Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Podsumowanie

Wprowadzenie do technologii, protokołu i obsługi naczyń Corning HYPERStack oraz akcesoriów wykorzystywanych do wysokowydajnej hodowli komórek adherentnych. Protokół pokaże, jak wykorzystać naczynia z zamkniętym systemem w celu zwiększenia wydajności zbioru komórek w porównaniu do obecnie stosowanych produktów w formie stosów płytek.

Streszczenie

Hodowla przylegających komórek w dużych objętościach jest obecnie standaryzowana przy użyciu produktów do wzrostu komórek w postaci stosów płytek, gdy mikronośniki nie stanowią optymalnego wyboru. Naczynia HYPERStack umożliwiają skalowanie w systemie zamkniętym w odniesieniu do obecnych produktów w formie stosów płytek i pozwalają uzyskać >2,5X więcej komórek przy zachowaniu tej samej objętości całkowitej. Naczynia HYPERStack wykorzystują materiał przepuszczalny dla gazów, który umożliwia wymianę gazową, co eliminuje potrzebę pozostawiania wewnętrznej przestrzeni nad cieczą w naczyniu. Eliminacja przestrzeni nad cieczą pozwala na zminimalizowanie komory, w której zachodzi wzrost komórek, w celu oszczędności miejsca, co umożliwia rozmieszczenie większej liczby warstw powierzchni wzrostu komórek w tej samej objętości całkowitej.

W wielu zastosowaniach, takich jak terapia komórkowa czy produkcja szczepionek, wymagany jest zamknięty system do hodowli i zbioru komórek. Pojemnik HYPERStack umożliwia dodawanie i usuwanie komórek oraz odczynników za pomocą przewodów z worków z pożywką lub innymi metodami.

Niniejszy protokół wyjaśni technologię stojącą za materiałem przepuszczalnym dla gazów zastosowanym w naczyniach HYPERStack, wyniki dyfuzji gazów w celu zaspokojenia potrzeb metabolicznych komórek, protokoły hodowli komórkowej w systemie zamkniętym oraz różne metody zbioru komórek.

Protokół

1. Naczynie HYPERStack - Podstawy technologii materiałów przepuszczalnych dla gazów

1. Naczynie HYPERStack jest wielowarstwowym naczyniem do hodowli komórek w systemie zamkniętym, w którym metabolizm komórkowy opiera się na wymianie gazowej poprzez gazoprzepuszczalną błonę polimerową o grubości 76.2micron.
2. Naczynie HYPERStack różni się od tradycyjnych naczyń do hodowli komórek tym, że nie posiada ono tzw. „przestrzeni nadfazowej” (headspace) nad komórkami wewnątrz naczynia. Zamiast utrzymywać taką przestrzeń do wymiany gazowej wewnątrz naczynia, produkty gazoprzepuszczalne posiadają przestrzenie powietrzne (zwane przestrzeniami „trachealnymi”) pod każdą komorą hodowlaną, które są otwarte na atmosferę.
3. Ta przestrzeń trachealna umożliwia równoważną wymianę gazową dla komórek rosnących w każdym przedziale hodowlanym naczynia.
4. Błona gazoprzepuszczalna pozwala na zachodzenie wymiany gazowej przy jednoczesnym utrzymaniu sterylnego środowiska. Wszystkie manipulacje płynami dla każdej z wielu warstw odbywają się poprzez pojedynczy port dostępu.

2. Podsumowanie komponentów naczynia HYPERStack

1. Stackette to poszczególna komora do hodowli komórkowej, składająca się z górnej płyty i membrany przepuszczalnej dla gazów. W tej komorze hodowane są komórki.
2. Kolektor cieczowy (Liquid Manifold) łączy każdą z 12 warstw stackette w obrębie modułu HYPERStack. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia składające się z wielokrotności 12 warstw. Kolektor umożliwia użytkownikowi wykonanie jednej manipulacji płynem dla całego naczynia.
3. Kolektor powietrzny (Air Manifold) również łączy warstwy stackette, ale służy do wypierania powietrza z naczynia podczas dodawania cieczy. Zawiera linię napełniania wykorzystywaną podczas procesu napełniania.
4. Przestrzeń tchawkowata (Tracheal Space) to otwarta przestrzeń powietrzna między każdą warstwą stackette, umożliwiająca wymianę gazową poprzez membranę przepuszczalną dla gazów każdej z warstw.
5. Rurki do manipulacji cieczami są podłączone do kolektora cieczowego i służą do wykonywania wszystkich manipulacji cieczami w systemie zamkniętym. Ten komponent może być dostosowany do indywidualnych potrzeb.
6. Rurka odpowietrzająca jest podłączona do kolektora powietrznego, zawiera filtr powietrza i służy do uwalniania nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności.
7. Rurka odprowadzająca (chase tubing) posiada filtr oraz zacisk, jest podłączona do rurek do manipulacji cieczami i służy do usunięcia cieczy z rurek do manipulacji cieczami po napełnieniu naczynia.
8. Manipulator do stosów Corning (Corning Stack Manipulator, CSM) to urządzenie pomocnicze służące do precyzyjnego rozmieszczania naczyń w odpowiednich pozycjach podczas użytkowania.
9. Klin do napełniania (Filling Wedge) to wykonany ze stali nierdzewnej element pomocniczy, stosowany podczas ręcznego napełniania naczyń HYPERStack.

3. Wyniki dyfuzji gazów przez membranę gazoprzepuszczalną stosowaną w naczyniach HYPERStack

1. W tradycyjnych systemach hodowli komórkowych z wentylowaną przestrzenią nad cieczą, poziom tlenu w medium spada średnio o 50% w ciągu 3 dni hodowli. (Rycina 1)
2. W tym samym systemie hodowli komórkowych gradient tlenowy w warstwie medium o wysokości 3 mm jest niemal o 50% większy na styku medium i przestrzeni nad cieczą niż na poziomie warstwy komórek. (Rycina 2)
3. Dyfuzja tlenu przez gazoprzepuszczalną błonę polistyrenową o grubości 76,2 micron jest równoważna dyfuzji przez 2,6 mm medium. Gazoprzepuszczalna błona zastosowana w naczyniach HYPERStack umożliwia wymianę gazową bezpośrednio na poziomie warstwy komórek.
4. Procentowa zawartość tlenu w przestrzeni tchawicowej naczyń HYPERStack pozostaje stała w miarę wzrostu komórek do osiągnięcia konfluencji. (Rycina 3)

4. Przygotowanie worka z pożywką

1. Naczynie HYPERStack-12 warstw przyjmuje 1,3L medium, a naczynie HYPERStack-36 warstw przyjmuje 3,9L medium.
2. Przed zaszczepieniem medium w worku, w przypadku stosowania surowicy, należy zespawać worek z surowicą z workiem z medium i dokładnie wymieszać.
3. Odciąć za pomocą dużych zacisków do worków około 30 mL medium w worku. Zapewni to wykorzystanie wszystkich zaszczepionych komórek podczas napełniania i zapobiegnie ich pozostawaniu w worku z medium. Umieścić worek z medium na stojaku.

5. Pożywki do inokulacji

1. Napełnić strzykawkę z dołączonym przewodem zawiesiną komórkową. Połączyć za pomocą spawania rurek przewód 3/16" od strzykawki zawierającej zawiesinę komórkową z workiem z medium.
2. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do worka z medium i dokładnie wymieszać.

6. Procedura napełniania

1. Zespawaj rurką worek z zaszczepionym medium do przewodów do obsługi cieczy 3/8" w naczyniu HYPERStack. (Używając Sterile Connects lub złączy wielozadaniowych (MPC), można również podłączyć worek z medium do naczynia).
2. Zamknij zaciski na przewodach do obsługi cieczy oraz przewodach przepłukujących w systemie HYPERStack.
3. Umieść 36-warstwowe naczynie HYPERStack w CSM w pozycji załadunkowej; zatrzaśnij rurkę filtra odpowietrzającego w uchwycie mocującym w CSM. Dokręć pokrywę i przesuń CSM do pozycji napełniania. Dzięki ustawieniu naczynia w odpowiedniej pozycji napełniania, filtr powietrza znajduje się teraz w najwyższym punkcie, aby zapobiec jego zamoczeniu podczas procesu napełniania. Kąt 10° umożliwia wyrównanie poziomu cieczy w warstwach podczas napełniania. 12-warstwowe naczynie HYPERStack ułożone na boku na klinie do napełniania znajduje się w odpowiedniej pozycji do napełniania.
4. Usuń powietrze z linii napełniającej, ustawiając worek na tym samym poziomie co naczynie HYPERStack (nie wyżej). Pozostawiając zamknięty zacisk przewodu przepłukującego, otwórz zacisk przewodu do obsługi cieczy oraz zacisk worka z medium, aby umożliwić dopływ płynu do naczynia.
5. Używając statywu na worek, podnieś worek z medium, aby wspomóc przepływ zawiesiny komórkowej do naczynia.
6. Napełniaj naczynie, aż całe zaszczepione medium wpłynie do środka; w górnej części worka z medium powinno pozostać jeszcze 300 mL medium. Zdejmij zacisk z worka z medium, aby kontynuować napełnianie naczynia. Gdy ciecz zbliży się do górnego kolektora powietrznego, zmniejsz prędkość napełniania poprzez obniżenie worka z medium, aby zapobiec przepełnieniu. Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i zaciśnij przewód do obsługi cieczy.

7. Procedura izolacji w celu zablokowania cieczy w warstwach

1. Przenieś naczynie HYPERStack w module CSM do pozycji izolacji, tak aby oba zestawy kolektorów znajdowały się w najwyższym położeniu, a następnie obniż worek z pożywką poniżej wysokości naczynia. Naczynie HYPERStack-12 layer można podnieść do pozycji izolacji, kładąc jedną rękę na boku naczynia i używając drugiej do uniesienia klina wypełniającego.
2. Trzymając filtr przepłukujący w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki przepłukującej. Spowoduje to opróżnienie lub przepłukanie pożywki z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka z pożywką. Po opróżnieniu rurki zamknij zacisk na rurce worka z pożywką.
3. Trzymając filtr rurki przepłukującej w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki do obsługi cieczy w urządzeniu HYPERStack, aby pozostała ciecz mogła wpłynąć i wyrównać się w naczyniu. Odczekaj 1-2 minuty, aż proces ten zostanie zakończony.
4. Obróć naczynie HYPERStack w module CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Obniż naczynie do pozycji załadunkowej w module CSM. Lekkie przechylenie naczynia HYPERStack-12 layer w lewo umożliwi wyjęcie klina wypełniającego. Zamknij zaciski na rurce przepłukującej oraz rurce do obsługi cieczy.
5. Worek z pożywką można teraz odłączyć od naczynia lub pozostawić podłączonym do późniejszego użycia podczas procedury zbioru. Aby przechować podłączony worek z pożywką, zwiń pusty worek wraz z pozostałą w nim pożywką i umieść go pod taśmami mocującymi w tacy do przechowywania naczynia HYPERStack.
6. Przenieś naczynie HYPERStack do inkubatora. Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby ciecz nie dostała się do filtra odpowietrzającego. Osiąga się to poprzez lekkie nachylenie końca z kolektorem urządzenia HYPERStack do góry.

8. Protokół zbioru

1. Aby rozpocząć procedurę zbioru, należy zespawać rurki roztworu do dysocjacji komórek i worków z medium hamującym, tworząc zestaw worków do zbioru. Upewnij się, że wszystkie zaciski rurek są zamknięte. (Użyj schematu do demonstracji)
2. Wyjmij naczynie HYPERStack z inkubatora, zwolnij worek z medium spod pasów mocujących i powieś go na stojaku na worki. Umieść naczynie w CSM w pozycji załadunkowej i mocno dokręć pokrywę, aby zabezpieczyć naczynie. Zaczep rurkę odpowietrzającą w uchwycie mocującym i przesuń CSM do pozycji napełniania.
3. Upewniając się, że worek z medium na stojaku wisi niżej niż HYPERStack, otwórz zacisk na rurce worka z medium oraz zacisk rurki do prowadzenia cieczy naczynia, aby umożliwić przepływ medium do podłączonego worka.
4. Gdy naczynie będzie puste w około ¾, zmień ustawienia CSM na końcową pozycję opróżniania. Gdy naczynie HYPERStack i rurka do prowadzenia cieczy będą puste, unieś rurkę, aby przepchnąć medium poza zacisk na rurce worka z zużytym medium, a następnie zamknij zarówno zacisk rurki do prowadzenia cieczy, jak i zacisk rurki worka z zużytym medium.
5. Zastąp worek z zużytym medium zestawem worków do zbioru za pomocą spawania rurek i podnieś zestaw worków z roztworem do dysocjacji komórek powyżej poziomu HYPERStack, korzystając ze stojaka na worki.
6. Umieść CSM w pozycji wyrównywania. Otwórz zacisk rurki z roztworem do dysocjacji komórek i przenieś roztwór do HYPERStack. Po zakończeniu transferu zamknij zaciski na rurce do prowadzenia cieczy i rurce z roztworem do dysocjacji komórek.
7. Przesuń CSM do pozycji załadunkowej. Trzymając otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego, delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek. Podczas kołysania naczynie może być okresowo przywracane do pozycji wyrównywania, aby utrzymać równomierny rozkład roztworu. Wizualnie może nie być widać, że warstwy są całkowicie pokryte, ale roztwór dysocjujący zostanie równomiernie rozprowadzony po powierzchni komórek. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu zwolnij dźwignię CSM, aby zablokować HYPERStack w pozycji załadunkowej. Pozostaw HYPERStack w tej pozycji przez wymagany czas dysocjacji dla Twoich komórek.
8. Po odłączeniu się komórek, kierując się mętnością, przesuń CSM do pozycji wyrównywania. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej dysocjacji komórek. Otwórz zacisk worka z medium hamującym oraz zacisk rurki do prowadzenia cieczy HYPERStack, aby umożliwić wniknięcie medium hamującego do naczynia. Po zakończeniu transferu zamknij zacisk rurki do prowadzenia cieczy HYPERStack.
9. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby kołysać naczyniem na boki.
10. Korzystając ze stojaka na worki, obniż pozycję zestawu worków do zbioru poniżej poziomu HYPERStack. Ustaw CSM w pozycji opróżniania, otwórz zacisk rurki do prowadzenia cieczy naczynia i przenieś zawiesinę komórkową z powrotem do worka z medium hamującym. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i odłącz zestaw worków do zbioru od naczynia za pomocą zgrzewarki do rurek. Zawiesina komórkowa jest gotowa do dalszej obróbki.

9. Reprezentatywne wyniki

• Przy przejściu ze standardowej powierzchni polistyrenowej na powierzchnię polistyrenową przepuszczającą gazy należy zoptymalizować czas zbioru komórek. Komórki mają tendencję do szybszego odrywania się w produkcie HYPERStack.
• Aby obejrzeć komórki pod mikroskopem, należy zacisnąć rurki odpowietrzające i rurki do obsługi cieczy. Naczynie HYPERStack należy umieścić na stoliku mikroskopu dnem do góry, tak aby kolektory były skierowane w dół.
• Można podjąć kroki zapobiegawcze, aby uniknąć zamoczenia filtrów podczas użytkowania, co spowodowałoby zaprzestanie ich funkcjonowania. Unikając przepełnienia naczynia HYPERStack i utrzymując rurkę odpowietrzającą oraz rurkę odprowadzającą w pozycji uniesionej przy otwartych zaciskach, nie powinno dojść do zamoczenia.
• Nacisk zamkniętych zacisków na rurkę powoduje, że pozostaje ona zamknięta nawet po otwarciu zacisków. Ściśnięcie rurki w przeciwnym kierunku spowoduje jej otwarcie.
• Czas przepływu medium wchodzącego i wychodzącego z naczynia HYPERStack poprzez dopływ grawitacyjny zależy od różnicy wysokości medium między górnym poziomem medium w naczyniu HYPERStack a górnym poziomem medium w pojemniku z medium. Im większa odległość, tym szybszy przepływ. Maksymalny przepływ jest ograniczony przez wydajność filtrów do 1,5L/min.
• Utrzymanie prawidłowej objętości napełnienia w naczyniu HYPERStack zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorach wzrostu komórek. Pęcherzyki powietrza mogą pojawić się w wyniku pobierania próbek lub inkubacji w środowisku nieuwilgotnionym z powodu ewaporacyjnej utraty wody. Ilość i częstotliwość pobierania próbek, a także warunki inkubacji, określą, czy użytkownik końcowy powinien dodać dodatkową ciecz.

Rycina 1. Wyczerpanie tlenu w pożywce w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych. Rycina przedstawia spadek stężenia tlenu w mg/L na poziomie komórek w ciągu 3 dni.

Rysunek 2. Gradient tlenu w medium w standardowym naczyniu do hodowli komórkowej. Rycina przedstawia, że stężenie tlenu w mg/L jest najwyższe na styku medium i przestrzeni nad cieczą niż na warstwie komórkowej.

Rycina 3. Procent zawartości tlenu w przestrzeni tchawiczkowej układu HYPERStack podczas wzrostu komórek. Rysunek pokazuje, że w ciągu 96 godzin procent tlenu pomiędzy warstwami, który zasila każde przepuszczalne dla gazów dno, pozostaje stały. Dowodzi to zdolności komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji.

Dyskusja

W naczyniu HYPERStack z powodzeniem hodowano komórki modyfikowane, pierwotne oraz macierzyste. Dodawanie cieczy do naczynia odbywało się poprzez aseptyczne połączenia z workami za pomocą grawitacyjnego dozowania, a także poprzez pompowanie ze sterylnego pojemnika z pożywką. Naczynie zapewnia ponad 2,5-krotny wzrost powierzchni hodowli w porównaniu do produktu z układu piętrowych płytek o tej samej objętości zajmowanej przestrzeni. Model HYPERStack-12 posiada powierzchnię hodowli 6 000cm², HYPERStack-36 posiada powierzchnię hodowli 18 000cm², a HYPERStack-120 posiada powierzchnię hodowli 60 000cm². Dzięki zwiększeniu powierzchni użytkownicy mogą uzyskać więcej komórek z tej samej populacji lub partii komórkowej i zmniejszyć zmienność. Mogą również oszczędzać miejsce i/lub nakłady pracy, używając mniejszej liczby naczyń w celu uzyskania tej samej ilości komórek, lub zwiększyć wydajność produkcji komórek bez konieczności zatrudniania dodatkowego personelu, tworzenia nowych pomieszczeń czystych czy zakupu inkubatorów. System jest produkowany metodami montażu o niskim stopniu zanieczyszczenia cząstkami i bez użycia klejów. Jest to system zamknięty, wstępnie wyposażony w zestawy rurek i filtrów, zapakowany w potrójny worek i dostarczany w formie sterylnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka w worku 1,5 L	Lonza Inc.	TBD	1350 ml pożywki + 150 ml serum (jeśli wymagane)
Pożywka w worku 4,0 L	Lonza Inc.	TBD	3600 ml pożywki + 400 ml serum (jeśli wymagane)
Naczynie HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
Naczynie HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Klin do napełniania	Corning	10040
Manipulator do stosów	Corning	TBD
Urządzenie do pobierania próbek HyQtainer Sub-Assembly	Hyclone	SH3B0324.01
Roztwór hamujący w worku 600 ml (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
Roztwór do dysocjacji komórek 600 ml	Lonza Inc.	TBD