Artykuł metodologiczny

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

30.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2505

⸱

16 marca 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz - UCSC

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Streszczenie

Efektywne generowanie różnorodności genetycznej stanowi nieocenione narzędzie molekularne, które może być wykorzystywane do znakowania syntezy DNA, tworzenia unikalnych sygnatur molekularnych lub ewolucji białek w warunkach laboratoryjnych. Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający generowanie dużych (>1011) bibliotek mutantów dla danej sekwencji docelowej. Metoda ta opiera się na replikacji plazmidu ColE1 kodującego pożądaną sekwencję przez wariant polimerazy DNA I o niskiej wierności (LF-Pol I). Plazmid docelowy jest transformowany do szczepu mutatora E. coli i wysiewany na podłoża stałe, co pozwala uzyskać od 0,2 do 1 mutacji/kb, w zależności od lokalizacji genu docelowego. Wyższe częstotliwości mutacji osiąga się poprzez iteracyjne powtarzanie tego procesu mutagenezy. W porównaniu z alternatywnymi metodami mutagenezy, nasz protokół wyróżnia się prostotą, ponieważ nie wymaga klonowania ani PCR. W związku z tym nasza metoda jest idealna do znakowania mutacyjnego plazmidów lub innych matryc Pol I, a także do eksploracji dużych obszarów przestrzeni sekwencyjnej w celu ewolucji aktywności nieobecnych w oryginalnym celu. Ścisłą kontrolę przestrzenną, którą oferuje PCR lub metody oparte na randomizowanych oligonukleotydach, można również osiągnąć poprzez późniejsze klonowanie specyficznych fragmentów biblioteki. Dostarczamy tutaj protokoły pokazujące, jak stworzyć losową bibliotekę mutantów oraz jak wprowadzić selekcję opartą na lekach w E. coli w celu zidentyfikowania mutantów wykazujących nowe aktywności biochemiczne.

Protokół

I. Generowanie losowej biblioteki mutantów

Pol I pośredniczy w inicjacji replikacji plazmidu ColE1 (przegląd w (1-3). Nasza metoda mutagenezy opiera się na umieszczeniu sekwencji docelowej w plazmidzie ColE1 sąsiadującym z początkiem replikacji i namnażaniu go w komórkach wykazujących ekspresję DNA polimerazy I o niskiej wierności (LF-Pol I). LF-Pol I jest mutantem DNA polimerazy I kodującym trzy mutacje zmniejszające wierność replikacji, mianowicie I709N (w motywie A), A759R (w motywie B) oraz D424A (inaktywującą korektę błędów) 4,5. LF-Pol I jest eksprymowana w szczepie E. coli JS20, który posiada allel Pol I wrażliwy na temperaturę (polA12) (6), dzięki czemu LF-Pol I staje się dominującą aktywnością w 37 °C. Replikacja sekwencji docelowej w komórkach polA12 w warunkach restrykcyjnych prowadzi do powstania losowej biblioteki mutantów. Mutageneza jest bardziej efektywna w kulturach nasyconych 4. Z przyczyn, które wciąż nie są jasne, mutageneza nie jest ciągła, t. j. częstość mutacji nie zwiększa się liniowo wraz z liczbą generacji po osiągnięciu nasycenia kultury, nawet jeśli komórkom pozwalaną jest dalsza ekspansja w świeżych mediach. W związku z tym dalsze zwiększanie obciążenia mutacyjnego biblioteki wymaga iteracyjnych rund mutagenezy i odzyskiwania plazmidów. Przedstawiamy tutaj protokoły dla mutagenezy LF-Pol I. Należy zauważyć, że zaprezentowane tutaj protokoły zostały znacznie uproszczone w stosunku do naszego pierwotnego opisu 4, aby ułatwić iterację procesu w celu osiągnięcia pożądanego poziomu mutacji (Rys. 1).

Materiały

  • Komórki: JS20 recA718 polA12 (ts) uvrA15 trpE65 lon-1 sulA
    • JS20 WT-Pol I: komórki JS20 wykazujące ekspresję Pol I typu dzikiego (WT)
    • JS20 LF-Pol I: komórki JS20 wykazujące ekspresję Pol I o niskiej wierności (LF)
    • Szczep do odczytu: JS20 WT-Pol I lub (do komplementacji) szczep pozbawiony konkretnej aktywności
  • Plazmid docelowy
    • Plazmid zawierający replikacyjną sekwencję startową ColE1 z wklonowanym genem docelowym

1. Przed mutagenezą: Przygotowanie elektrokompetentnych komórek JS20 LF-Pol I

  1. Wybrać pojedynczą kolonię JS20 LF-Pol I z płytki LB hodowanej przez noc w 30°C (warunki dopuszczalne) z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku selekcyjnego dla plazmidu niosącego LF-Pol I (0,03 mg/mL chloramfenikolu) i przenieść kolonię do probówki zawierającej 8 mL LB z chloramfenikolem. Hodować kulturę w 30°C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm przez noc.
  2. Rano zwiększyć objętość kultury, przelewając 8 mL JS20 LF-Pol I do kolby zawierającej 40 mL LB z chloramfenikolem. Hodować kulturę w 30°C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm, aż osiągnie wartość A60 od 0,4 do 0,7 (zazwyczaj 3-4 h).
  3. Po osiągnięciu A60 na poziomie 0,4-0,7 schłodzić kulturę na mokrym lsie przez 15 minut.
  4. Przenieść schłodzoną kulturę do odpowiedniego naczynia do wirowania. Odwirować komórki w 4°C. Odlać nadsącz, a następnie dodać do naczynia 10 mL sterylnego i schłodzonego (na mokrym lsie) 10% glicerolu i resuspendować komórki za pomocą pipety serologicznej.
  5. Przenieść resuspendowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mL. Dopełnić probówkę stożkową do poziomu 45 mL 10% glicerolem, a następnie wirować przez 15 minut w 4°C przy 400 rpm.
  6. Odlać nadsącz, dodać ponownie 10 mL 10% glicerolu do probówki stożkowej i resuspendować komórki za pomocą pipety serologicznej lub zwykłej. Ponownie dopełnić probówkę stożkową do poziomu 45 mL 10% glicerolem i wirować przez 15 minut w 4°C przy 40 rpm. Powtórzyć ten proces jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie ślady soli.
  7. Po ostatnim wirowaniu resuspendować osad komórkowy w równym stosunku 10% glicerolu (np. resuspendować 2 mL komórek w 2 mL 10% glicerolu).
  8. Rozdzielić zawiesinę komórek w ilości od 10 μL do 50 μL do kilku probówek do przechowywania. Szybko zamrozić komórki na suchem lodzie, a następnie przechowywać w -80°C.
  9. Przed użyciem komórek do transformacji elektrokometentnych powoli rozmrozić je na lsie.

2. Mutageneza: Transformacja docelowego plazmidu

  1. Do kuwety do elektroporacji z przerwą 2mm pipetuj 40 μL elektrokompetentnych komórek JS20 LF-Pol I oraz od 30-250ng docelowego plazmidowego DNA.
    Uwaga nr 1: Równolegle z genem docelowym, w celu kontroli, można przeprowadzić mutagenezę plazmidu ColE1 zawierającego GFP. Po zakończeniu etapu odczytu GFP można wysiać na płytki z agarem LB i ocenić pod kątem mutagenezy. Kolonie, które wydają się ciemne lub słabo świecące, zawierają mutacje inaktywujące.
  2. poddaj mieszaninę impulsowi w elektroporatorze przy napięciu 1800V. Sprawdź stałą czasową (TC), aby zapewnić jednorodne warunki elektroporacji dla każdej próbki; optymalnie TC = 5-6 sec.
  3. Regeneruj mieszaninę komórek/DNA w 1 mL pożywki LB przez 40 minut w temperaturze 37°C (warunki restrykcyjne), wstrząsając z prędkością 250 rpm.
  4. Wysiej 50 μL kultury regeneracyjnej na 10mm płytce Petri z agarem LB, uprzednio ogrzaną do 37°C, zawierającą chloramphenicol oraz odpowiednie stężenie antybiotyku selekcyjnego dla plazmidu docelowego.
    Uwaga nr 2: Dąż do wysiania komórek w stężeniu zbliżonym do „pełnego trawnika” (near lawn). Stężenie „near lawn” definiuje się jako wyraźną, ale niepoliczalną liczbę kolonii (>10 kolonii/ płytka 10mm). Stopień rozcieńczenia przed wysianiem, jeśli jest wymagany, zależy od poziomu elektrokompetencji komórek. Jeśli komórki nie są wystarczająco elektrokompetentne i nie udaje się uzyskać efektu „near lawn” przy wysiewaniu kultury regeneracyjnej w postaci niezmodyfikowanej, odwiruj kulturę regeneracyjną przez 2 minuty przy 40rpm, odlej nadsącz, ponownie zawieś komórki w 50 μL pożywki LB i wysiej kulturę.
  5. Inkubuj płytkę(i) Petri przez noc w temperaturze 37°C.

3. Mutageneza: Odzyskiwanie plazmidu

  1. Następnego dnia wypłucz szalki Petriego, pipetując 2 mL bulionu LB na komórki. Przenieś kolonie bakteryjne z szalek z agarem LB do bulionu LB, „zeskrobując” je z powierzchni płytki za pomocą wysterylizowanej szklanej pręciki w kształcie trójkąta. Dodaj najpierw 1 mL bulionu LB, zbierz płuczynę, a następnie powtórz procedurę z drugą porcją 1 mL bulionu LB.
  2. Wyizoluj plazmidowe DNA z płuczyny z płytki. (To plazmidowe DNA stanowi bibliotekę).
    Uwaga nr 3: Płuczyna zebrana z płytki LB może być zbyt gęsta, aby przeprowadzić mini-prep w całej objętości. W takim przypadku przeprowadź mini-prep maksymalnej ilości określonej przez zestaw do mini-prep (zazwyczaj wiąże się to z rozcieńczeniem płuczyny do OD=1 i przygotowaniem ~3 mL rozcieńczonej kultury) lub przejdź do maxi-prep

4. Iteracja

  1. Przetraw 1μg wyizolowanego plazmidowego DNA enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje plazmid LF-Pol I, ale nie tnie plazmidu docelowego (Supplementary Fig 1).
  2. Oczyść produkt trawienia restrykcyjnego za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
    Uwaga #4: Ten etap usuwa wszelkie ślady enzymu restrykcyjnego i jego buforu. Jest to niezbędne, aby utrzymać niskie stężenie soli podczas późniejszych transformacji do komórek elektrokompetentnych.
  3. Ponownie transformuj 30-250ng przetrawionej biblioteki plazmidów docelowych do świeżych komórek JS20 LF-Pol I, aby poddać bibliotekę kolejnym rundom mutagenezy.
    Uwaga #5: Linearyzacja plazmidu Pol I za pomocą enzymu restrykcyjnego zapewnia, że transformowany jest tylko plazmid docelowy.
  4. Powtórz sekcje 2 i 3.

5. Odczyt

  1. Poddaj izolowany DNA plazmidowy trawieniu enzymem (enzymami) restrykcyjnym, który linearyzuje zarówno plazmid docelowy, jak i plazmid Pol I. Przeprowadź elektroforezę produktów trawienia na 1% żelu agarozowym, aby ocenić ilość i jakość plazmidów. Do analizy zazwyczaj wystarczające jest trawienie ~40ng izolowanego DNA plazmidowego.
  2. Poddaj 1μg izolowanego DNA plazmidowego trawieniu enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje plazmid LF-Pol I, ale nie przecina plazmidu docelowego.
  3. Oczyść produkt trawienia restrykcyjnego za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
  4. Wprowadź przetrawioną bibliotekę plazmidów docelowych do szczepu odczytującego w celu scharakteryzowania mutacji.

II. Przesiewanie mutantów i analiza cech z wykorzystaniem płytek do wzrostu gradientowego.

Aby zilustrować, w jaki sposób ogromna różnorodność genetyczna obecna w naszych bibliotekach może być powiązana z selekcją funkcjonalną, przedstawiamy tutaj protokół selekcji funkcjonalnych opartych na lekach in vivo w E. coli. Metoda ta opiera się na wzroście wzdłuż gradientu leku na stałym agarze. Pozwala to na jednoczesną charakterystykę wielu próbek (do 12) w zakresie różnych stężeń, zapewniając szerszy zakres dynamiczny niż pojedyncza obróbka lekiem. Kolejną zaletą jest to, że nieliniowy odczyt tego testu niweluje niewielkie różnice w żywotności w zakresie do dwukrotności. Tym samym ten test oporności na cytotoksyczność stanowi solidny i szybki sposób selekcji bibliotek mutantów oraz określenia profilu fenotypowego poszczególnych mutantów. Ryc. 2 przedstawia przykład każdego z tych zastosowań: panel A pokazuje selekcję poszczególnych mutantów z biblioteki ludzkiej oksydacyjnej demetylazy ABH2. Kolonie rosnące powyżej progu WT są selekcjonowane ze względu na zwiększoną ochronę przed cytotoksycznością wywołaną przez czynnik metylujący, metanosulfonian metylu (MMS) 7. Panel B przedstawia przykład gradientów wykorzystywanych do charakterystyki poszczególnych klonów. Poziom oporności na antybiotyk z grupy cefalosporyn trzeciej generacji, cefotaksym, pokazano na gradiencie agarowym dla β-laktamazy WT oraz dla dwóch mutantów o szerokim spektrum, R164H i E104K R164S G267R 4. Należy zauważyć, że w zależności od siły obserwowanych efektów, do odpowiedniego ilościowania może być konieczne użycie więcej niż jednej płytki: podczas gdy gradient 0,4mg/ml pozwala na bezpośrednie porównanie z klonami kontrolnymi, poziom oporności najsilniejszego mutanta można ustalić jedynie przy użyciu wyższego stężenia cefotaksymu (4mg/mL).

Materiały

  • Sprzęt
    • Kwadratowe płytki Petri 10x100x15mm (Fisher Sci #087571A)
    • Okrągła płytka Petri 10mm
    • Szklane szkiełko mikroskopowe 25x75x1mm (Fischer Sci #125015)
    • Probówka graduowana 50 mL
  • Pożywki
    • Agar LB: roztopiony i wyrównany w kąpieli wodnej w temperaturze 56°C
      Uwaga #6: temperatura pożywki może wpływać na stabilność, a tym samym na aktywność badanego leku lub związku.
    • Agar miękki: roztopiony i wyrównany w kąpieli wodnej do 42°C

1. Przygotowanie gradientu

  1. Zaznacz dziesięć pasów, rozmieszczonych równomiernie wzdłuż jednej krawędzi dna kwadratowej płytki Petriego.
  2. Umieść płytkę pod kątem tak, aby zaznaczona krawędź dna była uniesiona o 7 mm;
    jako podkładka do uniesienia płytki można wykorzystać gruby kłos trawy lub inny płaski przedmiot. Wlej do nachylonej płytki 25 mL ciepłego (~56°C) agaru LB, dobrze wymieszanego z odpowiednim stężeniem czynnika selekcyjnego. Stanowi to dolną warstwę gradientu. Upewnij się, że agar LB równomiernie pokrywa płytkę Petriego w taki sposób, aby na uniesionym, zaznaczonym końcu płytki znajdowało się ~1 mm agaru LB, a w części obniżonej ~8 mm agaru LB. Następnie pozostaw agar do zastygnięcia na 10-15 minut.
    Uwaga nr 7: W przypadku hydrofobowych czynników selekcyjnych do agaru LB można dodać 0,1% surfaktantu (emulsji antypiankowej B), aby ułatwić zawieszenie i równomierny rozkład leku. Dodaj surfaktant do ciepłego, sterylnego agaru LB przy energicznym wstrząsaniu przed dodaniem czynnika selekcyjnego. Surfaktant powinien utworzyć gęstą mgiełkę małych kropli; duże krople wskazują, że pożywka jest zbyt gorąca, co może utrudnić równomierny rozkład badanego leku.
  3. Po stwardnieniu pierwszej porcji 25 mL agaru LB przenieś płytkę na płaską powierzchnię. Następnie wlej 25 mL agaru LB bez czynnika selekcyjnego, aby pokryć powierzchnię pierwszej warstwy agaru LB. Jest to górna warstwa gradientu. Upewnij się, że agar LB pokrywa całą powierzchnię dolnej warstwy. Przykryj płytkę niedomkniętą pokrywką w celu zapewnienia wentylacji i pozostaw agar do zastygnięcia na 10-15 minut.
    Uwaga nr 8: Należy pamiętać o zagrożeniu aerozolami i potencjalnej lotności badanego związku; wylewaj gradienty w dygestorium chemicznym lub biologicznym, jeśli wymagają tego zasady bezpieczeństwa chemicznej.
    Uwaga nr 9: Płytki z gradientem należy wykorzystać w ciągu 4 h, aby zachować gradient stężenia leku lub badanego związku.

2. Transfer bakter za pomocą stempla

  1. Miękki agar należy wyrównać do temperatury 42°C. Przenieś 2 mL ciekłego miękkiego agaru do pokrywki lub dna okrągłej szalki Petriego o średnicy 10 mm. Pipetuj 40 μL kultury bakteryjnej do miękkiego agaru, a następnie wymieszaj, kołysząc szalką.
    Uwaga nr 10: Stadium wzrostu kultury bakteryjnej może wpływać na jej odpowiedź na lek lub związek testowy. W celu uzyskania jednolitych wyników należy konsekwentnie stosować kultury w fazie logarytmicznej lub kultury nocne w fazie stacjonarnej. Gęstość komórek może również zniekształcać wyniki względne, dlatego wszystkie kultury powinny zostać rozcieńczone do tych samych wartości gęstości A60. Kultury nocne należy rozcieńczyć tak, aby gęstość A60 była mniejsza niż 1,0.
  2. Pokryj długą krawędź szklanego preparatu mikroskopowego mieszaniną miękkiego agaru. Następnie, dopasowując pokrytą krawędź szkiełka do dolnej oznaczenia (od niskiego do wysokiego stężenia) na szalce gradientowej, dotknij powierzchnią szkiełka agaru. Lekkie dotknięcie jest wystarczające, aby przenieść pasek miękkiego agaru na powierzchnię gradientu. Szkiełko należy następnie odstawić do oczyszczenia i ponownego użycia.
  3. Powtórz ten proces dla pozostałych próbek bakteryjnych. Na każdej szalce gradientowej powinny znaleźć się próbki referencyjne, jeśli wykonywanych jest wiele gradientów.
  4. Inkubuj szalkę gradientową dnem do góry przez noc w temperaturze 37°C. Czas i temperatura inkubacji mogą się różnić w zależności od analizowanych szczepów bakteryjnych, ale inkubacja nocna w 37°C jest zazwyczaj wystarczająca do uzyskania widocznego wzrostu.

3. Obrazowanie i analiza wzrostu

  1. Obrazowanie: Po nocnej inkubacji gradienty można obrazować bezpośrednio lub utrwalić i zabarwić roztworem 0,2mg/mL Akrydyny Pomarańczowej w 95% EtOH w celu zwiększenia kontrastu. Płytkę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 5 min w roztworze barwiącym, a następnie płucze 95% EtOH i obrazuje nad pudłem z lampą UV.
    Uwaga #1: Należy uważać, aby nie spłukać kolonii z płytki; zamiast tego należy delikatnie przelewać roztwór barwiący i płuczący po płytce, usuwając roztwory z narożników.
  2. W celu analizy fenotypowej poszczególnych plazmidów mutantów, odległość wzrostu w gradiencie stężeń normalizuje się do wzorca na każdym gradiencie. Te wartości względne można następnie porównywać pomiędzy gradientami.
    Uwaga #12: W zależności od charakteru efektu cytotoksycznego można zaobserwować ostrą lub bardziej rozmytą krawędź (porównać np. Panele A i B na Rys. 2). W przypadku krawędzi rozmytych zaleca się pomiar krawędzi ciągłego wzrostu, ponieważ poszczególne kolonie wykazują tendencję do zwiększonej zmienności.
  3. W przypadku selekcji biblioteki izoluje się i sekwencjonuje poszczególne kolonie, które rosną przy stężeniach wyższych niż w przypadku kontrolnego szczepu dzikiego, aby zidentyfikować mutacje przyczyniające się do zwiększonej ochrony.

III. Reprezentatywne wyniki:

Schemat procesu mutagenezy; metody wysiewu na podłoże ciekłe i bezpośredniego; transformacja, izolacja DNA, odczyt wyników.
Rysunek 1. Porównanie protokołów mutagenezy z wykorzystaniem hodowli w cieczy oraz bezpośredniego wysiewu na podłoże stałe. Przedstawiony tutaj protokół mutagenezy z bezpośrednim wysiewaniem na podłoże (na dole) jest szybszy i wymaga mniej etapów niż nasz pierwotny protokół mutagenezy w środowisku ciekłym (na górze). W przypadku użycia GFP jako reportera, różnice w fluorescencji świadczą o różnorodności genetycznej obecnej w bibliotece. Zazwyczaj jeden cykl mutagenezy skutkuje powstaniem 12–18% kolonii o wyraźnie obniżonym poziomie fluorescencji.

Test hamowania wzrostu bakterii, efekt gradientu leku, porównanie mutantów, wyniki elektroforezy żelowej.
Rycina 2. Testy oporności gradientowej. Panel A Selekcja w kierunku zwiększonej oporności na metylo-metanosulfonian (MMS). Wyselekcjonowano biblioteki plazmidowe ludzkiej oksydacyjnej demetylazy ABH2 pod kątem zwiększonej oporności na MMS. Przedstawiono dwie takie biblioteki, reprezentujące dwie i cztery iteracje protokołu mutagenezy, w porównaniu z rodzimym typem dzikim (WT) oraz pustym wektorem (Δ). Biała linia oznacza próg, powyżej którego odizolowano poszczególne kolonie mutantów do dalszej analizy fenotypowej. Panel B Ochrona cefotaksymem, wskazująca na aktywność β-laktamaz o rozszerzonym spektrum. R164H i E104K R164H G267R, dwa mutanty beta-laktamazy zidentyfikowane wcześniej po mutagenezie LF-Pol I w połączeniu z selekcją aztreonamem 4, są przedstawione na 0.4μg/mL oraz a 4μg/mL gradient cefotaksymu. Należy zauważyć, że enzym β-laktamaza typu dzikiego nie zapewnia żadnej ochrony w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję pustego wektora, Δ. Zatem mutanty te reprezentują ewolucję nowej aktywności biochemicznej 8,9.

Wykres częstotliwości mutacji RNA/DNA; odległość od miejsca inicjacji w funkcji tempa mutacji.
Rycina 3. Częstotliwość mutacji w zależności odległości od ori (d). Częstotliwość mutacji po jednym cyklu mutagenezy metodą bezpośredniego wysiewu przedstawiono w interwałach 10 bp względem przełącznika RNA/DNA pochodzenia replikacyjnego ColE1. Obszar między 160 a 240 nie został przedstawiony, ponieważ β-laktamaza nie stanowi neutralnego celu. Punkty poza obszarem β-laktamazy reprezentują interwały 20 bp ze względu na ogólnie niską częstotliwość mutacji w tym regionie. Trend (równanie dwumianowe, z R2=0,41) przedstawiono w formie linii.

Schemat elektroforezy żelowej w agarozie przedstawiający prążki rozdziału Pol I i plazmidu docelowego.
Rysunek uzupełniający 1. Plazmid Pol I zawierający LF Pol I. A Sekwencja (format FastA). Informacje o sekwencji służące do wyboru odpowiedniego enzymu (lub enzymów) restrykcyjnych do linearyzacji plazmidu Pol I, zarówno na potrzeby iteracji (etap 4: generowanie biblioteki losowych mutacji), jak i odczytu (etap 5). B Ogólna charakterystyka i mapa restrykcyjna plazmidu. Przedstawiono położenie pochodzenia replikacji pSC101, markera oporności na chloramfenikol (CAT) oraz genu LF-Pol I. Wskazano również położenie pojedynczych miejsc restrykcyjnych.

Biblioteka Posiew bezpośredniKultura płynna
(1 dzień)		Kultura płynna
(3 dni)
Mutacje (#) 9540142
Zsekwencjonowane klony28896190
Całkowite pokrycie (bp)182,0102,00213,0
Częstość mutacji (x103 bp)0.520.390.67
Częst. d<10 (x103 bp)0.920.410.70

Tabela 1. Częstości mutacji. Częstości (wyrażone jako liczba mutacji/bp) dla d<10, tj. w obrębie 10 bp sąsiadujących z przełącznikiem RNA/DNA, dla trzech protokołów mutagenezy: bezpośredniego wysiewu na płytki, nasycenia w cieczy (1 dzień) oraz hipersaturacji w cieczy (3 dni).

  Posiew bezpośredni ciecz
Mutacje (#) 95182
Spektrum (%)   
z A na GA do G6.319.2
 T na C4.23.8
    
C na TG na A27.413.7
 C na T35.835.2
    
A do TA do T5.38.2
 T do A5.37.1
    
T na GT na G1.11.1
 Od A do C0.02.2
    
G na TG na T1.12.7
 C do A2.12.7
    
C na GC do G2.11.1
 G do C5.32.7
    
IndeleIns3.20.0
 Usuń1.10.0
    
 A do N11.629.7
 G do N33.719.2
 T do N10.512.1
 C do N40.039.0
    
 Ts73.772.0
 Tv22.128.0
 Indele4.20

Tabela 2. Metryki mutacji dla posiewu bezpośredniego i mutagenezy w cieczy. Tabela przedstawia liczbę obserwowanych mutacji (liczba bezwzględna) oraz spektrum mutacji (w %) po jednym cyklu mutagenezy. Spektrum jest szczegółowo opisane w podziale na pary komplementarne, zmiany nukleotydowe oraz typ mutacji.

Dyskusja

Niniejszy artykuł przedstawia protokół mutagenezy umożliwiający generowanie dużych, losowych bibliotek mutantów bez konieczności klonowania lub stosowania PCR. Metoda ta opiera się na replikacji z błędami plazmidu kodującego sekwencję budzącą zainteresowanie. Teoretycznie mutacje powinny być w dużej mierze ograniczone do regionu 100-300 bp znajdującego się bezpośrednio w dół nurtu przełącznika RNA/DNA, co odpowiada rozmiarowi produktu pośredniego nici liderowej wytwarzanego przez Pol I 2,10. Stwierdzono, że w warunkach przedstawionych w niniejszym protokole mutacje Pol I występują w całym plazmidzie, choć ich częstotliwość maleje wraz ze wzrostem odległości od ori plazmidu (Rysunek 3). Wynik ten sugeruje, że przejście lub „przełączenie” z Pol I na Pol III podczas replikacji plazmidu ColE1 jest znacznie bardziej stopniowe, niż zgłaszano wcześniej, przynajmniej w naszych warunkach eksperymentalnych 2, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami sugerującymi funkcjonalną redundancję między Pol I a Pol III 11.

Nasz pierwotny protokół opisywał mutogenezę w kulturach płynnych (4). Protokół ten daje 0,41 mutacji/kb dla d<1000, tj. w obrębie 1000 bp sąsiadujących z przełącznikiem RNA/DNA (Tabela 1). Hipersaturacja poprzez pozostawienie kultury płynnej w inkubatorze z wytrząsaniem przez 3 dni bez dodawania świeżych mediów zwiększa częstotliwość mutacji do 0,70 mutacji/kb, ale skutkuje bardzo niską wydajnością plazmidów (mniej niż 1% w porównaniu z dniem 1.; dane nie pokazano) (Tabela 1). Przedstawiamy tutaj uproszczony protokół oparty na bezpośrednim wysiewaniu transformacji docelowego plazmidu na stały agar w temperaturze 37 °C (Rycina 1). Procedura ta generuje najwyższą częstotliwość mutacji/cykl mutogenezy (0,92 mutacji/kb dla d<1000) i znacznie ułatwia iterację. Zmiana warunków hodowli na media stałe wpływa również na spektrum mutacji (Tabela 2). Mutogeneza z bezpośrednim wysiewem zmniejsza wyraźną asymetrię między substytucjami komplementarnych par zasad obserwowaną w kulturze płynnej (porównaj C→T vs. G→A oraz A→G vs. T→C). Z drugiej strony, bezpośredni wysiew spowodował powstanie większej liczby indeli (wzrost z mniej niż 0,5% do 4%) i 3-krotne zmniejszenie liczby mutacji A→G, co doprowadziło do nadreprezentacji mutacji G/C (74%). Ogólnie uważamy, że większa prostota i zwiększona wydajność przedstawionego tutaj protokołu z bezpośrednim wysiewem przeważają nad korzyściami wynikającymi z nieco bardziej zrównoważonego spektrum mutacji uzyskiwanego w mutogenezie płynnej.

W obrębie plazmidu docelowego mutacje generowane naszą metodą nie są ograniczone wyłącznie do pożądanej sekwencji docelowej. Jednak ewolucja nowych aktywności biochemicznych powinna zależeć od mutacji w obrębie genu docelowego, ponieważ stanowią one zmianę jakościową, a nie ilościową. Zatem połączenie naszej mutagenezy plazmidowej z przesiewaniem mutantów na płytkach z gradientem wykorzystuje atuty naszego systemu (rozległe biblioteki oraz możliwość selekcji) w celu ewolucji nowych właściwości biochemicznych. Inne zastosowania randomowej mutagenezy, takie jak optymalizacja istniejących aktywności enzymatycznych lub randomizacja specyficznych obszarów genu, wymagają klonowania po przeprowadzeniu randomowej mutagenezy. W takim przypadku posiadanie biblioteki w plazmidzie, w przeciwieństwie do produktu amplifikacji PCR, zwiększa efektywność klonowania poprzez ułatwienie amplifikacji i restrykcji.

Podsumowując, prezentujemy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla danego genu docelowego, który wyróżnia się prostotą oraz różnorodnością generowanych bibliotek. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta może być powiązana z selekcjami funkcjonalnymi w celu efektywnej ewolucji nowych aktywności biochemicznych. Ponadto nasze biblioteki generowane in vivo mogą być łatwo klonowane, co umożliwia mutogenezę specyficzną dla miejsca lub optymalizację istniejących aktywności.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana z funduszy grantu K08 nr CA116429-04 przyznanego MC oraz z grantu fundacji Conquer Cancer Now (CONCERN) nr 8501

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
karbenycylinaCellgro46100R6stężenie końcowe 0,1 mg/ml
tetracyklinaFisher ScientificBP7640stężenie końcowe 0,05 mg/ml
chloramphenikolGenlantisM120100stężenie końcowe 0,03 mg/ml
Agar LB MillerFisher ScientificBP1425
Pożywka LB MillerDifco Laboratories244620
Miękki agarDifco Laboratories214580Przygotowano we własnym zakresie
Pomarańcz akrydynowySigma-AldrichA38401-1
emulsja przeciwpieniąca Antifoam BSigma-AldrichA5757
GlicerolAcros Organics332030025
szalka kwadratowa 100x100x15mmFisher Scientific0875711A
szalka Petriego 100 mm Fisher Scientific0875712A
Przedmiot szkiełko przedmiotowe 25x75x1mmZłota Pieczęć3048
Elektroporator 2510Eppendorf
Elektroporator 2510Eppendorf
probówki z 2-milimetrową przerwąMolecular BioProducts5520
Zestaw Zippy mini prepZymo Research Corp.D4020

Bibliografia

  1. Camps, M. Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression. Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).
  2. Itoh, T., Tomizawa, J. Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).
  3. Polisky, B. ColE1 replication control circuitry: sense from antisense. Cell. 55, 929-932 (1988).
  4. Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).
  5. Shinkai, A., Loeb, L. A. In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection. J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).
  6. Uyemura, D., Lehman, I. R. Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation. J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).
  7. Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases. Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).
  8. Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. The 'evolvability' of promiscuous protein functions. Nat Genet. 37, 73-76 (2005).
  9. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).
  10. Itoh, T., Tomizawa, J. FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).
  11. Bryan, S. K., Moses, R. E. Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees. C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mutageneza bia ekpolimeraza o niskiej wierno cigenerowanie biblioteki mutant wselekcja gradientem lekutransformacja plazmidowaanaliza trawienia restrykcyjnegometoda nak adki z mi kkiego agaruscreening fenotypu wzrostu
Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.