Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Podsumowanie

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Streszczenie

Postępy w metodach genetycznych umożliwiły badanie genów zaangażowanych w ludzkie choroby neurodegeneracyjne z wykorzystaniem Drosophila jako systemu modelowego¹. Większość tych schorzeń, w tym choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, charakteryzuje się zależnym od wieku pogorszeniem funkcji uczenia się, pamięci oraz koordynacji ruchowej². W niniejszej pracy wykorzystujemy testy behawioralne, w tym test negatywnej geotaksji³ oraz test supresji awersyjnej fototaksji (test APS)^4,5, aby wykazać, że niektóre cechy behawioralne związane z ludzką neurodegeneracją mogą być odtworzone u muszek. W teście negatywnej geotaksji wykorzystuje się naturalną tendencję muszek do poruszania się przeciwko grawitacji pod wpływem pobudzenia, aby badać geny lub warunki, które mogą upośledzać sprawność lokomocyjną. W teście APS badane są funkcje uczenia się i pamięci u muszek wykazujących fototaksję dodatnią, które zostały przeszkolone, aby kojarzyć światło z awersyjnym gorzkim smakiem, a w konsekwencji unikać tej naturalnej tendencji do ruchu w stronę światła. Testowanie tych przeszkolonych muszek 6 godzin po treningu służy do oceny funkcji pamięci. Dzięki zastosowaniu tych testów można w łatwy sposób badać wpływ czynników genetycznych lub środowiskowych na rozwój neurodegeneracji u muszek.

Protokół

1. Wstęp

W tym filmie zaprezentujemy dwa testy behawioralne z użyciem Drosophila, aby zademonstrować pomiar lokomocji oraz funkcji uczenia się i pamięci, które są upośledzone w zaburzeniach neurodegeneracyjnych. Po pierwsze, pokażemy, jak można mierzyć zachowanie lokomotoryczne za pomocą testu negatywnej geotaksji. Po drugie, ocenimy zdolności uczenia się i pamięci u much wykazujących fototaksję dodatnią, które zostaną wyszkolone w kojarzeniu światła z awersyjnym gorzkim smakiem, a następnie poddane badaniu po 6 godzinach w celu oceny funkcji pamięci. Na koniec omówimy znaczenie i ograniczenia tych testów behawioralnych.

2. Sprzęt i odczynniki

1. Praca z muszkami
   • Stereomikroskop (Zeiss)
   • Małe pędzle malarskie do przesuwania muszek
   • Aparat do narkozy dwutlenkiem węgla (CO₂) dla Drosophila (Geneseesci, Inc)
2. Test negatywnej geotaksji
   • Fiolka polistyrenowa 28,5 x 95 mm (Capitol Vial, Inc.)
   • Miniaturowy timer z alarmem/stoper (VWR International)
   • Pisaki Sharpie
   • Taśma klejąca
3. Test supresji awersyjnej fototaksji
   • Chlorowodorek chininy (Sigma Aldrich; numer CAS: 6119-47-7)
   • Woda destylowana
   • Cyfrowa waga analityczna do precyzyjnego rozcieńczania wagowego
   • Szybkozłączki, polietylen o wysokiej gęstości (NALGENE VWR nr katalogowy 62868-021)
   • Probówka do wirowania 15 mL (VWR International), odcięta na poziomie 2 mL od zamkniętego końca, aby pasowała do adaptera szybkozłączki dla źródła światła
   • Pipeta jednokanałowa 200 μL do nakładania roztworu chininy na papier filtracyjny wyścielający komorę
   • Labirynt w kształcie litery T (Simple Behavioral Systems; Rysunek 1)
   • Folia aluminiowa
   • Źródło światła (Zeiss)
   • Lampa ze światłem czerwonym
   • Papier filtracyjny
   • Miniaturowy timer z alarmem/stoper (VWR International)

3. Przygotowanie much

• Muchy są hodowane na standardowej pożywce kukurydziano-agarowej z melasą i drożdżami w temperaturze 25°C, przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności.
• Dziewicze muchy są izolowane pod narkozą dwutlenkiem węgla w dniu wyklucia. W badaniach starzenia muchy są utrzymywane w grupach po dwadzieścia osobników w jednej fiolce i przenoszone do nowej fiolki co 3 dni. W badaniach starzenia ważne jest stosowanie rodzeństwa z tego samego krzyżowania rodzicielskiego, aby zminimalizować różnice wynikające z tła genetycznego.
• W obu testach muchy są rozdzielane według płci i utrzymywane w grupach po dziesięć osobników na fiolkę. Różnice płciowe w zachowaniu są istotne, dlatego zaleca się, aby nie mieszać samców i samic w jednym badaniu, ponieważ dane mogłyby być trudne do interpretacji i powtórzenia⁶.
• W teście negatywnej geotaksji muchy są sortowane w grupy po dziesięć osobników na fiolkę i badane godzinę po narkozie. Ważne jest, aby muchy całkowicie doszły do siebie po narkozie, gdyż może ona wpływać na aktywność lokomotoryczną.
• W teście APS muchy z każdej grupy są umieszczane na sześć godzin przed wykonaniem testu w pustej fiolce polistyrenowej z nawilżonym wodą papierem filtracyjnym. Zapewnia to głodówkę much przed testem, dzięki czemu będą one bardziej wrażliwe na smak awersyjny. Bezpośrednio przed wykonaniem testu każda mucha z dziesięcioosobowej grupy jest umieszczana w pustej probówce do wirowania o pojemności 15mL, która następnie jest luźno zamknięta, aby zapobiec ucieczce.

4. Test ujemnego geotaksji

• Geotaksję mierzy się zazwyczaj dla dziesięciu do dwudziestu grup po dziesięć osobników tego samego genotypu lub wariantu traktowania (łącznie 100-200 much dla każdego genotypu/wariantu)⁷. Posegreguj grupy po dziesięć samic lub samców much przy użyciu aparatury do anestezji CO₂ i umieść każdą grupę w osobnej fiolce. Pozostaw muchy na co najmniej jedną godzinę, aby doszły do siebie po narkozie.
• Przygotuj aparaturę do wspinania dla każdej grupy w taki sposób, aby dwie puste fiolki polistyrenowe zostały połączone pionowo za pomocą taśmy, przylegając do siebie wzniesieniami. Ważne jest, aby otwory fiolek były idealnie wyrównane, co zapewni muchom równą powierzchnię do wspinania.
• W dolnej fiolce odmierz pionową odległość 8 cm od dna i zaznacz każdą fiolkę, rysując okrąg wokół całego jej obwodu.
• Przenieś grupę dziesięciu much do dolnej fiolki, uważając, aby żadna mucha nie uciekła. Natychmiast przykryj dolną fiolkę górną i zabezpiecz taśmą w pobliżu stykających się otworów. Pozwól muchom aklimatyzować się w nowym otoczeniu przez 1 minutę przed przeprowadzeniem testu.
• Delikatnie opukaj fiolkę, aby muchy opadły na dno, a następnie zmierz liczbę much, które zdołały wspiąć się powyżej linii 8 cm w ciągu 10 sekund po opukaniu.
• Powtórz ten test dla tej samej grupy dziesięć razy, zachowując 1 minutę przerwy między kolejnymi próbami.
• Zapisz liczbę much w każdej grupie, które przekroczyły linię 8 cm, jako procent całkowitej liczby much.

5. Test supresji awersyjnej fototaksji (test APS)

Opracowany pierwotnie na podstawie metody Le Bourga i Buechera (2002)⁴, test ten wykorzystuje pozytywną fototaksję u muszek owocówek, aby nauczyć je kojarzenia światła z bodźcami awersyjnymi (w tym przypadku gorzkiego smaku chininy). Po fazie treningu/warunkowania muszki typu dzikiego będą w stanie powiązać oświetlony obszar z awersyjnym smakiem i zaczną go unikać. Muszki z upośledzonymi zdolnościami uczenia się nie zdołają stworzyć tego powiązania. Ponadto test APS może być wykorzystany do pomiaru funkcji pamięci krótkotrwałej u muszek⁵ poprzez poddanie wcześniej wytrenowanych osobników temu samemu testowi 6 godzin po warunkowaniu, w celu sprawdzenia ich zdolności zapamiętywania nauczonego zadania.

1. Przygotowanie roztworu chininy
   • Rozpuścić chlorowodorek chininy w wodzie destylowanej, aby przygotować 0,1M roztwór zapasowy (1,98g w 50mL wody destylowanej). Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze -20°C do roku w niewielkich aliquotach.
   • Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 μM poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w wodzie destylowanej.
2. Przygotowanie labiryntu w kształcie litery T (T-Maze)
   • Labirynt T składa się z kolumny centralnej z zapadką oraz dwóch niezależnych komór: komory „ciemnej” i komory „oświetlonej” (Rysunek 1).
   • Przygotowanie komór: wziąć dwie plastikowe probówki odwirówkowe o pojemności 15mL i odciąć końcówkę od strony dna na wysokości 2 mL za pomocą piłki ręcznej. Zamocować adaptery łączące na obu końcach i uszczelnić połączenie parafilmem. Adapter na końcu probówki służy jako otwór wejściowy dla źródła światła typu gęsia szyja. Połączyć jedną probówkę ze źródłem światła – będzie ona komorą „oświetloną”. Drugą probówkę owinąć folią aluminiową, aby służyła jako komora „ciemna”.
   • Nanieść 180uL wody destylowanej lub roztworu chininy na papier filtracyjny i umieścić go w komorze oświetlonej.
   • Złożyć labirynt T, przykręcając komorę oświetloną i ciemną po obu stronach kolumny centralnej, z zamkniętą zapadką pośrodku (Rysunek 1).
   • Wprowadzić źródło światła do komory oświetlonej.
3. Trenowanie much w zakresie tłumienia fototaksji za pomocą bodźców awersyjnych
   • Odkręcić komorę ciemną od labiryntu T, przenieść pojedynczą muchę do tej komory i natychmiast przykręcić probówkę ciemną z powrotem do labiryntu.
   • Wyłączyć światła w pomieszczeniu i włączyć lampę czerwoną.
   • Pozwolić musze aklimatyzować się w komorze ciemnej przez 30 sekund, a następnie powoli włączyć źródło światła oświetlające komorę oświetloną. Powoli otworzyć zapadkę oddzielającą obie komory.
   • Jeśli mucha wejdzie do komory oświetlonej w ciągu 10 sekund, uznaje się ją za wykazującą fototaksję dodatnią i jest ona gotowa do treningu w badaniu. Brak fototaksji wskazuje na problemy w systemie wzrokowym; muchy z fototaksją ujemną należy wykluczyć z badania.
   • W ramach treningu tłumienia awersyjnej fototaksji (APS), muchę wykazującą fototaksję dodatnią należy delikatnie przesunąć z powrotem do komory ciemnej, zamknąć zapadkę i wyłączyć światło. Pozostawić na 30 sekund w celu aklimatyzacji. W tym czasie umieścić w komorze oświetlonej papier filtracyjny nasączony roztworem chininy. Powoli otworzyć zapadkę i włączyć światło. Pozwolić musze wejść do oświetlonej komory pokrytej chininą. Po minucie przesunąć muchę z powrotem do komory ciemnej i powtórzyć tę procedurę jeszcze 9 razy. (Zazwyczaj muchy typu dzikiego unikają komory oświetlonej po 3 do 5 próbach treningowych).
   • Bezpośrednio po treningu przeprowadzić pięć prób testowych. W każdej próbie testowej, po włączeniu światła, dać trenowanej musze 10 sekund na wejście do komory oświetlonej. Brak wejścia do oświetlonej probówki zapisuje się jako „Pass” (sukces), co jest równoznaczne z „zadaniem wyuczonym poprzez wzmocnienie”. Wskaźnik sukcesów w pięciu kolejnych próbach jest rejestrowany i przedstawiony poniżej na Rysunku 2 jako PC0 (0 h po kondycjonowaniu).
4. Ocena funkcji pamięci krótkotrwałej u much
   • Po treningu i początkowych pomiarach PC0 każdą muchę należy przenieść z powrotem do oryginalnej probówki z pokarmem i odstawić na sześć godzin.
   • Sześć godzin po treningu poddać każdą muchę ponownie 5 próbom w ten sam sposób co wcześniej i zapisać liczbę razy, gdy mucha unika (pass) lub wchodzi (fail) do oświetlonej probówki. Ten wskaźnik sukcesów zapisuje się jako PC6 (6 h po kondycjonowaniu), co stanowi wskaźnik pamięci krótkotrwałej.

6. Interpretacja danych i analiza statystyczna

1. Test negatywnego geotaksji
   • Surowe dane uzyskane w tym teście reprezentują liczbę much, które przekroczyły markę 8-cm w ciągu 10 sekund w każdej grupie. Należy przeliczyć tę wartość na procenty i obliczyć średnią stopę przejść dla każdej grupy w ciągu 10 sesji.
   • Dane są przedstawione graficznie jako średnia stopa przejść na grupę (genotyp, traktowanie itp.) wraz ze standardowym błędem średniej (SEM).
   • Następnie, za pomocą testu t Studenta lub analizy ANOVA, można określić, czy różnice między grupami są statystycznie istotne.
2. Test supresji awersyjnej fototaksji
   • Surowe dane z tego testu reprezentują liczbę razy, gdy każda mucha unika oświetlonej komory w pięciu kolejnych próbach. Stopę przejść oblicza się jako procent udanych prób unikania w stosunku do całkowitej liczby prób. W ten sposób należy obliczyć średnią stopę przejść dla minimum 15 much na grupę.
   • Dane są przedstawione graficznie jako średnia stopa przejść PC0 (bezpośrednio po warunkowaniu; wskaźnik „uczenia się”) lub średnia stopa przejść PC6 (6 godzin po warunkowaniu; wskaźnik „pamięci”) z odpowiednimi wartościami SEM.
   • Wskaźniki uczenia się i pamięci są porównywane odpowiednio między grupami, obejmując zarówno typy dzikie, jak i grupę „genetycznie zmodyfikowaną łagodną” (np. muchy z nadekspresją GFP).

7. Reprezentatywne wyniki

W niniejszym eksperymencie wideo oceniamy deficyty uczenia się, pamięci i funkcji motorycznych u much nadeksponujących ludzkie białko Tau w ośrodkowym układzie nerwowym, porównując ich wyniki z wynikami much nadeksponujących GFP. Wykazano, że neuronalna nadeksspresja ludzkiego białka Tau u Drosophila powoduje silną wakuolizację mózgu⁸ i prowadzi do znacznych deficytów funkcji uczenia się i pamięci⁹. Jak pokazano na rysunku 2A, 10-dniowe samce lub samice much nadeksponujących ludzkie białko Tau wykazują znaczne deficyty lokomocyjne w porównaniu z grupą kontrolną much w tym samym wieku nadeksponujących GFP. Ponadto muchy te nie potrafiły powiązać światła z gorzkim smakiem, co wykazano poprzez wskaźnik przejścia PC0 w porównaniu z grupą kontrolną, a także nie potrafiły zapamiętać tego powiązania, co objawiło się spadkiem wskaźnika przejścia PC6 (rysunek 2B). Eksperyment ten stanowi dalsze potwierdzenie, że modele Drosophila mogą być wykorzystywane do badania ludzkich schorzeń neurodegeneracyjnych i odtwarzania niektórych fenotypów behawioralnych obserwowanych u ludzi i ssaków.

Rysunek 1. Układ labiryntu w kształcie litery T dla testu supresji awersyjnej fototaksji (APSA). A. Ogólny schemat eksperymentalny testu APSA z źródłem światła podłączonym do „oświetlonej” probówki typu falcon, wyłożonej papierem filtracyjnym, oraz „ciemnej” probówki po lewej stronie (zakrytej folią), rozdzielonych zapadką. B. Podczas fazy uczenia i testowania mucha znajduje się w ciemnej komorze, a zapadka zostaje otwarta po zapaleniu światła w komorze oświetlonej.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki eksperymentu z ujemną geotaksją oraz APS z zastosowaniem much nadeksponujących GFP lub Tau z wykorzystaniem drivera pan-neuronalnego. A. W teście ujemnej geotaksji 10-dniowe samce (niebieski słupek) lub samice (czerwony słupek) nadeksponujące GFP wykazały wyższą aktywność wspinaczkową niż muchy nadeksponujące Tau. B. 20-dniowe samice nadeksponujące GFP wykazały lepsze funkcje uczenia się (PC0) i pamięci (PC6) niż muchy nadeksponujące Tau.

Dyskusja

Zarówno testy negatywnej geotaksji, jak i testy APS są solidnymi badaniami behawioralnymi służącymi do pomiaru zmian w zdolnościach lokomozyjnych lub w zakresie uczenia się i pamięci, wynikających z manipulacji genetycznych lub środowiskowych. Istnieją jednak pewne niedogodności związane z tymi testami, które wymagają dalszej optymalizacji.

W teście ujemnego geotaksji mutacje w określonych genach mogą powodować poważne zaburzenia motoryczne u much. W takich przypadkach muchy z trudnością wspinają się po ściankach w odpowiedzi na grawitację po pobudzeniu. Odpowiedniejsze mogą okazać się inne testy behawioralne bezpośrednio mierzące ruch. Testy te obejmują badanie odruchu prostowania, który mierzy paraliż i drgawki¹⁰, oraz badanie zachowania optomotorycznego¹¹, które rejestruje utratę koordynacji ruchowej.

W teście APS pierwszą przeszkodą mogą być muchy, które przypadkowo zatrzymują się przy wejściu do oświetlonej komory, nie przesuwając się naprzód. Staje się to bardziej problematyczne, jeśli jednym z badanych czynników jest starzenie, ponieważ starsze muchy są ogólnie mniej aktywne i mają tendencję do zatrzymywania się i odpoczywania przez dłuższy czas. W takim przypadku eksperymentator musi zastosować bodźce mechaniczne w celu pobudzenia do ruchu, co nie zawsze okazuje się skuteczne. Po drugie, można by argumentować, że brak wejścia do oświetlonej komory wynika z utraty dodatniej fototaksji. Rzadko jest to jednak przypadkiem, gdyż wcześniejsze prace wykazały, że muchy odzyskują reaktywność na światło po usunięciu negatywnego wzmocnienia⁴. Po trzecie, czas kontaktu z bodźcem awersyjnym może się różnić między poszczególnymi próbami. Zróżnicowanie to można zazwyczaj zredukować, wyściełając wewnętrzną ścianę komory nasączonym papierem filtracyjnym, aby zapobiec unikaniu przez muchy chininy. Dodatkowo eksperymentator może upewnić się, że każda mucha spędza wystarczająco dużo czasu w kontakcie z papierem filtracyjnym, wydłużając czas przebywania w komorze ponad standardową 1 minutę.

Podsumowując, testy negatywnej geotaksji oraz APS są szybkimi i prostymi sposobami oceny deficytów behawioralnych i ilościowo wskazują na zdolności lokomotoryczne oraz funkcje uczenia się i pamięci u Drosophila. Testy te są szczególnie przydatne w modelowaniu ludzkich schorzeń neurodegeneracyjnych u Drosophila.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka polistyrenowa	Capitol Vial, Inc.	28Fly	Probówka polistyrenowa 28,5 x 95 mm; ważna jest jakość materiału, zbyt śliska powierzchnia uniemożliwi muszkom wspinaczkę.
Stereomikroskop do mikrodissekcji	Carl Zeiss, Inc.	000000-1432-979	Przewód światłowodowy z dwoma ramionami w kształcie gęsiej szyi (12V/30W)
Wodorochlorek chininy	Sigma-Aldrich	6119-47-7	Rozpuścić w wodzie destylowanej.
Szybkozłącza	Nalge Nunc international	62868-021	Polietylen o wysokiej gęstości
Labirynt w kształcie litery T	Simple Behavioral Systems
Jednokanałowa pipeta 200 μL	Eppendorf	022443305