Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiałów przepuszczalnych dla gazów

Summary

Wprowadzenie do technologii, protokołu i obsługi naczyń Corning HYPERStack oraz akcesoriów używanych do wysokowydajnych hodowli komórek adherentnych. Protokół pokaże, w jaki sposób można wykorzystać naczynia systemu zamkniętego do zwiększenia ilości komórek w porównaniu z obecnymi produktami ułożonymi w stosy.

Abstract

Hodowla komórek przylegających do dużej objętości jest obecnie standaryzowana na produktach do wzrostu komórek na płytkach ułożonych w stos, gdy kulki mikronośnikowe nie są optymalnym wyborem. Zbiorniki HYPERStack umożliwiają skalowanie systemu zamkniętego w górę w stosunku do obecnych produktów z płytami ułożonymi w stos i dostarczają >2,5 razy więcej ogniw na tej samej powierzchni objętościowej. Zbiorniki HYPERStack działają w oparciu o materiał przepuszczalny dla gazu, który umożliwia wymianę gazową, eliminując w ten sposób potrzebę wewnętrznej przestrzeni nad zbiornikiem. Eliminacja przestrzeni nad głową pozwala zminimalizować przedział, w którym zachodzi wzrost komórek, w celu zmniejszenia przestrzeni, umożliwiając więcej warstw powierzchni wzrostu komórek w obrębie tego samego śladu objętościowego.

Dla wielu zastosowań, takich jak terapia komórkowa czy produkcja szczepionek, do wzrostu i pobierania komórek wymagany jest zamknięty system. Naczynie HYPERStack umożliwia dodawanie i usuwanie komórek i odczynników za pomocą rurek z worków na pożywki lub innymi metodami.

Ten protokół wyjaśni technologię stojącą za materiałem przepuszczalnym dla gazów używanym w zbiornikach HYPERStack, wyniki dyfuzji gazu w celu zaspokojenia potrzeb metabolicznych komórek, protokoły wzrostu komórek w systemie zamkniętym oraz różne metody zbierania.

Protocol

1. Statek HYPERStack - tło technologii materiałów przepuszczalnych dla gazów

1. Naczynie HYPERStack to wielowarstwowe naczynie do hodowli komórek w systemie zamkniętym, które opiera się na wymianie gazowej przez przepuszczalną dla gazu folię polimerową o średnicy 76,2 mikrona do metabolizmu komórkowego.
2. Naczynie HYPERStack różni się od bardziej tradycyjnych naczyń do hodowli komórkowych tym, że nie ma "przestrzeni nad głową" nad komórkami wewnątrz naczynia. Zamiast zawierać tę "przestrzeń nadprożową" do wymiany gazowej w zbiorniku, produkty przepuszczalne dla gazu mają przestrzenie powietrzne (określane jako przestrzenie "tchawicy") pod każdą komorą hodowlaną, która jest otwarta na atmosferę.
3. Ta przestrzeń tchawicy umożliwia komórkom rosnącym w każdym przedziale hodowli komórkowej naczynia równoważną wymianę gazową.
4. Folia przepuszczająca gaz umożliwia wymianę gazową przy zachowaniu sterylnego środowiska. Wszystkie manipulacje płynami dla każdej z wielu warstw odbywają się przez jeden port wejściowy.

2. Podsumowanie komponentu HYPERStack Vessel

1. Stackette to indywidualna komora do hodowli komórkowych, która składa się z górnej płyty i folii przepuszczającej gaz. Komórki są hodowane w tym komponie.
2. Kolektor cieczy łączy ze sobą każdą z 12 warstw stosu w module HYPERStack. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia w wielokrotności 12 warstw. Kolektor pozwala użytkownikowi na wykonanie jednej manipulacji płynem na całym naczyniu.
3. Kolektor powietrzny również łączy ze sobą warstwy stosu, ale służył do wypierania powietrza z naczynia, gdy dochodzi do dodawania płynów. Zawiera linię napełniania do użycia podczas napełniania.
4. Przestrzeń tchawicy to otwarta przestrzeń powietrzna między każdą warstwą stosu, umożliwiająca wymianę gazową przez przepuszczalną dla gazu folię każdej warstwy.
5. Rurka do obsługi cieczy jest podłączona do kolektora cieczy i służy do wykonywania wszystkich manipulacji płynami w układzie zamkniętym. Ten komponent można dostosować.
6. Rurka odpowietrzająca jest podłączona do kolektora powietrza, zawiera filtr powietrza i służy do odprowadzania nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności.
7. Rurka pościgowa ma filtr i zacisk i jest podłączona do rurki do obsługi cieczy i służy do odprowadzania płynu z rurki do obsługi cieczy po napełnieniu naczynia.
8. Manipulator stosu Corning lub CSM to urządzenie manipulacyjne, które pomaga w ustawianiu naczyń we właściwych pozycjach podczas użytkowania.
9. Klin napełniający to pomoc ze stali nierdzewnej używana podczas ręcznego napełniania zbiorników HYPERStack.

3. Wyniki dyfuzji gazu przez przepuszczalną dla gazów folię stosowaną w zbiornikach HYPERStack

1. W tradycyjnych systemach wzrostu komórek z wentylowaną przestrzenią nad głową, tlen w pożywce jest wyczerpywany średnio o 50% w ciągu 3 dni w hodowli. (Rysunek 1)
2. W tym samym systemie wzrostu komórek gradient tlenu w pożywce o wysokości 3 mm jest prawie o 50% większy na styku pożywki z przestrzenią nad głową niż w warstwie komórkowej. (Rysunek 2)
3. Dyfuzja tlenu przez przepuszczalną dla gazu folię polistyrenową o grubości 76,2 mikrona jest równa dyfuzji przez 2,6 mm mediów. Folia przepuszczająca gaz zastosowana w zbiornikach HYPERStack umożliwia wymianę gazową zachodzącą w warstwie komórkowej.
4. % tlenu w przestrzeni tchawicy naczyń HYPERStack pozostaje stały, gdy komórki rosną do zbieżności. (Rysunek 3)

4. Przygotowanie torby na media

1. Naczynie warstwowe HYPERStack-12 przyjmuje 1,3 l podłoża, a naczynie warstwowe HYPERStack-36 przyjmuje 3,9 l podłoża.
2. Przed zaszczepieniem pożywki w worku, jeśli ma być użyta surowica, przyspawać rurkę do worka z surowicą i dokładnie wymieszać.
3. Zaciśnij około 300 ml nośnika w worku za pomocą dużych zacisków do worków. Zapewni to, że wszystkie zaszczepione komórki zostaną wykorzystane podczas napełniania i żadna nie pozostanie w torbie z pożywką. Umieść torbę na nośniki na stojaku na torby.

5. Pożywka do szczepienia

1. Napełnić strzykawkę rurką z dołączoną zawiesiną komórek. Rurka spawać rurkę 3/16" ze strzykawki zawierającej zawiesinę komórek do worka z mediami.
2. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do torebki z podłożem i dobrze wymieszać.

6. Procedura napełniania

1. Rurka przyspawać worek z zaszczepioną pożywką do rurki do obsługi cieczy 3/8" naczynia HYPERStack. (Korzystając z łączników sterylnych lub wielofunkcyjnych (MPC), można również przymocować worek na nośniki do naczynia).
2. Zamknij zaciski na przenoszeniu cieczy i probówkach w HYPERStack.
3. Umieść 36-warstwowe naczynie HYPERStack w CSM w pozycji obciążenia; zaczep rurkę filtra wentylacyjnego w zacisku mocującym na CSM. Dokręć pokrywę i przesuń CSM do pozycji napełnienia. Umieszczając naczynie w odpowiedniej pozycji napełnienia; Filtr powietrza znajduje się teraz w najwyższym położeniu, aby zapobiec zamoczeniu podczas napełniania. Kąt 10° umożliwia wyrównanie cieczy z warstwami podczas napełniania. Naczynie warstwowe HYPERStack-12 umieszczone na boku na klinie napełniającym znajduje się w prawidłowej pozycji do napełniania.
4. Usuń powietrze z linii napełniania, umieszczając worek na tym samym poziomie co naczynie HYPERStack (nie wyżej). Utrzymywanie zamkniętego zacisku rury pościgowej; Otwórz rurkę do obsługi cieczy clamp i worek na media clamp aby umożliwić przedostanie się płynu do naczynia.
5. Korzystając ze stojaka na torbę, podnieś worek na nośnik, aby zawiesina komórek mogła wpłynąć do naczynia.
6. Napełniać naczynie tak długo, aż cała zaszczepiona pożywka dostanie się do naczynia; 300 ml pożywki powinno nadal pozostać w górnej części worka z pożywką. Zdejmij clamp z torby na nośnik, aby kontynuować napełnianie naczynia. Gdy ciecz zbliża się do górnego kolektora powietrza, zwolnij szybkość napełniania, opuszczając worek na media, aby zapobiec przepełnieniu. Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i clamp rurkę do przenoszenia cieczy.

7. Procedura izolacji w celu zamknięcia cieczy w warstwach

1. Doprowadzić naczynie HYPERStack w CSM do pozycji izolacji, tak aby oba zestawy kolektorów znalazły się w najwyższym położeniu i opuścić worek z pożywką poniżej wysokości naczynia. Naczynie warstwowe HYPERStack-12 można podnieść do pozycji izolacyjnej, kładąc rękę na boku naczynia i używając drugiej do podniesienia klina napełniającego.
2. Gdy filtr chase jest trzymany w pozycji pionowej, otwórz rurkę chase clamp. Spowoduje to opróżnienie lub przepchnięcie nośnika z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka na media. Gdy rurka jest pusta, zamknij zacisk na wężyku worka na nośnik.
3. Trzymając filtr rurki pościgowej w pozycji pionowej, otwórz zacisk na rurze do obsługi cieczy na HYPERStack, aby umożliwić dostanie się pozostałej cieczy i zrównoważenie się w naczyniu. Poczekaj 1-2 minuty, aż to nastąpi.
4. Obrócić naczynie HYPERStack w CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Opuść naczynie do pozycji załadunku na CSM. Lekkie przechylenie naczynia warstwowego HYPEStack-12 w lewo pozwoli na usunięcie klina napełniającego. Zamknij zaciski zarówno na rowku, jak i wężyku do przenoszenia cieczy.
5. Worek z pożywką można teraz wyjąć z naczynia lub może on pozostać przymocowany do wykorzystania w dalszej części procedury zbioru. Aby przechowywać dołączoną torbę na nośniki, zwiń pustą torbę i wszelkie pozostałe nośniki w torbie i umieść pod taśmami mocującymi w tacce do przechowywania naczynia HYPERStack.
6. Przenieść naczynie HYPERStack do inkubatora. Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby płyn nie dostał się do filtra odpowietrzającego. Osiąga się to poprzez lekkie przechylenie końca kolektora HYPERStack do góry.

8. Protokół Żniw

1. Aby rozpocząć procedurę zbioru, należy zespawać rurkę z roztworem dysocjacyjnym komórek i schować worki razem, tworząc zespół worka do zbioru. Upewnij się, że wszystkie rurki clamps są zamknięte. (Użyj kreskówki, aby zademonstrować)
2. Wyjmij naczynie HYPERStack z inkubatora, zwolnij worek z pożywką spod taśm mocujących i zawieś na stojaku na worki. Umieść naczynie w CSM w pozycji ładunkowej i dokręć pokrywę, aby zabezpieczyć naczynie. Zaczep rurkę odpowietrzającą w zacisku mocującym i przesuń CSM do pozycji napełniania.
3. Upewnij się, że worek na nośnik na stojaku na torbę zwisa niżej niż HYPERStack; otwórz zacisk na rurki worka na nośnik i wężyku do przenoszenia płynów w naczyniu, aby umożliwić przepływ nośnika do dołączonej torby.
4. Gdy naczynie jest puste w około 3/4, zmień ustawienia CSM na ostateczną pustą pozycję. Gdy naczynie HYPERStack i rurka do obsługi cieczy są puste, podnieś rurkę, aby przepchnąć nośnik przez zacisk na wężyku ze zużytym workiem na media, a następnie zamknij zarówno zacisk na wężyku do obsługi cieczy, jak i zacisk na wężyku ze zużytym workiem na media.
5. Zastąp worek zużytą pożywką zespołem worka do zbioru przez spawanie rurowe i podnieś wysokość zespołu worka do dysocjacji ogniw powyżej wysokości HYPERStack za pomocą stojaka na worki.
6. Umieść CSM w pozycji równowagi. Otwórz zacisk rurki z roztworem do dysocjacji komórek i przenieś roztwór do HYPERStack. Po zakończeniu przenoszenia zamknij zaciski na wężyku do przenoszenia cieczy i wężyku roztworu do dysocjacji komórek.
7. Ustaw CSM w pozycji obciążenia. Przytrzymując otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego, delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek. Naczynie może czasami być przywracane do pozycji równowagi podczas kołysania, aby utrzymać równomierne rozprowadzenie roztworu. Może nie być wizualnie widoczne, że warstwy są całkowicie pokryte, ale roztwór dysocjacyjny zostanie równomiernie rozłożony na powierzchni komórek. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu zwolnij dźwignię na CSM, aby zablokować HYPERStack w pozycji obciążenia. Pozostaw HYPERStack w tej pozycji na czas wymagany dla twoich komórek.
8. Gdy komórki się odłączą, używając zmętnienia jako przewodnika, przesuń CSM do pozycji równowagi. Należy uważać, aby nie trawić komórek w nadmiarze. Otwórz zacisk worka hartowniczego i zacisk rurki do obsługi cieczy HYPERStack, aby umożliwić wejście medium hartowniczego do naczynia. Zamknij zacisk na wężyku do obsługi cieczy HYPERStack po zakończeniu przenoszenia.
9. Przywróć CSM do pozycji załadunku i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby kołysać naczynie na boki.
10. Korzystając ze stojaka na worki, obniż położenie zespołu worka do zbioru poniżej poziomu HYPERStack. Ustaw CSM w pozycji pustej, otwórz rurkę do obsługi cieczy w naczyniu clamp i przenieś roztwór ogniwa z powrotem do worka hartującego. Przywróć CSM do pozycji załadunku i odłącz zespół worka do zbioru od naczynia za pomocą zgrzewarki do rur. Roztwór komórkowy jest gotowy do przetwarzania.

9. Reprezentatywne wyniki

• Czas zbioru musi być zoptymalizowany przy przechodzeniu ze standardowej powierzchni polistyrenowej na powierzchnię z polistyrenu przepuszczalnego dla gazu. Komórki mają tendencję do szybszego uwalniania się po produkcie HYPERStack.
• Aby wyświetlić komórki pod mikroskopem, należy zacisnąć rurki wentylacyjne i rurki do przenoszenia cieczy. Umieść naczynie HYPERStack do góry nogami, z kolektorami skierowanymi w dół, na stoliku mikroskopu.
• Można podjąć kroki zapobiegawcze, aby uniknąć zamoczenia filtrów podczas użytkowania, co spowoduje, że przestaną działać. Nie przepełniając naczynia HYPERStack i utrzymując rurkę odpowietrzającą i zębatkę uniesioną, gdy zaciski są otwarte, nie powinno dojść do zwilżenia.
• Nacisk zamkniętych zacisków na rurkę powoduje, że pozostaje ona zamknięta po otwarciu zacisków. Ściśnięcie rurki w przeciwnym kierunku spowoduje jej otwarcie.
• Czas przepływu mediów wchodzących i wychodzących ze zbiornika HYPERStack za pośrednictwem zasilania grawitacyjnego opiera się na różnicy wysokości mediów między górnym poziomem mediów w zbiorniku HYPERStack a górnym poziomem mediów w zbiorniku na media. Im większa odległość, tym szybszy przepływ. Maksymalny przepływ jest ograniczony przez wydajność filtrów do 1,5 l/min.
• Utrzymanie odpowiedniej objętości wypełnienia w naczyniu HYPERStack zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorach wzrostu komórek. Pęcherzyki powietrza mogą powstać w wyniku pobierania próbek lub inkubacji w nienawilżanym środowisku z powodu utraty wody przez parowanie. Ilość i częstotliwość pobierania próbek, a także warunki inkubacji określą, czy użytkownik końcowy powinien dodać dodatkowy płyn
.

Rysunek 1. Zubożenie tlenu w pożywce w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych. Rysunek przedstawia spadek mg/l tlenu na poziomie komórek w ciągu 3 dni.

Rysunek 2. Gradient tlenu w pożywce w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych. Rysunek pokazuje, że mg/l tlenu jest największy na przecięciu pożywki z przestrzenią nad głową niż w warstwie komórkowej.

Rysunek 3. Procentowa zawartość tlenu w przestrzeni tchawicy HYPERStack podczas wzrostu komórek. Rysunek pokazuje, że w ciągu 96 godzin procent tlenu między warstwami, który zasila każde dno folii przepuszczalnej dla gazu, pozostaje stały. Pokazuje to zdolność komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do konfluencji.

Discussion

W naczyniu HYPERStack udało się wyhodować komórki inżynieryjne, pierwotne i macierzyste. Dodawanie płynu do naczynia odbywa się za pomocą aseptycznych połączeń workowych za pomocą zasilania grawitacyjnego, a także przez pompowanie ze sterylnego pojemnika na pożywkę. Naczynie zapewnia ponad 2,5-krotny wzrost powierzchni wzrostu w porównaniu z ułożonym w stos produktem płytowym o tej samej powierzchni objętościowej. HYPERStack-12 ma 6 000 cm² obszaru wzrostu, HYPERStack-36 ma 18 000 cm² obszaru wzrostu, a HYPERStack-120 ma 60 000 cm² obszaru wzrostu. Zwiększając powierzchnię, użytkownicy są w stanie wyprodukować więcej komórek z tej samej populacji komórek lub partii komórek i zmniejszyć zmienność. Są również w stanie zaoszczędzić miejsce i/lub pracę, używając mniejszej liczby naczyń w celu osiągnięcia tej samej wydajności komórek lub zwiększając wydajność komórek bez dodawania ludzi, pomieszczeń czystych lub inkubatorów. System jest produkowany przy użyciu metod montażu o niskiej zawartości cząstek stałych i bez użycia klejów. Jest to zamknięty system, który jest wstępnie zmontowany z zestawami przewodów i filtrów, potrójnie zapakowany i dostarczony w sterylnej formie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 l nośniki w workach	Lonza Inc.	TBD	1350ml podłoża + 150ml serum (w razie potrzeby)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml podłoża + 400ml serum (w razie potrzeby)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Klin do napełniania	Corning	10040
Manipulator stosu	Corning	TBD
HyQtainer Podzespół Urządzenie do pobierania próbek Hyclon		SH3B0324.01
600 ml hartownika w workach (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600 ml roztworu do dysocjacji komórek	Lonza Inc.	Tbd