mL świeżo przygotowanego roztworu wybielacza/NaOH (2,5 mL domowego wybielacza, 1 mL 10N NaOH, 6,5 mL H2O). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) do momentu rozpadu organizmów. Pamiętać o delikatnym mieszaniu w wortexie w każdej minucie. Monitorować przebieg reakcji pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Gdy tylko wszystkie dorosłe osobniki ulegną rozpuszczeniu, dodać 5 mL buforu M9 w celu zneutralizowania reakcji.
  5. Przemyć jaja trzy razy 10 mL buforu M9, wirując przez 2 min przy 2500 rpm (1100 x g).
  6. Przemyć jaja raz 10 mL pożywki S-complete, wirując przez 2 min przy 2500 rpm (1100 x g).
  7. Usunąć nadsącz, dodać 10 mL pożywki S-complete i przenieść roztwór do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Dodać 30 mL pożywki S-complete do uzyskania końcowej objętości 40 mL. Delikatnie wstrząsać probówką przez noc w temperaturze pokojowej na nutatorze lub podobnym urządzeniu.

Dzień -2: wtorek (tydzień 2), godz. 12:00: Wysiew zwierząt do płytek

  1. Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź, czy nicienie wykluły się w ciągu nocy. Wyznacz stężenie nicieni w roztworze S-complete, licząc liczbę osobników w kroplach o objętości 10 μL przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Policz co najmniej 10 kropli dla każdej próbki.
  2. Resuspenduj nicienie w roztworze S-complete do stężenia 80-100 worms/ mL. Dodaj karbenicylinę (stok 100 mg/ mL) do stężenia końcowego 50 μg/ mL oraz amfoterycynę B (stok 250 μg/ mL) do stężenia końcowego 0,1 μg/ mL. Mieszaj na nutatorze. W przypadku przygotowywania większych ilości nicieni użyj kolby Nunclon o pojemności 600 mL z nakrętką z filtrem.
  3. O godzinie 14:30 dodaj szczep OP50 przygotowany w Części 1 do stężenia końcowego 6 mg/ mL (= 1,2 x109 bacteria/ mL). Przenieś OP50 z powrotem do temperatury 4°C.
  4. Przenieś 120 μL zawiesiny nicieni z OP50 do każdej studzienki płytki 96-dołkowej. Użyj płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem. Podczas pipetowania upewnij się, że nicienie pozostają w zawiesinie.
  5. Uszczelnij płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej, aby zapobiec kontaminacji i odparowaniu. Wstrząsaj płytkę na wytrząsarce do płytek mikrotytrujących przez 2 min, a następnie inkubuj przez 2 dni w temperaturze 20°C, aż zwierzęta osiągną stadium L4.

Dzień 0: Czwartek (tydzień 2) przed południem: Sterylizacja zwierząt poprzez dodanie fluorodeoksyurydyny (FUDR)

  1. Aby wysterylizować zwierzęta, należy dodać 30 μL roztworu zapasowego FUDR o stężeniu 0,6 mM do każdej studni. Ten etap zwiększa końcową objętość w każdej studni do 150 μL i zmniejsza końcowe stężenie OP50 z 6 mg/mL do 5 mg/mL (1x109 bakterii/mL). Uszczelnij płytkę za pomocą taśm uszczelniających i wstrząsaj przez 2-3 min na wstrząsarku do płytek mikrotitracyjnych. Jeśli OP50 dodano o 2:30 w dniu -2, ważne jest, aby FUDR został dodany przed południem. Włóż płytki z powrotem do inkubatora ustawionego na 20°C

Dzień 1: Piątek (tydzień 2): Dodanie leków do hodowli

  1. Do godziny 9:00 większość zwierząt powinna być ciążna i posiadać po kilka jaj. Dodać leki, których wpływ na długość życia ma zostać przetestowany, w pożądanym stężeniu. W przypadku rozpuszczania leków w DMSO końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,6%, ponieważ stężenia DMSO wyższe niż 0,6% skracają żywotność C.elegans. Po dodaniu leku uszczelnić płytki taśmą uszczelniającą i potrząsać przez 2-3 min na wytrząsarce do płytek mikrotitracyjnych. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 20°C
  2. Dodawanie leków może sporadycznie doprowadzić do śmierci kilku osobników na płytkę, szczególnie w przypadku stosowania rozpuszczalnika innego niż woda. Użyć mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność martwych zwierząt. Zazwyczaj na płytce 96-dołkowej powinno znajdować się mniej niż 10 martwych osobników. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 20°C.

Dzień 4: poniedziałek (tydzień 3): Wymiana uszczelniaczy

  1. Aby umożliwić dopływ świeżego tlenu do hodowli, należy usunąć uszczelnienie, odczekać 1minute i ponownie uszczelnić płytkę. Płytkę należy inkubować przez 2-3 minuty na wytrząsarce do płytek mikrotitracyjnych. Czynność tę należy powtarzać raz w tygodniu.

Dzień 5: wtorek (tydzień 3): Dodaj świeżą hodowlę OP50, aby zapobiec głodowaniu

  1. Do każdego z 96 dołków dodaj 5 μL przygotowanego w części 1 roztworu OP50 o stężeniu 100 mg/mL, aby zapobiec głodzeniu.

3. Ocena długości życia.

W tej sekcji opisano sposób monitorowania przeżywalności zsynchronizowanej populacji nicieni z części 2 aż do śmierci zwierząt. Do obserwacji zwierząt w płytkach 96-dołkowych należy użyć mikroskopu odwróconego z obiektywem 2x lub 2,5x. Dane dotyczące przeżywalności należy rejestrować trzy razy w tygodniu: w poniedziałki, środy i piątki. Aby określić, czy zwierzęta żyją, czy nie, należy kierować się ich ruchem. Silne światło, zwłaszcza niebieskie, pobudza zwierzęta do ruchu. Martwych zwierząt nie należy usuwać z testu. Okazyjnie zdarza się, że zwierzęta, które nie poruszały się i zostały uznane za martwe podczas poprzedniego liczenia, mogą zacząć się poruszać w późniejszym czasie.

  1. W dniu 0, na początku eksperymentu, należy policzyć całkowitą liczbę nicieni w każdej studni. Studnie zawierające więcej niż 18 zwierząt należy wykluczyć z analizy, ponieważ zwierzęta w tych studniach nie będą miały dostępu do wystarczającej ilości OP50 i wykażą efekty restrykcji dietetycznej.
  2. Aby zwiększyć szansę na poruszanie się zwierząt, należy wstrząsać płytką 96-dołkową na wstrząsarce do płytek mikrotitracyjnych przez 2 min przed liczeniem.
  3. Podczas każdej sesji liczenia należy zapisać datę oraz liczbę zwierząt, które się poruszają, uznając je za żywe. Ruch w cieczy jest znacznie łatwiejszy niż na podłożu stałym i może być indukowany silnym światłem. Zastosowanie większego powiększenia może pomóc w dostrzeżeniu bardzo subtelnych ruchów, takich jak ruchy końcówki gardła. Takie subtelne ruchy są często jedynymi obserwowanymi ruchami u bardzo starych zwierząt.
  4. Płytki należy zwrócić do inkubatora ustawionego na 20°C
  5. Kroki 2–4 należy powtarzać co dwa do trzech dni, aż wszystkie zwierzęta padną.

4. Reprezentatywne wyniki.

W tej sekcji przedstawiono przykład sposobu prowadzenia dokumentacji danych dotyczących długości życia uzyskanych w tym teście oraz niektóre reprezentatywne wyniki.

Rycina 1A przedstawia przykład sposobu rejestrowania danych dotyczących długości życia podczas tego testu. Arkusz programu Excel służy do monitorowania przeżywalności populacji w każdym dołku. Na początku eksperymentu dla każdego dołka zapisuje się jego współrzędne na płytce, szczep, lek, stężenie leku oraz całkowitą liczbę żywych zwierząt w dniu 0 (X0). Datę oraz liczbę zwierząt żywych i martwych należy rejestrować trzy razy w tygodniu, aby śledzić przeżywalność poszczególnych populacji w każdym dołku. Aby przedstawić wyniki na wykresie, należy obliczyć ułamek zwierząt żywych dla każdego dnia i nanieść go jako funkcję czasu wyrażonego w dniach. Wartości p należy obliczyć przy użyciu pakietów statystycznych, takich jak STATA lub podobnego oprogramowania.

Średnia długość życia C.elegans jest zależna od temperatury. Rycina 1B pokazuje, że zależne od temperatury zmiany długości życia są dokładnie odtwarzane przez test długości życia oparty na mikropłytkach22. Podobnie, test z wykorzystaniem mikropłytek odtwarza zmiany długości życia u mutantów, w przypadku których zgłoszono długość życia różniące się od zwierząt typu dzikiego N223-24 25(Ryc. 1C).

Analizę tę można również wykorzystać do sformułowania bardziej ilościowych wniosków. Na Rys. 1D przedstawiono średnią długość życia w funkcji stężenia mirtazapiny7. Każdy punkt danych reprezentuje średnią długość życia populacji od 7 do 12 osobników, z których każda populacja znajdowała się w oddzielnej studzince. Mimo że liczba zwierząt w jednej studzince jest stosunkowo niewielka (5–15 osobników), zmienność między studzinkami jest relatywnie mała, co widać po słupkach błędów.

Analiza długości życia C. elegans z użyciem mirtazapiny; dane eksperymentalne, krzywe przeżywalności, wykres statystyczny.
Rysunek 1. Test długości życia oparty na płytkach mikrotitracyjnych dokładnie odwzorowuje zmiany długości życia raportowane w literaturze.
(A) Przykładowe dane zebrane w arkuszu kalkulacyjnym Excel. Podczas każdej sesji liczenia zapisywano datę, współrzędne dołka oraz liczbę zwierząt żywych i martwych. Na początku eksperymentu określono całkowitą liczbę zwierząt w każdym dołku. (B) Krzywa przeżywalności zwierząt typu dzikiego (N2) hodowanych w temperaturze 20°C i 25°C. (C) Krzywe przeżywalności szczepów posiadających mutacje wpływające na długość życia. Wszystkie cztery szczepy badano równolegle w temperaturze 20°C. (D) Krzywa zależności dawka-odpowiedź dla zwierząt N2 traktowanych mirtazapiną. Średnia długość życia przedstawiona jako funkcja stężenia mirtazapiny. Słupki błędu oznaczają S.E.M dla 8 dołków na warunek.

5. Materiały.

bufor M9, 1000 mL

  • 6 g Na2HPO4
  • 3 g KH2PO4
  • 5 g NaCl
  • 0.25 g MgSO4∙7H2O
  • Dodać wodę dejonizowaną do objętości 1000 mL
  • Autoklawować

Bufor fosforanowo-potasowy pH 6.0, 1000 mL

  • 136 g KH2PO4
  • Dopełnić dejonizowaną wodą do 900 mL
  • Dostosować pH do 6,0 za pomocą 5M KOH
  • Dopełnić dejonizowaną wodą do 1000 mL
  • Autoklawować

Roztwór śladowy metali

  • 1,86 g Na2EDTA
  • 0,69 g FeSO4 ∙7H2O
  • 0,20 g MnCl2 ∙ 4H2O
  • 0,29 g ZnSO4 ∙7H2O
  • 0,016 g CuSO4
  • 1000 mL wody dejonizowanej
  • Sterylizować w autoklawie i przechowywać w ciemności.

pożywka S-basal, 1000 mL

  • 5,9 g NaCl
  • 50 mL 1M fosforanu potasu, pH 6,0
  • 1000 mL wody dejonizowanej
  • Autoklaw
  • Pozostawić roztwór do ostygnięcia, a następnie dodać 1 mL cholesterolu o stężeniu 5mg/mL (rozpuszczonego w Et-OH).

Cytrynian potasu 1M, 1000 mL

  • 268,8 g cytrynianu potasu
  • 26,3 g kwasu cytrynowego monohydratu
  • Dodać 900 mL wody dejonizowanej
  • Dostosować pH do 6,0 za pomocą 5M KOH
  • Dopełnić wodą dejonizowaną do 1000 mL
  • Autoklawować

pożywka S-complete, 1000 mL

  • 977 mL S-basal
  • 10 mL 1M cytrynian potasu pH 6 (sterylny)
  • 10 mL roztwór mikroelementów (sterylny)
  • 3 ml 1M CaCl2 (sterylny)
  • 3 mL 1M MgSO4 (sterylny)

Agar NGM

  • 3,0g NaCl
  • 2,5g Peptonu (z kazeiny, trawienie trysynowe)
  • 17g Agaru
  • Dopełnić wodą dejonizowaną do 975 mL i dodać mieszadło magnetyczne
  • Autoklawować
  • Po autoklawowaniu schłodzić do 55°C i dodać następujące składniki:
    • 0,5 mL 1M CaCl2 (sterylne)
    • 1 mL 5mg/mL cholesterolu w etanolu
    • 1 mL 1M MgSO4 (sterylne)
    • 25 mL buforu fosforanowego potasu, pH 6,0 (sterylne)

TB, 1000 mL

  • 12g Bacto Tryptone
  • 24 g ekstraktu drożdżowego
  • 4 mL glicerolu
  • Dodać 900 mL wody dejonizowanej
  • Autoklawować
  • Po autoklawowaniu schłodzić do 55°C i dodać następujący składnik:
    • dodać 100 mL 0,17M KH2PO4/0,72M K2HPO4

0,6 mM fluorodeoksyurydyny (FUDR, sigma kat# F0503), 1000 mL

  • 100 mg FUDR
  • Rozpuścić w 670 mL sterylnego pożywki S-complete, przygotowując aliquoty po 10 mL lub 45 mL.
  • Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Carbenycylina 100 mg/mL, 10 mL

  • 1 g Karbenicyliny
  • 10 mL sterylnej wody dejonizowanej
  • Sterylny filtrat i podział na aliquoty
  • Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  • Stosować w stężeniu końcowym 50 μg/ mL

250ug/ mL Amfoterycyny B, 4 mL

  • 1mg Amfoterycyny B
  • 4 mL Et-OH
  • Przechowywać w temperaturze -20 °C
  • Stosować w stężeniu końcowym 0,1 μg / mL

Dyskusja

Przedstawiony protokół umożliwia pomiar długości życia C.elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Jak pokazano w sekcji z reprezentatywnymi wynikami, metoda ta wiarygodnie powiela poprzednie ustalenia i dostarcza informacji ilościowych. Wykorzystując ten test, z sukcesem przebadaliśmy ponad 89 000 cząsteczek pod kątem ich wpływu na długość życia C.elegans.

W celu przesiewania leków pomiar długości życia w formacie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej oferuje kilka zalet w porównaniu z klasycznym testem na podłożach stałych. Pozwala on na zmniejszenie nakładu pracy potrzebnej do przygotowania pożywek, ograniczenie przestrzeni inkubacyjnej oraz zmniejszenie ilości wymaganego leku. Format 96-dołkowy oraz konfiguracja mikroskopowa umożliwiają automatyzację całego testu w celu prowadzenia przesiewów wysokoprzepustowych.

Podczas opracowywania testu sprawdzono wpływ wielu wartości dla każdej zmiennej oraz ich kombinacji na długość życia C.elegans. Testy te obejmowały różne stężenia OP50 w zakresie od 3 do 10 mg/ mL (3, 4, 6, 8, 10 mg/ mL), różną liczbę nicieni na dołek w zakresie od 7 do 45 (7, 10, 15, 22, 45 nicieni/dołek), różne objętości hodowli w zakresie od 40 do 150 μL na dołek (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL) oraz zmiany w składzie buforu. W przypadku karmienia szczepem OP50 opornym na karbenicylinę stwierdzono, że ani karbenicylina, ani amfoterycyna B w podanych stężeniach nie wpływają na długość życia C.elegans. Ciągłe, delikatne wstrząsanie płytek, często zalecane w płynnych hodowlach C.elegans, okazało się zbędne przy małych objętościach stosowanych w tym teście. Delikatne wstrząsanie jest jednak wymagane w przypadku zastosowania płytek mikrotitracyjnych z większymi dołkami. Wartości wskazane w niniejszym protokole zostały starannie dobrane na podstawie statystycznego porównania różnych badanych warunków.

Najbardziej zaskakującą cechą tego testu jest prawdopodobnie fakt, że C.elegans można hodować w płytkach 96-dołkowych uszczelnionych taśmą. Porównania bezpośrednie nie wykazały żadnych różnic w długości życia zwierząt hodowanych w płytkach nieszczelnych, w płytkach uszczelnionych plastikowym zamknięciem lub w płytkach uszczelnionych zamknięciami umożliwiającymi wymianę powietrza. W każdym z tych trzech wariantów zwierzęta rozwijały się bardzo jednorodnie od stadium L1 do dorosłych osobników zapłodnowanych w ciągu 65 godzin i wykazywały bardzo zbliżoną długość życia. Zwierzęta hodowane równolegle na NGM rozwijały się nieco szybciej, ale różnica ta była niezależna od braku lub obecności uszczelnienia.

Przedstawiony protokół opiera się na żywych bakteriach, ale może zostać przystosowany do bakterii martwych. Jednak w teście w fazie ciekłej pojedyncza przeżywająca bakteria może szybko się namnożyć i ponownie zasiedlić hodowlę. W naszych doświadczeniach jedynym niezawodnym sposobem na zabicie bakterii w stopniu umożliwiającym ich wykorzystanie w hodowli ciekłej jest przedłużona ekspozycja bakterii na promieniowanie gamma.

Ważnym punktem do rozważenia podczas planowania eksperymentu nad długością życia jest moc detekcji. W zależności od wielkości efektu, działanie badanego leku musi zostać przetestowane w wielu studzienkach. W typowym analizie 4 studzienki z lekiem i 4 studzienki kontrolne, odpowiadające w przybliżeniu 40-50 zwierzętom w każdej, powinny wystarczyć do wykrycia 30% wzrostu długości życia w ponad 95% eksperymentów. Wzrosty rzędu 14% są wykrywane tylko w 60% przypadków i dlatego wymagają większej liczby powtórnych studzienek.

Obfitość danych dotyczących długości życia, uzyskanych dzięki temu testowi, może zostać wykorzystana do opracowania parametrów modeli Gompertza specyficznych dla danego eksperymentu lub szczepu1. Modele Gompertza te są użyteczne do określenia mocy detekcji oraz oszacowania liczby wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych w badaniach przesiewowych na dużą skalę. Zweryfikowaliśmy przewidywania tych modeli w ślepych próbach i wykorzystaliśmy je do oszacowania liczby wyników fałszywie ujemnych w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych (wyniki nieopublikowane).

Podsumowując, przewidujemy, że przedstawiony test okaże się bardzo użyteczny w identyfikacji małych cząsteczek przedłużających długość życia C.elegans oraz w badaniu leżących u ich podstaw mechanizmów.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejszy protokół został opracowany pierwotnie w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle przez Xiaolan Ye i Michaela Petraschecka w laboratorium Lindy Buck. Powyższa wersja szczegółowa została przygotowana w celu udostępnienia całej procedury szerszej społeczności naukowej. Dziękujemy Carol Taylor, Sarah LeBoeuf i Andy'emu Tomacelli za krytyczną recenzję protokołu. Jest to manuskrypt nr 2866 z The Scripps Research Institute. Laboratorium Petraschecka jest finansowane przez program Novartis ADI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amfoterycyna BCalbiochemcat# 171375Znana również jako Fungizone
FUDRSigma-Aldrichcat# F0503FUDR jest dezaktywowany przez ciepło, rozmrażać w zimnej wodzie
MianserynaSigma-AldrichM2525-250MGStosować jako kontrolę pozytywną w końcowym stężeniu 50μM
CyproheptadynaSigma-Aldrichcat#C6022-MGAlternatywna kontrola pozytywna w końcowym stężeniu 10 μM
Taśma uszczelniającaNalge Nunc internationalcat# 236370Poliestrowa, niesterylna
Płytka 96-dołkowaFalcon BDcat# 351172Nietraktowana, przezroczysta, sterylna w opakowaniu jednostkowym, polistyrenowa
Kolba NunclonNalge Nunc internationalcat# 178883Stosowana do dużych objętości

Bibliografia

  1. Johnson, T. E. Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging. Science. 249, 908-912 (1990).
  2. Kenyon, C. J. The genetics of ageing. Nature. 464, 504-512 (2010).
  3. Finch, C. E., Ruvkun, G. The genetics of aging. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).
  4. Wilson, M. A. Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5, 59-68 (2006).
  5. Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, 258-262 (2005).
  6. McColl, G. Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).
  7. Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 553-556 (2007).
  8. Srivastava, D. Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans. Biogerontology. 9, 309-316 (2008).
  9. Wood, J. G. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, 686-689 (2004).
  10. Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 7, 305-317 (2008).
  11. Onken, B., Driscoll, M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).
  12. Wu, Z. Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).
  13. Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).
  14. Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 11, 45-52 (2010).
  15. Melov, S. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, 1567-1569 (2000).
  16. Benedetti, M. G. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).
  17. Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings. Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).
  18. Kwok, T. C. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
  19. Moy, T. I. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).
  20. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  23. Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).
  24. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
  25. Lakowski, B., Hekimi, S. Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes. Science. 272, 1010-1013 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 5/18/2011. Citeable Link.

null

Tagi

D ugo ycia C elegansp ytki 96 do kowesynchronizacja nicieniprzygotowanie OP 50traktowanie FUDRprzesiewanie lek wmikroskopia odwr conaocena prze ywalno ciefekty temperaturytest mirtazapiny

Powiązane artykuły