Metoda zatapiania kolonii drożdży

Podsumowanie

Metoda zatapiania kolonii drożdży umożliwiająca wykonywanie przekrojów do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten pozwala na określenie rozmieszczenia komórek zsporulowanych i komórek pseudohifowych w obrębie kolonii, stanowiąc nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w obrębie społeczności grzybowej.

Streszczenie

Tworzenie wzorów rozmieszczenia różnych typów komórek w embrionach jest kluczowym mechanizmem rozwoju organizmów wielokomórkowych. Społeczności mikroorganizmów, takie jak kolonie i biofilmy, również wykazują wzorce rozmieszczenia typów komórek. Na przykład w drożdżach S. cerevisiae komórki sporulacyjne oraz komórki pseudohifalne nie są rozmieszczone w koloniach w sposób jednorodny. Funkcjonalne znaczenie tych wzorców oraz molekularne mechanizmy leżące u ich podstaw nie są jeszcze dobrze poznane.

Jednym z wyzwań w badaniu wzorców typów komórek w koloniach grzybów jest fakt, że w przeciwieństwie do tkanek metazoicznych, komórki w koloniach są ze sobą stosunkowo słabo związane. W szczególności kolonie grzybów nie zawierają tak rozbudowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, jaka występuje w większości tkanek. Przedstawiamy tutaj metodę zatapiania i krojenia kolonii drożdży, która pozwala ujawnić wewnętrzne wzorce typów komórek w tych koloniach. Metodę tę można wykorzystać do przygotowania grubych przekrojów (0.5 μ) użytecznych w mikroskopii świetlnej oraz cienkich przekrojów (0.1 μ) odpowiednich do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą mikroskopii świetlnej można łatwo odróżnić worki i komórki pseudoryzowe od owalnych komórek drożdżowych, natomiast strukturę wewnętrzną tych komórek można zwizualizować za pomocą EM.

Metoda ta opiera się na otaczaniu kolonii agarem, infiltracji ich pożywką Spurra, a następnie wykonywaniu skrawków. Do tego protokołu odpowiednie są kolonie o średnicy w zakresie 1-2 mm. Oprócz wizualizacji wnętrza kolonii metoda ta pozwala na obrazowanie obszaru kolonii naciekającego do leżącego poniżej agaru.

Protokół

1. Izolacja i fiksacja kolonii

1. Inkubować 300 kolonii na podłożu agarowym przez wskazany czas (izolowana kolonia powinna mieć średnicę 1-2 mm).
2. Przenieść kolonię (stroną górną do góry) wraz z podkładem z podłoża, używając wąskiej szpatułki.
3. Nanieść kilka kropel 2% agaru o temperaturze 42°C na szkiełko przedmiotowe za pomocą końcówki do pipety 1 mL i natychmiast umieścić kolonię na agarze stroną górną do góry, zanim on zestaleje.
4. Nanieść kilka kropel 2% agaru o temperaturze 42°C na kolonię i pozostawić do zastygnięcia.
5. Przez wszystkie kolejne etapy niniejszego protokołu należy używać rękawiczek.
6. Przyciąć blok żyletką i umieścić go w borokrzemianowej fiolce z nakrętką o pojemności 3,5 mL zawierającej fiksatyw 2% paraformaldehydu/2% glutaraldehydu na 7 dni w temperaturze 4°C.

2. Płukanie i traktowanie osmem

1. Po około 1 tygodniu, w dygestorium chemicznym, przemyć bloki agaru w temperaturze 0°C, inkubując dwukrotnie przez 15 minut w ilości 0,15M kacodylanu sodu (pH 7,2) wystarczającej do całkowitego przykrycia kolonii (około 1,5 mL), a następnie dwukrotnie przez 5 minut w takiej samej objętości 1X buforu OS (10 mM KH₂PO₄ 10 mM MgCl₂, pH 6,0).
2. W dygestorium chemicznym dodać do probówek (w temperaturze 0°C) taką samą objętość 1% OsO₄ [2 mL OsO₄ (2%) + 2 mL 2x buforu OS], aby przykryć bloki agaru, inkubować przez 1 godzinę, a następnie przemyć dwukrotnie taką samą ilością 1X buforu OS przez 10 minut każdego razem.
3. Pozostawić probówki na noc w temperaturze 4°C w 1X buforze OS.
4. Utrawialnik oraz wszystkie płukanki z tego etapu należy zutylizować jako odpady niebezpieczne. Wszystkie pipety zawierające OsO₄ zostały trzykrotnie wypłukane olejem roślinnym.

3. Płukanie i odwodnienie

1. Następnego ranka kostki agaru należy dwukrotnie przemyć na lodzie zimną wodą (w tej samej objętości co powyżej), po 10 minut każdego płukania, używając pipety Pasteura.
2. Następnie należy przemywać sekwencyjnie taką samą objętością etanolu o stężeniach 25%, 50%, 75% i 95% przez 10 minut dla każdego stężenia, a następnie dwukrotnie przemyć 10% etanolem przez 10 minut. Przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w 10% etanolu.
3. Wszystkie odpady z płukania na tym etapie należy zutylizować jako odpady niebezpieczne.

4. Preparacja Spurra

1. Następnego ranka (tak wcześnie, jak to możliwe) odważ następujące roztwory (EM Sciences) do jednorazowego plastikowego zlewka pod wyciągiem w celu przygotowania odczynnika Spurra. Podczas wszystkich kolejnych prac z użyciem tego odczynnika należy nadal korzystać z wyciągu.
   (roztwór ERL 421 5 g)
   (roztwór DER 736 4 g)
   (roztwór NSA 13 g)
2. Mieszaj te roztwory (powoli) przez 20 minut pod wyciągiem, używając mieszadełka magnetycznego
3. Dodaj 0,15 g roztworu DMAE i mieszaj przez 20 minut w opisany wyżej sposób.
4. Odgazuj powyższą mieszaninę przez 1-2 h pod wyciągiem.

5. Infiltracja metodą Spurra

1. Niezwłocznie po przygotowaniu odczynnika Spurra przemyć bloki agarowe 5 razy w 10% etanolu o temperaturze pokojowej (objętość taka sama jak powyżej), po 10 minut na każdy cykl. Po ostatnim płukaniu etanolem usunąć go za pomocą pipety Pasteura w taki sposób, aby pozostały etanol ledwie zakrywał bloki agarowe.
2. Dodać w przybliżeniu taką samą ilość odczynnika Spurra (około 0,5 mL) i obracać fiolki na rotatorze przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie pozostawić na 30 minut. Po 30 minutach całkowicie usunąć roztwór za pomocą pipety Pasteura, dodać odczynnik Spurra tak, aby zakrył blok agarowy (około 1,5 mL), obracać fiolki na rotatorze przez 15 minut w temperaturze pokojowej i pozostawić na 30 minut. Powtórzyć wymianę odczynnika Spurra, rotację i inkubację jeszcze 3 razy.
3. Po ostatnich 30 minutach usunąć odczynnik Spurra i dodać świeży odczynnik Spurra, aby zakryć bloki. Pozostawić bloki agarowe w temperaturze pokojowej na 4 h.
4. Wymienić odczynnik Spurra i obracać próbki przez noc.
5. Rano wymienić odczynnik Spurra i pozostawić w rotacji do następnego dnia.
6. Następnego ranka nalać odczynnik Spurra do ponumerowanych form silikonowych (Fisher Scientific) tak, aby zakrył jedynie dno form, a następnie umieścić w nich bloki agarowe. Inkubować w 60°C przez 4 godziny.
7. Po 4 h dopełnić formy odczynnikiem Spurra i inkubować w 60°C przez noc.
8. Jeśli po wyjęciu bloków z form są one nadal lekko elastyczne, należy je zwrócić do form i inkubować przez dodatkowe 2 dni.

6. Przygotowanie skrawków

1. Do wycinania skrawków o grubości 0,5 μ do mikroskopii świetlnej oraz cienkich skrawków o grubości 0,1 μ do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (EM) wykorzystano mikrotom Leica Ultracut S.
2. W przypadku mikroskopii świetlnej wycinane skrawki umieszczano w kropli dH₂O, a następnie suszono na bloku grzewczym o temperaturze 52°C. Wysuszone skrawki barwiono kroplą 1,0 % błękitu toluidyny w 1% boranie sodu przez 5–15 sekund. Po barwieniu skrawki bezzwłocznie płukano pod strumieniem wody, suszono, zamykano w medium montażowym (KPL) i zabezpieczano próbkę szkiełkiem nakrywkowym.

7. Reprezentatywne wyniki:

Szeroki zakres zastosowań pomiaru formowania wzorów u drożdży i innych mikroorganizmów został omówiony w poprzednich publikacjach ¹. Szczególną uwagę zwraca zwiększona funkcjonalność zorganizowanych kolonii drobnoustrojów w porównaniu do społeczności niezorganizowanych.

Opisana metoda jest modyfikacją metody osadzania większych wyspecjalizowanych kolonii ², a krótki opis wprowadzonych przez nas modyfikacji został opublikowany ³.

Przykład mikrofotografii świetlnej przekroju przez środek kolonii dzikich drożdży S. cerevisiae przedstawiono na Rysunku 1. Łatwo rozróżnić woreczki, pseudohyfy oraz jajowate komórki drożdży, a widoczny jest również obszar kolonii wrastającej w znajdujący się poniżej agar.

Przykład mikrografii elektronowej szczepu laboratoryjnego drożdży (tło W303) przedstawiono na Rysunku 2. Obraz pochodzi z obszaru kolonii zawierającego wysoką częstotliwość komórek sporulujących.

Rycina 1. Mikroskopia świetlna kolonii dzikiego drożdża. Drożdże te (YPS13) zostały niedawno wyizolowane z eksudatów drzewnych. ⁴Kolonię inkubowano przez 6 dni na podłożu YNA. ⁵ przed wykonaniem przekrojów. Otwarte strzałki wskazują reprezentatywne worki, wypełnione strzałki wskazują reprezentatywne jajowate komórki wegetatywne, a wypełnione groty strzałek wskazują łańcuchy wydłużonych komórek (pseudohify) oraz worki.

Rycina 2. Mikroskopia elektronowa laboratoryjnego szczepu drożdży. Kolonię SH1020 (tło W303) inkubowano przez 6 dni na podłożu YNA przed wykonaniem przekrojów. ³Zdjęcie przedstawia obszar przekroju z dużą częstotliwością występowania workowców. Strzałka wskazuje dwuwarstwową strukturę ściany zarodnika.

Rycina 3. Ilościowe oznaczenie rozkładu komórek sporulujących w koloniach: A) na centralny obszar obrazu przekroju kolonii nakłada się siatkę zawierającą 15 sąsiadujących ze sobą prostokątów ułożonych w stos wzdłuż ich dłuższego boku. Siatka jest skalowana przy zachowaniu stałych proporcji tak, aby pokrywała dokładnie górną i dolną krawędź kolonii. (B & C) Odsetek komórek zsporulowanych w każdym prostokącie w stosunku do całkowitej liczby komórek w tym prostokącie określono na podstawie wizualnej oceny obrazów kolonii 4-dniowych (B) i 8-dniowych (C). Na przykład prostokąt znajdujący się w górnej części kolonii (oznaczony jako „1”) odpowiada lewej stronie wykresu. Przedstawiono średnią z 4 kolonii; słupki błędu wskazują błąd standardowy.

Dyskusja

Przedstawiona metoda ujawnia struktury wewnętrzne kolonii. Ponieważ metoda ta jest skuteczna w określaniu wzorców typów komórek w szerokim zakresie szczepów S. cerevisiae o różnej morfologii kolonii, a także u pokrewnego gatunku S. paradoxus ⁵, prawdopodobnie znajdzie ona zastosowanie również w przypadku wielu grzybów i innych mikroorganizmów.

Kluczowym krokiem dla powodzenia tej metody jest zapewnienie, aby cała kolonia, w tym jej górna część, była przez cały czas trwania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tetroksyd osmu	Electron Microscopy Sciences	RT 19152
Silikonowe formy do zatapiania	Fisher Scientific	NC 9975029
Cykloalifatyczna żywica epoksydowa	Electron Microscopy Sciences	RT 15004	ERL 4221
Żywica epoksydowa	Electron Microscopy Sciences	RT 13000	DER 736
Beznonylowy bezwodnik bursztynowy	Electron Microscopy Sciences	RT 19050	NSA
2-Dimetyloamino–etanol	Electron Microscopy Sciences	RT 13300	DMAE
Medium montażowe	KPL Inc	71-00-16
Koło obrotowe	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Mikrotom	Leica Microsystems	Ultracut S