Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Podsumowanie

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Streszczenie

Postępy w metodach genetycznych umożliwiły badanie genów zaangażowanych w ludzkie choroby neurodegeneracyjne z wykorzystaniem Drosophila jako systemu modelowego¹. Większość tych schorzeń, w tym choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, charakteryzuje się zależnym od wieku pogorszeniem funkcji uczenia się, pamięci oraz koordynacji ruchowej². W niniejszej pracy wykorzystujemy testy behawioralne, w tym test negatywnej geotaksji³ oraz test supresji awersyjnej fototaksji (test APS)^4,5, aby wykazać, że niektóre cechy behawioralne związane z ludzką neurodegeneracją mogą być odtworzone u muszek. W teście negatywnej geotaksji wykorzystuje się naturalną tendencję muszek do poruszania się przeciwko grawitacji pod wpływem pobudzenia, aby badać geny lub warunki, które mogą upośledzać sprawność lokomocyjną. W teście APS badane są funkcje uczenia się i pamięci u muszek wykazujących fototaksję dodatnią, które zostały przeszkolone, aby kojarzyć światło z awersyjnym gorzkim smakiem, a w konsekwencji unikać tej naturalnej tendencji do ruchu w stronę światła. Testowanie tych przeszkolonych muszek 6 godzin po treningu służy do oceny funkcji pamięci. Dzięki zastosowaniu tych testów można w łatwy sposób badać wpływ czynników genetycznych lub środowiskowych na rozwój neurodegeneracji u muszek.

Protokół

1. Wprowadzenie

W tym filmie zaprezentujemy dwa testy behawioralne z wykorzystaniem Drosophila, aby zademonstrować pomiar lokomocji oraz funkcji uczenia się i pamięci, które są zaburzone w chorobach neurodegeneracyjnych. Po pierwsze, pokażemy, jak mierzyć zachowania lokomotoryczne za pomocą testu negatywnej geotaksji. Po drugie, ocenimy zdolności uczenia się i pamięci u much wykazujących dodatnią fototaksję, które zostaną wytrenowane w kojarzeniu światła z awersyjnym gorzkim smakiem, a następnie poddane testom po 6 godzinach w celu oceny funkcji pamięci. Na koniec omówimy znaczenie i ograniczenia tych testów behawioralnych.

2. Sprzęt i odczynniki

1. Praca z muszkami
   • Stereomikroskop (Zeiss)
   • Małe pędzle malarskie do przesuwania muszek
   • Aparat do narkozy Drosophila dwutlenkiem węgla (CO₂) (Geneseesci, Inc)
2. Test negatywnej geotaksji
   • Fiolka polistyrenowa 28,5 x 95 mm (Capitol Vial, Inc.)
   • Miniaturowy timer z alarmem/stoper (VWR International)
   • Pisaki Sharpie
   • Taśma klejąca
3. Test supresji awersyjnej fototaksji
   • Wodorochlorek chininy (Sigma Aldrich; numer CAS: 619-47-7)
   • Woda destylowana
   • Cyfrowa waga pomiarowa do precyzyjnego rozcieńczania wagowego
   • Szybkozłączki, polietylen o wysokiej gęstości (NALGENE VWR nr katalogowy 62868-021)
   • Probówka do wirowania 15 mL (VWR International), odcięta na poziomie 2 mL od zamkniętego końca, aby pasowała do adaptera szybkozłączki źródła światła
   • Jednokanałowa pipeta 20 μL do nakładania roztworu chininy na papier filtracyjny wyściełający komorę
   • Labirynt T-Maze (Simple Behavioral Systems; Rysunek 1)
   • Folia aluminiowa
   • Źródło światła (Zeiss)
   • Lampa z czerwonym światłem
   • Papier filtracyjny
   • Miniaturowy timer z alarmem/stoper (VWR International)

3. Przygotowanie much

• Muchy są hodowane na standardowej pożywce kukurydziano-agarowej z melasą i drożdżami w temperaturze 25°C przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
• Dziewicze muchy są izolowane pod narkozą dwutlenkiem węgla w dniu ekluzji. W badaniach starzenia muchy są utrzymywane w grupach po dwadzieścia osobników w jednej fiolce i przenoszone do nowej fiolki co 3 dni. W badaniach starzenia ważne jest użycie rodzeństwa z tego samego krzyżowania rodzicielskiego, aby zminimalizować różnice wynikające z tła genetycznego.
• W obu testach muchy są segregowane według płci i utrzymywane w grupach po dziesięć osobników w jednej fiolce. Różnice między płciami w zachowaniu są istotne, dlatego nie zaleca się mieszania samców i samic w jednym badaniu, gdyż mogłoby to utrudnić interpretację i reprodukcję danych⁶.
• W teście negatywnej geotaksji muchy są dzielone na grupy po dziesięć osobników na fiolkę i badane godzinę po narkozie. Ważne jest, aby muchy całkowicie doszły do siebie po narkozie, ponieważ może ona wpływać na aktywność lokomotoryczną.
• W teście APS muchy z każdej grupy są umieszczane w pustej polistyrenowej fiolce z nawilżonym wodą papierem filtracyjnym na sześć godzin przed wykonaniem testu. Zapewnia to głodówkę much przed badaniem, dzięki czemu będą one bardziej wrażliwe na awersyjny smak. Bezpośrednio przed wykonaniem testu każda mucha z dziesięcioosobowej grupy jest umieszczana w pustej probówce odwirnikowej o pojemności 15mL, która następnie jest lekko zakręcona, aby zapobiec ucieczce.

4. Test negatywnej geotaksji

• Geotaksis mierzy się zazwyczaj dla od dziesięciu do dwudziestu grup po dziesięć osobników tego samego genotypu lub wariantu traktowania (łącznie 10–20 much dla każdego genotypu/wariantu traktowania)⁷. Posortuj grupy po dziesięć samic lub samców much przy użyciu aparatury do znieczulania CO₂ i umieść każdą grupę w oddzielnej fiolce. Odczekaj co najmniej jedną godzinę, aby muchy dojdzieli się z narkozy.
• Przygotuj aparat do wspinania się dla każdej grupy w taki sposób, aby dwie puste fiolki polistyrenowe były połączone pionowo taśmą, przylegać do siebie otworami. Ważne jest, aby otwory fiolek były idealnie wyrównane, co zapewni równą powierzchnię wspinania dla much.
• W przypadku dolnej fiolki odmierz odległość pionową 8 cm od dna i zaznacz każdą fiolkę, rysując okrąg wokół całego jej obwodu.
• Przenieś grupę dziesięciu much do dolnej fiolki, uważając, aby żadna mucha nie uciekła. Natychmiast przykryj dolną fiolkę górną i zabezpiecz ją mocno taśmą w pobliżu stykających się otworów. Pozwól muchom zaadaptować się do nowych warunków przez 1 minutę przed przeprowadzeniem testu.
• Delikatnie opukaj ścianki fiolki, aby muchy opadły na dno, a następnie policz liczbę much, które zdołają wspiąć się powyżej zaznaczenia 8 cm w ciągu 10 sekund od opukania.
• Powtórz ten test dla tej samej grupy dziesięć razy, zachowując 1 minutę przerwy między każdą próbą.
• Zapisz liczbę much w grupie, które przekroczyły markę 8 cm, jako procent całkowitej liczby much.

5. Test supresji awersyjnej fototaksji (test APS)

Pierwotnie opracowany na podstawie pracy Le Bourga i Buechera (202)⁴, test ten wykorzystuje pozytywny fototaksis u much, aby nauczyć je kojarzenia światła z bodźcami awersyjnymi (w tym przypadku gorzkiego smaku chininy). Po fazie treningu/warunkowania muchy typu dzikiego będą w stanie powiązać oświetlony obszar z awersyjnym smakiem i zaczną go unikać. Muchy z upośledzonymi zdolnościami uczenia się nie będą w stanie stworzyć tego powiązania. Co więcej, test APS może być również wykorzystywany do pomiaru funkcji pamięci krótkotrwałej u much⁵ poprzez poddanie wcześniej wytrenowanych owadów temu samemu badaniu 6 godzin po warunkowaniu, aby sprawdzić ich zdolność do zapamiętania wyuczonego zadania.

1. Przygotowanie roztworu chininy
   • Rozpuścić chlorowodorek chininy w wodzie destylowanej, aby przygotować 0,1M roztwór zapasowy (1,98g w 50mL wody destylowanej). Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze -20°C do roku w małych alikwotach.
   • Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 μM poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w wodzie destylowanej.
2. Przygotowanie labiryntu T
   • Labirynt T składa się z kolumny centralnej z zapadnią oraz dwóch niezależnych komór: komory „ciemnej” i komory „oświetlonej” (Rycina 1).
   • Przygotowanie komór: wziąć dwie plastikowe probówki do wirowania o pojemności 15mL i odciąć końcówkę od dołu (zamkniętego końca) na wysokości 2 mL za pomocą piłki ręcznej. Zamontować adaptery łączące na obu końcach i uszczelnić połączenie parafilmem. Adapter na końcu probówki służy jako gniazdo dla elastycznego źródła światła. Połączyć jedną probówkę ze źródłem światła – ta probówka będzie komorą „oświetloną”. Pozostałą probówkę owinąć folią aluminiową, aby służyła jako komora „ciemna”.
   • Nanieść 180uL wody destylowanej lub roztworu chininy na papier filtracyjny i umieścić go w komorze oświetlonej.
   • Złożyć labirynt T, przykręcając komorę oświetloną i ciemną po obu stronach kolumny centralnej, przy zamkniętej zapadni znajdującej się w środku (Rycina 1).
   • Włożyć źródło światła do komory oświetlonej.
3. Trenowanie muszek w celu tłumienia fototaksji za pomocą bodźców awersyjnych
   • Odkręcić komorę ciemną od labiryntu T, przenieść pojedynczą muszkę do tej komory i niezwłocznie przykręcić probówkę ciemną z powrotem do labiryntu.
   • Wyłączyć światła w pomieszczeniu i zapalić lampę czerwoną.
   • Pozwolić muszce zaaklimatyzować się w komorze ciemnej przez 30 sekund, a następnie powoli włączyć źródło światła oświetlające komorę oświetloną. Powoli otworzyć zapadnię oddzielającą obie komory.
   • Jeśli muszka przejdzie do komory oświetlonej w ciągu 10 sekund, uznaje się ją za wykazującą fototaksję dodatnią i jest ona gotowa do treningu w badaniu. Brak fototaksji wskazuje na problemy z systemem wzrokowym; muszki wykazujące fototaksję ujemną powinny zostać wykluczone z badania.
   • W celu przeprowadzenia treningu tłumienia fototaksji awersyjnej (APS) należy delikatnie zapędzić muszkę wykazującą fototaksję dodatnią z powrotem do komory ciemnej, zamknąć zapadnię i wyłączyć światło. Pozostawić 30 sekund na aklimatyzację. W tym czasie umieścić w komorze oświetlonej papier filtracyjny z roztworem chininy. Powoli otworzyć zapadnię i włączyć światło. Pozwolić muszce wejść do oświetlonej komory pokrytej chininą. Po jednej minucie zapędzić muszkę z powrotem do komory ciemnej i powtórzyć tę czynność jeszcze 9 razy. (Zazwyczaj muszki typu dzikiego unikają komory oświetlonej po 3 do 5 próbach treningowych).
   • Bezpośrednio po treningu przeprowadzić pięć prób testowych. W każdej próbie testowej, po włączeniu światła, dać wyszkolonej muszce 10 sekund na przejście do komory oświetlonej. Brak wejścia do oświetlonej probówki zostanie zapisany jako „Pass” (sukces), co jest równoważne z „zadaniem opanowanym poprzez wzmocnienie”. Wskaźnik sukcesów w pięciu kolejnych próbach zostaje zapisany i przedstawiony poniżej na Rycynie 2 jako PC0 (0 h po warunkowaniu).
4. Ocena funkcji pamięci krótkotrwałej u muszek
   • Po treningu i początkowych pomiarach PC0 każda muszka zostaje przeniesiona z powrotem do swojej pierwotnej probówki z pożywką i odstawiona na sześć godzin.
   • Sześć godzin po treningu poddać każdą muszkę ponownie 5 próbom w ten sam sposób co wcześniej i zapisać liczbę razy, gdy muszka unika (pass) lub wchodzi do (fail) oświetlonej probówki. Wskaźnik sukcesów ten zostaje zapisany jako PC6 (6 h po warunkowaniu), co stanowi wskaźnik pamięci krótkotrwałej.

6. Interpretacja danych i analiza statystyczna

1. Test negatywnego geotaksji
   • Surowe dane uzyskane z tego testu reprezentują liczbę much przekraczających znacznik 8 cm w ciągu 10 sekund w każdej grupie. Przelicz tę wartość na procenty i oblicz średni wskaźnik przejść dla każdej grupy w ciągu 10 sesji.
   • Dane są przedstawione graficznie jako średni wskaźnik przejść na grupę (genotyp, traktowanie itp.) wraz ze standardowym błędem średniej (SEM).
   • Różnice między grupami mogą być następnie określone jako statystycznie istotne lub nieistotne przy użyciu testu t-Studenta lub analizy ANOVA.
2. Test supresji awersyjnej fototaksji
   • Surowe dane z tego testu reprezentowane są jako liczba razy, gdy każda mucha unika oświetlonej komory w pięciu kolejnych próbach. Wskaźnik przejść oblicza się jako procent udanych prób unikania w stosunku do całkowitej liczby prób. W ten sposób oblicz średni wskaźnik przejść dla minimum 15 much na grupę.
   • Dane są przedstawione graficznie jako średni wskaźnik przejść PC0 (bezpośrednio po warunkowaniu; wskaźnik „uczenia się”) lub średni wskaźnik przejść PC6 (6 godzin po warunkowaniu; wskaźnik „pamięci”) wraz z odpowiednim SEM.
   • Wskaźniki uczenia się i pamięci są odpowiednio porównywane między grupami, obejmując zarówno typy dzikie, jak i grupy „genetycznie zmodyfikowane-obojętne” (takie jak muchy z nadekspresją GFP).

7. Reprezentatywne wyniki

W tym eksperymencie wideo oceniamy deficyty uczenia się, pamięci i funkcji motorycznych u much z nadekspresją ludzkiego białka Tau w ośrodkowym układzie nerwowym oraz porównujemy ich wyniki z wynikami much z nadekspresją GFP. Wykazano, że neuronalna nadekspresja ludzkiego białka Tau u Drosophila powoduje silną wakulizację w mózgu⁸ i prowadzi do znacznych deficytów funkcji uczenia się i pamięci⁹. Jak pokazano na Rysunku 2A, 10-dniowe samce lub samice much z nadekspresją ludzkiego białka Tau wykazują znaczne deficyty lokomocyjne w porównaniu z grupą kontrolną much w tym samym wieku z nadekspresją GFP. Ponadto muchy te nie potrafiły powiązać światła z gorzkim smakiem, co obrazuje wskaźnik przejść PC0 w porównaniu z grupą kontrolną, a także nie potrafiły zapamiętać tego powiązania, co wykazuje spadek wskaźnika przejść PC6 (Rysunek 2B). Niniejszy eksperyment stanowi dalszą walidację możliwości wykorzystania modeli Drosophila do badania ludzkich schorzeń neurodegeneracyjnych oraz odtwarzania niektórych fenotypów behawioralnych obserwowanych u ludzi i ssaków.

Rysunek 1. Układ labiryntu w kształcie litery T do testu supresji awersyjnej fototaksji. A. Ogólny układ eksperymentalny dla eksperymentu APSA ze źródłem światła podłączonym do „oświetlonej” probówki typu falcon, wyłożonej papierem filtracyjnym, oraz probówki „ciemnej” po lewej stronie (owiniętej folią), oddzielonych zapadką. B. Podczas fazy treningu i testowania mucha znajduje się w ciemnej komorze, a zapadka zostaje otwarta po włączeniu światła w komorze oświetlonej.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki eksperymentu z zakresu negatywnego geotaksis i APS z wykorzystaniem much z nadekspresją GFP lub Tau pod kontrolą pan-neuronalnego drivera. A. W teście negatywnego geotaksji 10-dniowe muchy samce (niebieska kolumna) lub samice (czerwona kolumna) z nadekspresją GFP wykazały wyższą aktywność wspinania się niż muchy z nadekspresją Tau. B. 20-dniowe muchy samice z nadekspresją GFP wykazały lepsze funkcje uczenia się (PC0) i pamięci (PC6) niż muchy z nadekspresją Tau.

Dyskusja

Zarówno testy negatywnej geotaksji, jak i testy APS są solidnymi badaniami behawioralnymi służącymi do pomiaru zmian w zdolnościach lokomozyjnych lub w zakresie uczenia się i pamięci, wynikających z manipulacji genetycznych lub środowiskowych. Istnieją jednak pewne niedogodności związane z tymi testami, które wymagają dalszej optymalizacji.

W teście ujemnego geotaksji mutacje w określonych genach mogą powodować poważne zaburzenia motoryczne u much. W takich przypadkach muchy z trudnością wspinają się po ściankach w odpowiedzi na grawitację po pobudzeniu. Odpowiedniejsze mogą okazać się inne testy behawioralne bezpośrednio mierzące ruch. Testy te obejmują badanie odruchu prostowania, który mierzy paraliż i drgawki¹⁰, oraz badanie zachowania optomotorycznego¹¹, które rejestruje utratę koordynacji ruchowej.

W teście APS pierwszą przeszkodą mogą być muchy, które przypadkowo zatrzymują się przy wejściu do oświetlonej komory, nie przesuwając się naprzód. Staje się to bardziej problematyczne, jeśli jednym z badanych czynników jest starzenie, ponieważ starsze muchy są ogólnie mniej aktywne i mają tendencję do zatrzymywania się i odpoczywania przez dłuższy czas. W takim przypadku eksperymentator musi zastosować bodźce mechaniczne w celu pobudzenia do ruchu, co nie zawsze okazuje się skuteczne. Po drugie, można by argumentować, że brak wejścia do oświetlonej komory wynika z utraty dodatniej fototaksji. Rzadko jest to jednak przypadkiem, gdyż wcześniejsze prace wykazały, że muchy odzyskują reaktywność na światło po usunięciu negatywnego wzmocnienia⁴. Po trzecie, czas kontaktu z bodźcem awersyjnym może się różnić między poszczególnymi próbami. Zróżnicowanie to można zazwyczaj zredukować, wyściełając wewnętrzną ścianę komory nasączonym papierem filtracyjnym, aby zapobiec unikaniu przez muchy chininy. Dodatkowo eksperymentator może upewnić się, że każda mucha spędza wystarczająco dużo czasu w kontakcie z papierem filtracyjnym, wydłużając czas przebywania w komorze ponad standardową 1 minutę.

Podsumowując, testy negatywnej geotaksji oraz APS są szybkimi i prostymi sposobami oceny deficytów behawioralnych i ilościowo wskazują na zdolności lokomotoryczne oraz funkcje uczenia się i pamięci u Drosophila. Testy te są szczególnie przydatne w modelowaniu ludzkich schorzeń neurodegeneracyjnych u Drosophila.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka polistyrenowa	Capitol Vial, Inc.	28Fly	Probówka polistyrenowa 28,5 x 95 mm; ważna jest jakość materiału, zbyt śliska powierzchnia uniemożliwi muszkom wspinaczkę.
Stereomikroskop do mikrodissekcji	Carl Zeiss, Inc.	000000-1432-979	Przewód światłowodowy z dwoma ramionami w kształcie gęsiej szyi (12V/30W)
Wodorochlorek chininy	Sigma-Aldrich	6119-47-7	Rozpuścić w wodzie destylowanej.
Szybkozłącza	Nalge Nunc international	62868-021	Polietylen o wysokiej gęstości
Labirynt w kształcie litery T	Simple Behavioral Systems
Jednokanałowa pipeta 200 μL	Eppendorf	022443305