Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ukierunkowanej ewolucji białek w E. coli

Summary

Tutaj pokazujemy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla danej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób ta metoda, która jest wykonywana in vivo w Escherichia coli, może być połączona z selekcją funkcjonalną w celu ewolucji nowych aktywności enzymatycznych.

Abstract

Efektywne generowanie różnorodności genetycznej stanowi nieocenione narzędzie molekularne, które może być używane do oznaczania syntezy DNA, tworzenia unikalnych sygnatur molekularnych lub do ewolucji białek w laboratorium. W tym miejscu prezentujemy protokół, który pozwala na generowanie dużych (>10¹¹) bibliotek mutantów dla danej sekwencji docelowej. Metoda ta opiera się na replikacji plazmidu ColE1 kodującego pożądaną sekwencję przez wariant polimerazy DNA I O NISKIEJ WIERNOŚCI (LF-Pol I). Docelowy plazmid jest przekształcany w zmutowany szczep E. coli i posiażdżany na pożywkach stałych, uzyskując od 0,2 do 1 mutacji/kb, w zależności od lokalizacji docelowego genu. Wyższe częstotliwości mutacji osiąga się poprzez iterację tego procesu mutagenezy. W porównaniu z alternatywnymi metodami mutagenezy, nasz protokół wyróżnia się prostotą, ponieważ nie obejmuje klonowania ani PCR. W związku z tym nasza metoda jest idealna do znakowania mutacyjnego plazmidów lub innych matryc Pol I lub do badania dużych odcinków przestrzeni sekwencji w celu ewolucji aktywności nieobecnych w pierwotnym celu. Ścisła kontrola przestrzenna, którą oferują metody PCR lub randomizowane metody oparte na oligonukleotydach, można również osiągnąć poprzez późniejsze klonowanie określonych sekcji biblioteki. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pokazujące, jak stworzyć losową bibliotekę mutantów i jak ustalić selekcję opartą na lekach w E. coli w celu identyfikacji mutantów wykazujących nowe działania biochemiczne.

Protocol

I. Generowanie biblioteki losowych mutantów

Pol I pośredniczy w inicjacji replikacji plazmidu ColE1 (omówione w (^1-3). Nasza metoda mutagenezy opiera się na umieszczeniu sekwencji docelowej w plazmidzie ColE1 w sąsiedztwie miejsca pochodzenia lub replikacji i rozmnażaniu jej w komórkach eksprymujących polimerazę I DNA O NISKIEJ WIERNOŚCI (LF-Pol I). LF-Pol I jest zmutowaną polimerazą DNA I kodującą trzy mutacje zmniejszające wierność replikacji, a mianowicie I709N (w motywie A), A759R (w motywie B) i D424A (w korekcie dezaktywującej) ^4,5. LF-Pol I ulega ekspresji w szczepie E. coli, JS200, który ma wrażliwy na temperaturę allel Pol I (polA12) (6), tak że LF-Pol I staje się dominującą aktywnością w temperaturze 37 °C. Replikacja sekwencji docelowej w komórkach polA12 w restrykcyjnych warunkach powoduje wygenerowanie losowej biblioteki mutantów. Mutageneza jest bardziej skuteczna w kulturach nasyconych ⁴. Z powodów, które są nadal niejasne, mutageneza nie jest ciągła, tj. częstotliwość mutacji nie wzrasta liniowo wraz z liczbą pokoleń, gdy kultura osiągnie nasycenie, nawet jeśli komórkom pozwoli się na dalszą ekspansję w świeżych pożywkach. W związku z tym dalsze zwiększanie obciążenia mutacjami w bibliotece wymaga iteracyjnych rund mutagenezy i odzyskiwania plazmidu. Tutaj udostępniamy protokoły mutagenezy LF-Pol I. Należy zauważyć, że przedstawione tutaj protokoły zostały znacznie uproszczone w stosunku do naszego pierwotnego opisu ⁴ w celu ułatwienia iteracji procesu osiągania pożądanego obciążenia mutacją (rys. 1).

Materiały

• Komórki: JS200 recA718 polA12 (ts) uvrA155 trpE65 lon-11 sulA
  • JS200 WT-Pol I: Komórki JS200 eksprymujące Pol I typu dzikiego (WT)
  • JS200 LF-Pol I: JS200 wyrażający niską wierność (LF) Pol I
  • Szczep odczytowy: JS200 WT-Pol I lub (w celu uzupełnienia) szczep pozbawiony określonej aktywności
• Plazmid docelowy
  • Plazmid zawierający pochodzenie replikacji ColE1 z genem docelowym sklonowanym w

1. Przed mutagenezą: Przygotowanie elektrokompetentnych ogniw JS200 LF-Pol I

1. Wybierz pojedynczą kolonię JS200 LF-Pol I z płytki LB wyhodowanej w temperaturze 30 °C (warunki dopuszczalne) przez noc, zawierającej odpowiedni wybór antybiotyków dla plazmidu noszącego LF-Pol I (0,03 mg / ml chloramfenikolu) i umieść kolonię w probówce zawierającej 8 ml LB z chloramfenikolem. Hoduj kulturę w temperaturze 30°C i potrząsaj z prędkością 250 obr./min przez noc.
2. Rano rozwiń hodowlę, wlewając 8 ml JS200 LF-Pol I do kolby zawierającej 400 ml LB z chloramfenikolem. Pozwól kulturze rosnąć w temperaturze 30°C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, aż osiągnie A₆₀₀ wynoszące 0,4-0,7 (zwykle 3-4 godziny).
3. Po osiągnięciu A₆₀₀ 0,4-0,7 schładzaj kulturę na mokrym lodzie przez 15 minut.
4. Przenieść schłodzoną kulturę do odpowiedniego pojemnika w celu odwirowania. Granulki przez odwirowanie w temperaturze 4°C. Odlać supernatant, a następnie dodać 10 ml sterylnego i schłodzonego (na mokrym lodzie) 10% glicerolu do pojemnika i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej.
5. Przenieś ponownie zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Napełnij stożkową probówkę do oznaczenia 45 ml 10% glicerolem, a następnie wiruj przez 15 minut w temperaturze 4°C i 4000 obr./min.
6. Odlewać sklarowany osad, dodać ponownie 10 ml 10% glicerolu do stożkowej probówki i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej lub zwykłej. Ponownie napełnij stożkową probówkę do oznaczenia 45 ml 10% glicerolem i wiruj przez 15 minut w temperaturze 4°C i 4000 obr./min. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aby usunąć wszelkie ślady soli.
7. Po ostatnim wirowaniu ponownie zawiesić osad komórek w równej części 10% glicerolu (tj. ponownie zawiesić 2 ml komórek z 2 ml 10% glicerolu).
8. Podzielić między 100 μl a 500 μl zawieszonych komórek na kilka probówek do przechowywania. Szybko zamroź komórki na suchym lodzie, a następnie przechowuj je w temperaturze -80°C.
9. Przed użyciem ogniw do elektrokompetentnych przemian należy je powoli rozmrozić na lodzie.

2. Mutageneza: Transformacja docelowego plazmidu

1. Odpipetować 40 μl elektrokompetentnych ogniw JS200 LF-Pol I i od 30 do 250 ng docelowego plazmidowego DNA do kuwety elektroporacyjnej o szczelinie 2 mm.
   Uwaga #1: Plazmid ColE1 zawierający GFP może być przenoszony przez mutagenezę równolegle z genem docelowym jako kontrola. Po zakończeniu etapu odczytu, GFP można posiać na płytkach agarowych LB i zobrazować pod kątem mutagenezy. Kolonie, które wydają się ciemne lub ciemne, zawierają mutacje dezaktywujące.
2. Pulsować mieszaninę w elektroporatorze przy napięciu 1800 V. Sprawdź stałą czasową (T_C), aby zapewnić jednolite warunki elektroporacji dla każdej próbki; najlepiej T_C = 5-6 sek.
3. Odzyskaj mieszaninę komórka/DNA w 1 ml bulionu LB przez 40 minut w temperaturze 37°C (warunki restrykcyjne), wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
4. Płytka 50 μl kultury odzysku na 100-milimetrowej szalce Petriego z agarem o średnicy 100 mm, wstępnie podgrzanej do 37°C, zawierającej zarówno chloramfenikol, jak i odpowiednie stężenie antybiotyku wybranego dla docelowego plazmidu.
   Uwaga: #2: Staraj się platerować komórki w stężeniu "blisko trawnika". Koncentracja "w pobliżu trawnika" jest definiowana jako wyraźna, ale niepoliczalna liczba kolonii (>1000 kolonii / 100 mm szalka). Rozcieńczenie, jeśli takie występuje, będzie zależało od tego, jak kompetentne są ogniwa elektryczne. Jeśli komórki nie są zbyt kompetentne elektroenergetycznie i nie można osiągnąć "bliskiego trawnika" poprzez "czyste" posiew kultury odzysku, należy odwirować kulturę odzysku przez 2 minuty przy 4000 obr./min, odlać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 50 μl bulionu LB i pokryć kulturę.
5. Inkubować dishe Petriego przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Mutageneza: Odzyskiwanie plazmidu

1. Następnego dnia umyj szalki Petriego, pipetując 2 ml bulionu LB na komórki. Przenieś kolonie bakterii z szalek Petriego z agaru LB do bulionu LB, "szorując" je z płytki wysterylizowanym szklanym prętem w kształcie trójkąta. Najpierw dodaj 1 ml bulionu LB, zbierz płukanie i powtórz procedurę z drugim ml bulionu LB.
2. Wyizolować plazmidowe DNA z płytki. (To plazmidowe DNA stanowi bibliotekę).
   Uwaga #3: Płyn zebrany z talerza LB może być zbyt gęsty, aby można go było przygotować w całości. W takim przypadku należy przygotować maksymalną ilość przydzieloną przez zestaw do mini-przygotowania (zazwyczaj obejmowało to rozcieńczenie prania do OD = 1 i przygotowanie ~ 3 ml rozcieńczonej kultury) lub zwiększenie do maksymalnego przygotowania

4. Iteracja

1. Ogranicz 1 μg izolowanego plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, który linearyzuje plazmid LF-Pol I, ale nie przecina docelowego plazmidu (ryc. uzupełniający 1).
2. Oczyść trawienie restrykcyjne za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
   Uwaga #4: Ten krok usuwa wszystkie ślady enzymu restrykcyjnego i jego buforu. Ten krok jest niezbędny, aby utrzymać niskie stężenie soli dla kolejnych elektrokompetentnych przemian.
3. Przekształć 30-250ng ograniczonej biblioteki plazmidu docelowego z powrotem w świeże komórki JS200 LF-Pol I, aby poddać bibliotekę kolejnym rundom mutagenezy.
   Uwaga #5: Linearyzacja plazmidu Pol I za pomocą enzymu restrykcyjnego zapewnia, że tylko docelowy plazmid zostanie przekształcony.
4. Powtórz sekcje 2 i 3.

5. Odczyt

1. Ogranicz izolowane DNA plazmidu za pomocą enzymu restrykcyjnego(-ych), który linearyzuje zarówno plazmid docelowy, jak i plazmid Pol I. Uruchom trawienie na 1% żelu agarozowym, aby zapewnić ilość i jakość plazmidów. Ograniczenie ~400ng izolowanego plazmidowego DNA jest zwykle wystarczające do analizy.
2. Ogranicz 1 μg izolowanego DNA plazmidu enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje plazmid LF-Pol I, ale nie przecina docelowego plazmidu.
3. Oczyść trawienie restrykcyjne za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
4. Przekształć ograniczoną bibliotekę plazmidów docelowych w szczep odczytowy, aby scharakteryzować mutacje.

II. Analiza przesiewowa mutantów i cech za pomocą gradientowych płytek wzrostu.

Aby zilustrować, jak ogromna różnorodność genetyczna obecna w naszych bibliotekach może być połączona z selekcją funkcjonalną, tutaj udostępniamy protokół selekcji funkcjonalnej in vivo na podstawie leków u E. coli. Metoda ta opiera się na wzroście wzdłuż gradientu leku na stałym agarze . Pozwala to na jednoczesną charakterystykę wielu (do 12) próbek w zakresie stężeń, zapewniając szerszy zakres dynamiki niż w przypadku pojedynczego leczenia farmakologicznego. Kolejną zaletą jest to, że nieliniowy odczyt tego testu buforuje umiarkowane różnice w żywotności w 2-krotnym zakresie. W związku z tym ten test oporności na cytotoksyczność zapewnia solidny i szybki sposób selekcji bibliotek mutantów i określenia profilu fenotypowego poszczególnych mutantów. Rys. 2 przedstawia przykład każdego z tych zastosowań: panel A pokazuje wybór poszczególnych mutantów z ludzkiej biblioteki demetylazy oksydacyjnej ABH2. Kolonie rosnące powyżej progu WT są selekcjonowane w celu zwiększenia ochrony przed cytotoksycznością spowodowaną przez czynnik metylujący sulfonian metylu metanu (MMS) ⁷. Panel B przedstawia przykład gradientów używanych do charakteryzacji poszczególnych klonów. Poziom oporności na cefalosporynę, antybiotyk cefalosporynowy cefotaksym, przedstawiono na gradionym agarze dla WT β-laktamazy i dla dwóch mutantów o rozszerzonym spektrum, R164H i E104K R164S G267R ⁴. Należy zauważyć, że w zależności od siły obserwowanych efektów, do odpowiedniego oznaczania ilościowego może być konieczne użycie więcej niż jednej płytki: podczas gdy gradient 0,4 mg/ml pozwala na bezpośrednie porównanie z klonami kontrolnymi, poziom oporności najsilniejszego mutanta można ustalić tylko przy użyciu wyższego stężenia cefotaksymu (4 mg / ml).

Materiały

• sprzęt
  • Kwadratowe szalki Petriego 100x100x15mm (Fisher Sci #0875711A)
  • Okrągła szalka Petriego 100 mm
  • Szkiełko mikroskopowe 25x75x1mm (Fischer Sci #1255015)
  • Probówka z podziałką 50 ml
• media
  • Agar LB: stopiony i zrównoważony w łaźni wodnej w temperaturze 56°C
    Uwaga #6: temperatura podłoża może wpływać na stabilność, a tym samym na aktywność badanego leku lub związku.
  • Miękki agar: stopiony i zrównoważony w łaźni wodnej do 42°C

1. Budowa gradientu

1. Zaznacz dziesięć pasów, rozmieszczonych równomiernie na jednej krawędzi dna kwadratowej szalki Petriego.
2. Umieść naczynie na pochyłości tak, aby dolna zaznaczona krawędź była podniesiona o 7 mm;
   Gęsta trawa lub inny płaski przedmiot może służyć jako podpora do podniesienia naczynia. Do pochylonego naczynia wlać 25 ml ciepłego (~56°C) agaru LB dobrze wymieszanego z odpowiednim stężeniem środka selekcyjnego. Jest to dolna warstwa gradientu. Upewnij się, że agar LB równomiernie pokrywa szalkę Petriego tak, że podniesiony, zaznaczony koniec naczynia zawiera ~1 mm agaru LB, a obniżona część zawiera ~ 8 mm agaru LB. Następnie pozostaw agar do zastygnięcia na 10-15 minut.
   Uwaga #7: W przypadku hydrofobowych środków selekcyjnych, do agaru LB można dodać 0,1% środka powierzchniowo czynnego (emulsji przeciwpieniącej B), aby ułatwić zawieszenie i równomierne rozprowadzenie leku. Dodać środek powierzchniowo czynny do ciepłego sterylnego agaru LB, energicznie wstrząsając przed dodaniem środka selekcyjnego. Środek powierzchniowo czynny powinien zawiesić się w postaci drobnej mgiełki małych kropelek, duże kropelki wskazują, że podłoże jest zbyt gorące i mogą hamować równomierne rozprowadzanie badanego leku.
3. Po stwardnieniu pierwszych 25 ml agaru LB naczynie przenosi się na płaską powierzchnię. Następnie wlewa się 25 ml agaru LB bez środka selekcyjnego, aby pokryć pierwszą powierzchnię agaru LB. To jest górna warstwa gradientu. Upewnij się, że agar LB pokrywa całą powierzchnię dolnej warstwy. Przykryj przekrzywioną pokrywką w celu wentylacji i pozostaw agar do zastygnięcia na 10-15 minut.
   Uwaga #8: Należy pamiętać o zagrożeniach związanych z aerozolami i potencjalnym ulatnianiu się badanego związku; Wlać gradienty do okapu bezpieczeństwa chemicznego lub biologicznego, jeśli jest to wymagane przez wymagania bezpieczeństwa chemicznego.
   Uwaga #9: Naczynia gradientowe należy zużyć w ciągu 4 godzin, aby zachować gradient stężenia leku lub badanego związku.

2. Przenoszenie pieczęci bakterii

1. Miękki agar należy podmienić do temperatury 42°C. Przenieś 2 ml płynnego miękkiego agaru na pokrywkę lub dno okrągłej szalki Petriego o średnicy 100 mm. Odpipetować 40 μl kultury bakteryjnej do miękkiego agaru, a następnie wymieszać, kołysząc płytką.
   Uwaga #10: Faza wzrostu kultury bakteryjnej może wpływać na jej reakcję na lek lub badany związek. Posiewy w fazie logarytmicznej lub kultury nocne w fazie stacjonarnej powinny być stosowane z zachowaniem spójności w celu uzyskania jednolitych wyników. Gęstość komórek może również zniekształcać względne wyniki, dlatego wszystkie kultury należy rozcieńczyć, aby odpowiadały wartościom gęstości A₆₀₀. Kultury nocne należy rozcieńczyć, aby gęstość A₆₀₀ była mniejsza niż 1,0
2. Pokryj długą krawędź szklanego szkiełka mikroskopowego miękką mieszanką agarów. Następnie, wyrównując powlekaną krawędź szkiełka z dolnym znacznikiem (od niskiego do wysokiego stężenia) na szalce gradientowej, przyłóż szkiełko do powierzchni agaru. Wystarczy miękki dotyk, aby przenieść wstęgę miękkiego agaru na powierzchnię gradientu. Szkiełko jest następnie odkładane na bok do czyszczenia i ponownego użycia.
3. Powtórz ten proces dla pozostałych próbek bakteryjnych. Próbki referencyjne powinny być dołączone do każdej szalki gradientowej, jeśli przeprowadza się wiele gradientów.
4. Inkubować naczynie gradientowe od góry do dołu przez noc w temperaturze 37°C. Czasy i temperatury inkubacji mogą się różnić dla różnych szczepów bakterii odczytowych, ale noc w temperaturze 37°C jest zazwyczaj wystarczająca do widocznego wzrostu.

3. Obrazowanie i analiza wzrostu

1. Obrazowanie: Po nocnym wzroście gradienty można bezpośrednio zobrazować lub utrwalić i wybarwić roztworem 0,2 mg / ml pomarańczy akrydynowej w 95% EtOH, aby zwiększyć kontrast. Płytkę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 5 minut w roztworze barwiącym, następnie przemywa 95% EtOH, a następnie obrazuje w lampie UV.
   Uwaga #11: Uważaj, aby nie spłukiwać kolonii z płytki, ale raczej kołysać roztworem barwiącym i myć płytkę i usuwać roztwory z rogów.
2. W przypadku analizy fenotypu poszczególnych zmutowanych plazmidów, odległość wzrostu w stosunku do gradientu stężeń jest normalizowana do normy dla każdego gradientu. Te względne wartości można następnie porównać między gradientami.
   Uwaga #12: W zależności od charakteru efektu cytotoksycznego, można zaobserwować ostrą krawędź lub bardziej rozproszoną krawędź (porównaj np. Panele A i B na Rys. 2). W przypadku krawędzi dyfuzyjnych wskazane jest zmierzenie krawędzi ciągłego wzrostu, ponieważ poszczególne kolonie wykazują tendencję do zwiększonej zmienności.
3. W celu selekcji bibliotecznej poszczególne kolonie, które rosną w stężeniach wyższych niż kontrola rodzicielskiego typu dzikiego, są izolowane i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania mutacji przyczyniających się do zwiększonej ochrony.

III. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Porównanie protokołów mutagenezy posiewu płynnego i bezpośredniego. Protokół mutagenezy bezpośredniego posiewu przedstawiony tutaj (na dole) jest szybszy i wymaga mniej kroków niż nasz oryginalny protokół mutagenezy płynnej (u góry). Gdy GFP jest używany jako reporter, różnice we fluorescencji wskazują na różnorodność genetyczną obecną w bibliotece. Zazwyczaj jeden cykl mutagenezy skutkuje 12-18% koloniami ze znacznie obniżonym poziomem fluorescencji.

Rysunek 2. Testy odporności gradientowej. Panel A Wybór pod kątem zwiększonej odporności na metylosulfonian metylu (MMS). Biblioteki plazmidowe ludzkiej demetylazy oksydacyjnej ABH2 zostały wybrane w celu zwiększenia odporności na MMS. Pokazano dwie takie biblioteki reprezentujące dwie i cztery iteracje protokołu mutagenezy w porównaniu z rodzicielskim typem dzikim (WT) i pustym wektorem (Δ). Biała linia oznacza próg, powyżej którego izolowano poszczególne zmutowane kolonie w celu dalszej analizy fenotypowej. Panel B Ochrona przed cefotaksymem, wskazująca na aktywność β-laktamazy o rozszerzonym spektrum. R164H i E104K R164H G267R, dwa mutanty beta-laktamazy wcześniej zidentyfikowane w wyniku mutagenezy LF-Pol I sprzężonej z selekcją aztreonamu ⁴, są pokazane w gradiencie cefotaksymu 0,4 μg / ml i 4 μg / ml. Należy zauważyć, że enzym β-laktamazy typu dzikiego nie zapewnia żadnej ochrony w stosunku do komórek wyrażających pusty wektor, Δ. Dlatego te mutanty reprezentują ewolucję nowej aktywności biochemicznej ^8,9.

Rysunek 3. Częstość mutacji w funkcji odległości od ori (d). Częstość mutacji po pojedynczym cyklu bezpośredniej mutagenezy posiewu jest pokazana dla odstępów 100 pz w stosunku do przełącznika RNA/DNA początku replikacji ColE1. Obszar między 1600 a 2400 nie jest reprezentowany, ponieważ β-laktamaza nie stanowi neutralnego celu. Punkty poza β-laktamazą reprezentują odstępy 200 pz, biorąc pod uwagę ogólnie niską częstotliwość mutacji w tym obszarze. Trend (równanie dwumianowe, z R² = 0,41) jest pokazany jako linia.

Rysunek uzupełniający 1. Plazmid LF Pol I zawierający Pol I. Sekwencja A (format FastA). Informacje o sekwencji w celu określenia właściwego enzymu restrykcyjnego (enzymów) restrykcyjnego do użycia podczas linearyzacji plazmidu Pol I do iteracji (generowanie biblioteki losowych mutacji, krok 4) lub odczytu (krok 5). B Charakterystyka ogólna i mapa restrykcji plazmidu. Przedstawiono lokalizację początku replikacji pSC101, marker oporności na chloramfenikol (CAT) oraz gen LF-Pol I. Wskazana jest również lokalizacja pojedynczych miejsc objętych ograniczeniami.

biblioteka   Bezpośrednie powlekanie Ciecz
(1 dzień) Ciecz
(3 dni) Mutacje (#)   95 Rozdział 95 Rozdział 40 Rozdział 142 Sekwencjonowanie klonów Rozdział 288 96 Rozdział 96 Rozdział 190 Całkowite pokrycie (bp) 182 000 osób 102 000 osób 213 000 osób Częstotliwość mutacji (x10³ pz) 0,52 pkt. 0,39 pkt. 0,67 pkt. Częstotliwość d<1000 (x10³ pz) 0,92 pkt. 0,41 pkt. 0,70 pkt.

Tabela 1. Częstość mutacji. Częstości (wyrażone jako # mutacji/pz) dla d<1000, tj. w obrębie 1000 pz sąsiadujących z przełącznikiem RNA/DNA, dla trzech protokołów mutagenezy: bezpośredniego posiewu, nasycenia cieczą (1 dzień) i hipernasycenia cieczą (3 dni).

    Bezpośrednie powlekanie ciecz Mutacje (#)   95 Rozdział 95 Rozdział 182 Widmo (%)       Od A do G Od A do G 6,3 Pytanie 19,2   Od T do C Rozdział 4.2 3.8         C do T G do A Pytanie 27,4 13,7   C do T 35,8 pkt. 35,2 pkt.         Od A do T Od A do T 5.3 8,2   Od t do A 5.3 7,1         Od T do G Od T do G 1.1 1.1   Od A do C 0,0 2.2         G do T G do T 1.1 2.7   Od C do A 2.1 2.7         C do G C do G 2.1 1.1   Od G do C 5.3 2.7         Indele Dodatki 3.2 0,0   Del 1.1 0,0           Od A do N Rozdział 11,6 29,7 pkt.   G do N 33,7 pkt. Pytanie 19,2   od T do N Pytanie 10,5 Rozdział 12.1   C do N 40,0 pkt. 39,0 pkt.           Ts 73,7 pkt. 72,0 pkt.   telewizja Rozdział 22.1 28,0 pkt.   Indele Rozdział 4.2 0

Tabela 2. Metryki mutacji dla bezpośredniego posiewu i mutagenezy cieczy. W tabeli przedstawiono liczbę zaobserwowanych mutacji (w liczbie) oraz spektrum mutacji (w %) po pojedynczym cyklu mutagenezy. Widmo jest podzielone na pary komplementarne, zmiany nukleotydów i rodzaj mutacji.

Discussion

W artykule przedstawiono protokół mutagenezy, który pozwala na generowanie dużych losowych bibliotek mutantów bez konieczności klonowania lub PCR. Metoda ta opiera się na podatnej na błędy replikacji plazmidu kodującego sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania. Teoretycznie mutacje powinny być w dużej mierze ograniczone do 100-300 pz znajdujących się bezpośrednio za przełącznikiem RNA/DNA, wielkości nici pośredniej pochodzenia wytwarzanej przez Pol I ^2,10. Stwierdziliśmy, że w warunkach przedstawionych w tym protokole mutacje Pol I występują w całym plazmidzie, chociaż ich częstotliwość maleje wraz ze wzrostem odległości od plazmidu lub (ryc. 3). Odkrycie to sugeruje, że przejście lub "przełączenie" z Pol I do Pol III podczas replikacji plazmidu ColE1 jest znacznie bardziej stopniowe niż wcześniej zgłaszano, przynajmniej w naszych warunkach eksperymentalnych ² i zgadza się z wcześniejszymi badaniami sugerującymi funkcjonalną redundancję między Pol I i Pol III ¹¹.

Nasz oryginalny protokół opisywał mutagenezę w kulturach płynnych (4). Protokół ten daje 0,41 mutacji/kb dla d<1000, tj. w obrębie 1000 pz przylegającego do przełącznika RNA/DNA (Tabela 1). Nadmierne nasycenie poprzez pozostawienie płynnej kultury w wytrząsarce na 3 dni bez dodawania jakichkolwiek świeżych pożywek zwiększa częstość mutacji do 0,70 mutacji / kb, ale powoduje bardzo słabą wydajność plazmidu (mniej niż 1% w porównaniu z dniem 1; dane nie pokazane) (Tabela 1). W tym miejscu przedstawiamy uproszczony protokół oparty na bezpośrednim posiewaniu przemiany docelowego plazmidu na stałym agarze w temperaturze 37 °C (ryc. 1). Ta procedura daje największą częstość mutacji/cyklu mutagenezy (0,92 mutacji/kb dla d<1000) i znacznie ułatwia iterację. Zmiana warunków hodowli na pożywki stałe również wpływa na spektrum mutacji (Tabela 2). Mutageneza bezpośredniego posiewu zmniejsza wyraźną asymetrię między komplementarnymi podstawieniami par zasad obserwowaną w hodowli płynnej (porównaj C→T vs. G→A i A→G vs. T→C). Z drugiej strony, bezpośrednie posiewanie wytwarzało więcej indeli (z mniej niż 0,5% do 4%) i zmniejszało liczbę mutacji A→G 3-krotnie, co prowadziło do nadreprezentacji mutacji G/C (74%). Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że większa prostota i zwiększona wydajność przedstawionego tutaj protokołu bezpośredniego posiewu przeważają nad korzyściami płynącymi z nieco bardziej zrównoważonego spektrum mutacji wytwarzanego przez mutagenezę cieczy.

W obrębie plazmidu docelowego mutacje generowane naszą metodą nie są ograniczone do pożądanej sekwencji docelowej. Jednak ewolucja nowych działań biochemicznych powinna być zależna od mutacji w obrębie genu docelowego, ponieważ stanowi to zmianę jakościową, a nie ilościową. Tak więc połączenie naszej mutagenezy plazmidowej z badaniami przesiewowymi mutantów na płytkach gradientowych wykorzystuje mocne strony naszego systemu (duże biblioteki i dostępność selekcji) do ewolucji nowych właściwości biochemicznych. Inne zastosowania mutagenezy losowej, takie jak optymalizacja istniejących aktywności enzymatycznych lub randomizacja określonych obszarów genu, wymagają klonowania po mutagenezie losowej. W tym przypadku posiadanie biblioteki w plazmidzie, w przeciwieństwie do produktu do amplifikacji PCR, poprawia wydajność klonowania, ułatwiając amplifikację i ograniczenie.

Podsumowując, demonstrujemy prosty protokół tworzenia losowej zmutowanej biblioteki dla danego genu docelowego, która wyróżnia się prostotą i różnorodnością generowanych bibliotek. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta może być połączona z selekcją funkcjonalną w celu efektywnej ewolucji nowych aktywności biochemicznych. Ponadto nasze biblioteki generowane in vivo można łatwo klonować, co pozwala na mutagenezę specyficzną dla danego miejsca lub optymalizację istniejących działań.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
karbenicylina	Cellgro	46100R6	0,1 mg / ml końcowa
tetracyklina	Fisher Scientific	BP7640	0,05 mg / ml końcowa
chloramfenikol	Genlantis	M120100	0,03 mg / ml końcowy
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB Bulion Miller	Difco Laboratories	244620
Soft Agar	Difco Laboratories	214580	Made in house
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A38401-1
Emulsja przeciwpieniąca B	Sigma-Aldrich	A5757
Glycerol	Acros Organics	332030025
talerz kwadratowy 100x100x15mm	Fisher Scientific	0875711A
100mm rnd dish	Fisher Scientific	0875712A Szkiełko
mikroskopowe 25x75x1mm	Złota pieczęć	3048
Elektroporator 2510	Elektroporator Eppendorf
2510	Rurki szczelinowe Eppendorf
2mm	Molecular BioProducts	5520
Zippy mini zestaw przygotowawczy	Zymo Research Corp.	Zobacz materiał D4020