Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Podsumowanie

Wprowadzenie do technologii, protokołu i obsługi naczyń Corning HYPERStack oraz akcesoriów wykorzystywanych do wysokowydajnej hodowli komórek adherentnych. Protokół pokaże, jak wykorzystać naczynia z zamkniętym systemem w celu zwiększenia wydajności zbioru komórek w porównaniu do obecnie stosowanych produktów w formie stosów płytek.

Streszczenie

Hodowla przylegających komórek w dużych objętościach jest obecnie standaryzowana przy użyciu produktów do wzrostu komórek w postaci stosów płytek, gdy mikronośniki nie stanowią optymalnego wyboru. Naczynia HYPERStack umożliwiają skalowanie w systemie zamkniętym w odniesieniu do obecnych produktów w formie stosów płytek i pozwalają uzyskać >2,5X więcej komórek przy zachowaniu tej samej objętości całkowitej. Naczynia HYPERStack wykorzystują materiał przepuszczalny dla gazów, który umożliwia wymianę gazową, co eliminuje potrzebę pozostawiania wewnętrznej przestrzeni nad cieczą w naczyniu. Eliminacja przestrzeni nad cieczą pozwala na zminimalizowanie komory, w której zachodzi wzrost komórek, w celu oszczędności miejsca, co umożliwia rozmieszczenie większej liczby warstw powierzchni wzrostu komórek w tej samej objętości całkowitej.

W wielu zastosowaniach, takich jak terapia komórkowa czy produkcja szczepionek, wymagany jest zamknięty system do hodowli i zbioru komórek. Pojemnik HYPERStack umożliwia dodawanie i usuwanie komórek oraz odczynników za pomocą przewodów z worków z pożywką lub innymi metodami.

Niniejszy protokół wyjaśni technologię stojącą za materiałem przepuszczalnym dla gazów zastosowanym w naczyniach HYPERStack, wyniki dyfuzji gazów w celu zaspokojenia potrzeb metabolicznych komórek, protokoły hodowli komórkowej w systemie zamkniętym oraz różne metody zbioru komórek.

Protokół

1. Naczynie HYPERStack – podstawy technologii materiałów przepuszczalnych dla gazów

1. Naczynie HYPERStack to wielowarstwowe naczynie do hodowli komórek w systemie zamkniętym, które opiera się na wymianie gazowej poprzez 76,2 micron przepuszczalną dla gazów błonę polimerową niezbędną dla metabolizmu komórkowego.
2. Naczynie HYPERStack różni się od tradycyjnych naczyń do hodowli komórkowej tym, że nie posiada ono tzw. „przestrzeni nadpowierzchniowej” (headspace) nad komórkami wewnątrz naczynia. Zamiast utrzymywać taką przestrzeń do wymiany gazowej wewnątrz naczynia, produkty przepuszczalne dla gazów posiadają przestrzenie powietrzne (zwane przestrzeniami „trachealnymi”) pod każdą komorą hodowlaną, które są otwarte na atmosferę.
3. Przestrzeń trachealna ta umożliwia komórkom rosnącym w każdym przedziale hodowlanym naczynia równomierną wymianę gazową.
4. Błona przepuszczalna dla gazów umożliwia zachodzenie wymiany gazowej przy jednoczesnym zachowaniu sterylnego środowiska. Wszystkie manipulacje z cieczami dla każdej z wielu warstw odbywają się przez jeden port wlotowy.

2. Podsumowanie komponentów naczynia HYPERStack

1. Stackette to pojedyncza komora hodowli komórkowej, składająca się z górnej płytki oraz membrany przepuszczalnej dla gazów. W tej komorze odbywa się hodowla komórek.
2. Kolektor cieczy (Liquid Manifold) łączy ze sobą każdą z 12 warstw stackette w module HYPERStack. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia składające się z wielokrotności 12 warstw. Kolektor umożliwia użytkownikowi wykonanie jednej manipulacji cieczą dla całego naczynia.
3. Kolektor powietrza (Air Manifold) również łączy warstwy stackette, ale służy on do usuwania powietrza z naczynia podczas dodawania cieczy. Zawiera linię napełniania używaną podczas procesu napełniania.
4. Przestrzeń tchawkowata (Tracheal Space) to otwarta przestrzeń powietrzna między każdą warstwą stackette, która umożliwia wymianę gazową przez membrany przepuszczalne dla gazów każdej z warstw.
5. Rurki do obsługi cieczy są podłączone do kolektora cieczy i służą do wszystkich manipulacji cieczami w systemie zamkniętym. Ten komponent może być dostosowany do indywidualnych potrzeb.
6. Rurka odpowietrzająca jest podłączona do kolektora powietrza, zawiera filtr powietrza i służy do odprowadzania nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności.
7. Rurki odprowadzające (chase tubing) posiadają filtr oraz zacisk, są podłączone do rurek do obsługi cieczy i służą do usuwania cieczy z rurek do obsługi cieczy po napełnieniu naczynia.
8. Manipulator Corning Stack (CSM) to urządzenie pomocnicze ułatwiające umieszczanie naczyń w prawidłowych pozycjach podczas użytkowania.
9. Klin do napełniania (Filling Wedge) to wykonany ze stali nierdzewnej element pomocniczy, stosowany podczas ręcznego napełniania naczyń HYPERStack.

3. Wyniki dyfuzji gazów przez film przepuszczalny dla gazów stosowany w naczyniach HYPERStack

1. W tradycyjnych systemach hodowli komórkowej z wentylowaną przestrzenią nad cieczą, zawartość tlenu w pożywce ulega zmniejszeniu średnio o 50% w ciągu 3 dni hodowli. (Rycina 1)
2. W tym samym systemie hodowli komórkowej, gradient tlenu w warstwie pożywki o wysokości 3 mm jest niemal o 50% większy na styku pożywki z przestrzenią nad cieczą niż na poziomie warstwy komórek. (Rycina 2)
3. Dyfuzja tlenu przez gazoprzepuszczalną folię polistyrenową o grubości 76,2 µm jest równoważna dyfuzji przez 2,6 mm pożywki. Gazoprzepuszczalna folia zastosowana w naczyniach HYPERStack umożliwia wymianę gazową bezpośrednio na poziomie warstwy komórek.
4. Procentowa zawartość tlenu w przestrzeni tchawkowatej naczyń HYPERStack pozostaje stała w miarę wzrostu komórek do pełnej konfluencji. (Rycina 3)

4. Przygotowanie worków z pożywką

1. Naczynie HYPERStack-12 warstw przyjmuje 1,3L pożywki, a naczynie HYPERStack-36 warstw przyjmuje 3,9L pożywki.
2. Przed inokulacją pożywki w worku, w przypadku stosowania surowicy, należy zespawać worek z surowicą z workiem z pożywką i dokładnie wymieszać.
3. Odciąć za pomocą dużych zacisków do worków około 300 mL pożywki w worku. Zapewni to wykorzystanie wszystkich zainokulowanych komórek podczas napełniania i zapobiegnie ich pozostaniu w worku z pożywką. Umieścić worek z pożywką na statywie do worków.

5. Inokulacja podłoży

1. Napełnić strzykawkę z dołączonym przewodem zawiesiną komórek. Zespawać rurkami przewód 3/16" od strzykawki zawierającej zawiesinę komórek z workiem z pożywką.
2. Wstrzyknąć zawiesinę komórek do worka z pożywką i dokładnie wymieszać.

6. Procedura napełniania

1. Zespawaj rurką worek z zaszczepionym medium z przewodami do obsługi cieczy o średnicy 3/8" w naczyniu HYPERStack. (Używając Sterile Connects lub Multipurpose connects (MPCs), można również podłączyć worek z medium do naczynia).
2. Zamknij zaciski na przewodach do obsługi cieczy i przewodach przepławnych w systemie HYPERStack.
3. Umieść naczynie HYPERStack 36 Layer Vessel w CSM w pozycji załadunkowej; zahacz rurkę filtra odpowietrzającego o uchwyt mocujący w CSM. Dokręć pokrywę i przesuń CSM do pozycji napełniania. Dzięki umieszczeniu naczynia w odpowiedniej pozycji napełniania, filtr powietrza znajduje się teraz w najwyższym punkcie, aby zapobiec jego zamoczeniu podczas operacji napełniania. Kąt 10° umożliwia wyrównanie poziomu cieczy w warstwach podczas napełniania. Naczynie HYPERStack-12 layer vessel umieszczone na boku na klinie do napełniania znajduje się w prawidłowej pozycji do napełniania.
4. Usuń powietrze z linii napełniania, ustawiając worek na tym samym poziomie co naczynie HYPERStack (nie wyżej). Trzymając zacisk przewodu przepławnego zamknięty, otwórz zacisk przewodu do obsługi cieczy oraz zacisk worka z medium, aby umożliwić przepływ cieczy do naczynia.
5. Korzystając ze statywu na worek, podnieś worek z medium, aby wspomóc przepływ zawiesiny komórkowej do naczynia.
6. Napełniaj naczynie, aż całe zaszczepione medium wpłynie do środka; w górnej części worka z medium powinno pozostać jeszcze 300 mL medium. Zdejmij zacisk z worka z medium, aby kontynuować napełnianie naczynia. Gdy ciecz zbliży się do górnego kolektora powietrza, zmniejsz prędkość napełniania poprzez obniżenie worka z medium, aby zapobiec przepełnieniu. Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i zaciśnij przewód do obsługi cieczy.

7. Procedura izolacji w celu zatrzymania cieczy w warstwach

1. Przesuń naczynie HYPERStack w module CSM do pozycji izolacyjnej, tak aby oba zestawy kolektorów znajdowały się w najwyższym położeniu, a następnie opuść worek z pożywką poniżej wysokości naczynia. Naczynie HYPERStack z 12 warstwami można unieść do pozycji izolacyjnej, kładąc jedną dłoń na boku naczynia i używając drugiej do podniesienia klina napełniającego.
2. Trzymając filtr przepłukujący w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki przepłukującej. Spowoduje to opróżnienie lub przepłukanie pożywki z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka z pożywką. Po opróżnieniu rurki zamknij zacisk na przewodzie prowadzącym do worka z pożywką.
3. Trzymając filtr rurki przepłukującej w pozycji pionowej, otwórz zacisk na rurce do obsługi cieczy w systemie HYPERStack, aby umożliwić pozostałej cieczy wniknięcie i wyrównanie poziomu w naczyniu. Odczekaj 1-2 minuty, aż proces ten zostanie zakończony.
4. Obróć naczynie HYPERStack w module CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Opuść naczynie do pozycji załadunkowej w module CSM. Lekkie przechylenie naczynia HYPERStack z 12 warstwami w lewo umożliwi wyjęcie klina napełniającego. Zamknij zaciski na przewodach przepłukujących i do obsługi cieczy.
5. Worek z pożywką można teraz odłączyć od naczynia lub pozostawić go podłączonego do późniejszego użycia w procedurze zbioru. Aby przechować podłączony worek z pożywką, zroluj pusty worek wraz z pozostałą w nim pożywką i umieść go pod pasmami mocującymi w tacy przechowywania naczynia HYPERStack.
6. Przenieś naczynie HYPERStack do inkubatora. Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby ciecz nie przedostała się do filtra odpowietrzającego. Osiąga się to poprzez lekkie pochylenie końca z kolektorami HYPERStack do góry.

8. Protokół zbioru

1. Aby rozpocząć procedurę zbioru, należy zespawać rurki roztworu dysocjującego komórki i worków neutralizujących, tworząc zestaw worka do zbioru. Upewnij się, że wszystkie zaciski rurek są zamknięte. (Użyj schematu do demonstracji)
2. Wyjmij naczynie HYPERStack z inkubatora, zwolnij worek z pożywką spod pasów mocujących i powieś go na stojaku do worków. Umieść naczynie w CSM w pozycji załadunkowej i dokręć pokrywę, aby zabezpieczyć naczynie. Zahacz rurkę odpowietrzającą o uchwyt mocujący i przesuń CSM do pozycji napełniania.
3. Upewniając się, że worek z pożywką na stojaku wisi niżej niż HYPERStack, otwórz zacisk na rurce worka z pożywką oraz zacisk rurki do obsługi cieczy naczynia, aby umożliwić przepływ pożywki do dołączonego worka.
4. Gdy naczynie będzie opróżnione w około ¾, zmień ustawienia CSM na końcową pozycję opróżniania. Gdy naczynie HYPERStack i rurka do obsługi cieczy będą puste, unieś rurkę, aby przepchnąć pożywkę poza zacisk na rurce worka z zużytą pożywką, a następnie zamknij zarówno zacisk na rurce do obsługi cieczy, jak i zacisk na rurce worka z zużytą pożywką.
5. Zastąp worek z zużytą pożywką zestawem worka do zbioru poprzez spawanie rurek i podnieś zestaw worka z roztworem dysocjującym powyżej wysokości HYPERStack za pomocą stojaka do worków.
6. Umieść CSM w pozycji równoważenia. Otwórz zacisk rurki z roztworem dysocjującym komórki i przenieś roztwór do HYPERStack. Po zakończeniu przenoszenia zamknij zaciski na rurce do obsługi cieczy oraz rurce z roztworem dysocjującym komórki.
7. Przesuń CSM do pozycji załadunkowej. Trzymając otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego, delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek. Podczas kołysania naczynie można sporadycznie przywracać do pozycji równoważenia, aby utrzymać równomierny rozkład roztworu. Może nie być wizualnie widoczne, że warstwy są całkowicie pokryte, ale roztwór dysocjujący zostanie równomiernie rozłożony na powierzchni komórek. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu zwolnij dźwignię CSM, aby zablokować HYPERStack w pozycji załadunkowej. Pozostaw HYPERStack w tej pozycji przez wymagany czas dysocjacji dla Twoich komórek.
8. Po odłączeniu się komórek, kierując się mętnością, przesuń CSM do pozycji równoważenia. Należy zachować ostrożność, aby nie doprowadzić do nadmiernego trawienia komórek. Otwórz zacisk worka neutralizującego oraz zacisk rurki do obsługi cieczy HYPERStack, aby umożliwić wniknięcie pożywki neutralizującej do naczynia. Po zakończeniu przenoszenia zamknij zacisk na rurce do obsługi cieczy HYPERStack.
9. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby kołysać naczyniem na boki.
10. Za pomocą stojaka do worków obniż pozycję zestawu worka do zbioru poniżej poziomu HYPERStack. Ustaw CSM w pozycji opróżniania, otwórz zacisk rurki do obsługi cieczy naczynia i przenieś zawiesinę komórkową z powrotem do worka neutralizującego. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i odłącz zestaw worka do zbioru od naczynia za pomocą zgrzewarki do rurek. Zawiesina komórkowa jest gotowa do dalszej obróbki.

9. Reprezentatywne wyniki

• Czas zbioru komórek musi zostać zoptymalizowany przy przejściu ze standardowej powierzchni polistyrenowej na gazoprzepuszczalną powierzchnię polistyrenową. Komórki mają tendencję do szybszego odrywania się w produkcie HYPERStack.
• Aby obejrzeć komórki pod mikroskopem, należy zacisnąć zaciski na przewodach wentylacyjnych i prowadzących ciecz. Naczynie HYPERStack należy umieścić do góry dnem, z kolektorami skierowanymi w dół, na stole mikroskopu.
• Można podjąć kroki zapobiegawcze, aby uniknąć zawilgocenia filtrów podczas użytkowania, co spowodowałoby zaprzestanie ich działania. Przy zachowaniu odpowiedniego poziomu napełnienia naczynia HYPERStack oraz utrzymywaniu przewodów wentylacyjnych i odprowadzających w pozycji uniesionej przy otwartych zaciskach, nie powinno dojść do zawilgocenia.
• Nacisk zamkniętych zacisków na przewody sprawia, że pozostają one zamknięte po otwarciu zacisków. Ściśnięcie przewodu w przeciwnym kierunku spowoduje jego otwarcie.
• Czas przepływu pożywki wchodzącej i wychodzącej z naczynia HYPERStack poprzez grawitacyjne zasilanie zależy od różnicy wysokości pożywki między górnym poziomem w naczyniu HYPERStack a górnym poziomem w pojemniku z pożywką. Im większa odległość, tym szybszy przepływ. Maksymalny przepływ jest ograniczony przez wydajność filtrów do 1,5L/min.
• Utrzymanie prawidłowej objętości napełnienia w naczyniu HYPERStack zapobiegnie powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorach wzrostu komórek. Pęcherzyki powietrza mogą pojawić się w wyniku pobierania próbek lub inkubacji w środowisku nieuwilgotnionym ze względu na ewaporacyjną utratę wody. Ilość i częstotliwość pobierania próbek, a także warunki inkubacji, określą, czy użytkownik końcowy powinien dodać dodatkową ciecz.

Rysunek 1. Wyczerpanie tlenu w medium w standardowym naczyniu do hodowli komórkowej. Rysunek przedstawia spadek stężenia tlenu w mg/L na poziomie komórek w ciągu 3 dni.

Rycina 2. Gradient tlenu w medium w standardowym naczyniu do hodowli komórkowej. Rycina pokazuje, że stężenie tlenu w mg/L jest najwyższe na styku medium i przestrzeni nadpłynowej niż na poziomie warstwy komórkowej.

Rycina 3. Procentowa zawartość tlenu w przestrzeni tchawiczkowej systemu HYPERStack podczas wzrostu komórek. Rycina pokazuje, że w ciągu 96 godzin procentowa zawartość tlenu między warstwami, który zasila każde gazoprzepuszczalne dno membrany, pozostaje stała. Dowodzi to zdolności komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji.

Dyskusja

W naczyniu HYPERStack z powodzeniem hodowano komórki modyfikowane, pierwotne oraz macierzyste. Dodawanie cieczy do naczynia odbywało się poprzez aseptyczne połączenia z workami za pomocą grawitacyjnego dozowania, a także poprzez pompowanie ze sterylnego pojemnika z pożywką. Naczynie zapewnia ponad 2,5-krotny wzrost powierzchni hodowli w porównaniu do produktu z układu piętrowych płytek o tej samej objętości zajmowanej przestrzeni. Model HYPERStack-12 posiada powierzchnię hodowli 6 000cm², HYPERStack-36 posiada powierzchnię hodowli 18 000cm², a HYPERStack-120 posiada powierzchnię hodowli 60 000cm². Dzięki zwiększeniu powierzchni użytkownicy mogą uzyskać więcej komórek z tej samej populacji lub partii komórkowej i zmniejszyć zmienność. Mogą również oszczędzać miejsce i/lub nakłady pracy, używając mniejszej liczby naczyń w celu uzyskania tej samej ilości komórek, lub zwiększyć wydajność produkcji komórek bez konieczności zatrudniania dodatkowego personelu, tworzenia nowych pomieszczeń czystych czy zakupu inkubatorów. System jest produkowany metodami montażu o niskim stopniu zanieczyszczenia cząstkami i bez użycia klejów. Jest to system zamknięty, wstępnie wyposażony w zestawy rurek i filtrów, zapakowany w potrójny worek i dostarczany w formie sterylnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka w worku 1,5 L	Lonza Inc.	TBD	1350 ml pożywki + 150 ml serum (jeśli wymagane)
Pożywka w worku 4,0 L	Lonza Inc.	TBD	3600 ml pożywki + 400 ml serum (jeśli wymagane)
Naczynie HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
Naczynie HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Klin do napełniania	Corning	10040
Manipulator do stosów	Corning	TBD
Urządzenie do pobierania próbek HyQtainer Sub-Assembly	Hyclone	SH3B0324.01
Roztwór hamujący w worku 600 ml (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
Roztwór do dysocjacji komórek 600 ml	Lonza Inc.	TBD