Metoda osadzania kolonii drożdży

Summary

Metoda osadzania kolonii drożdży pozwalająca na sekcje dla mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten umożliwia określenie rozmieszczenia komórek zarodnikowych i komórek pseudostrzępkowych w koloniach, zapewniając nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w społeczności grzybów.

Abstract

Tworzenie różnych typów komórek w zarodkach jest kluczowym mechanizmem w rozwoju metazoanów. Społeczności mikroorganizmów, takie jak kolonie i biofilmy, również wykazują wzorce typów komórek. Na przykład u drożdży S. cerevisiae komórki zarodnikowe i komórki pseudostrzępkowe nie są równomiernie rozmieszczone w koloniach. Funkcjonalne znaczenie wzorców i mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw tych wzorców, są nadal słabo poznane.

Jednym wyzwaniem związanym z badaniem wzorców typów komórek w koloniach grzybów jest to, że w przeciwieństwie do tkanki metazoan, komórki w koloniach są stosunkowo słabo połączone ze sobą. W szczególności kolonie grzybów nie zawierają tak rozległego poziomu macierzy zewnątrzkomórkowej, jak w większości tkanek . W tym artykule przedstawiamy metodę osadzania i dzielenia kolonii drożdży, która ujawnia wewnętrzne wzorce typów komórek w tych koloniach. Metoda może być stosowana do przygotowania grubych skrawków (0,5 μ) przydatnych w mikroskopii świetlnej oraz cienkich skrawków (0,1 μ) nadających się do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Komórki workowe i pseudostrzępkowe można łatwo odróżnić od jajowatych komórek drożdży za pomocą mikroskopii świetlnej , podczas gdy wewnętrzną strukturę tych komórek można uwidocznić za pomocą EM.

Metoda opiera się na otoczeniu kolonii agarem, infiltracji ich pożywką Spurra, a następnie dzieleniu na sekcje. Do tego protokołu nadają się kolonie o średnicy w zakresie 1-2 mm. Oprócz wizualizacji wnętrza kolonii, metoda umożliwia wizualizację regionu kolonii, który atakuje leżący pod spodem agar.

Protocol

1. Izolacja i utrwalenie kolonii

1. Inkubować 300 kolonii na podłożu agarowym przez wskazany czas (izolowana kolonia powinna mieć średnicę 1-2 mm).
2. Usuń kolonię (przodem do góry) i podłoże za pomocą wąskiej szpatułki.
3. Umieść kilka kropli 2% agaru w temperaturze 42°C na szkiełku mikroskopowym za pomocą końcówki pipetmana o pojemności 1 ml i natychmiast umieść kolonię na agarze stroną do góry, zanim stwardnieje.
4. Umieść kilka kropli 2% agaru w temperaturze 42°C na kolonii i pozostaw do zestalenia.
5. Nosić rękawice na wszystkich etapach pozostałej części tego protokołu
6. Przycinaj blok żyletką i umieść go w 3,5 ml fiolki z ....

Discussion

Przedstawiona metoda odsłania wewnętrzne struktury kolonii. Ponieważ metoda ta jest skuteczna w określaniu wzorców typów komórek w szeregu szczepów S. cerevisiae o różnej morfologii kolonii, a także w pokrewnym gatunku S. paradoxus ⁵, metoda ta prawdopodobnie będzie również działać na szerokim zakresie grzybów i innych mikroorganizmów.

Jednym z kluczowych kroków dla powodzenia metody jest zapewnienie, że cała kolonia, w tym wierzchołek kolonii, jest otoczona agarem przez .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetratlenek osmu	Mikroskopia elektronowa Sciences	RT 19152
Formy do zatapiania silikonu	Fisher Scientific	NC 9975029
Cykloalifatyczny żywica epoksydowa	Mikroskopia elektronowa Nauki	RT 15004	ERL 4221
Żywica epoksydowa	Mikroskopia elektronowa Nauki	RT 13000	DER 736
Bezwodnik	nonenylobursztynowyMikroskopia elektronowa Nauki	RT 19050	NSA
2-dimetyloamina– tanol	Mikroskopia elektronowa Sciences	RT 13300	DMAE
Media montażowe	KPL Inc	71-00-16
Koło	obrotowe Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Mikrotom	Leica Microsystems	Ultracut S