Ulepszona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków przy użyciu komórek z mikrowzorem

Summary

Adhezyjne mikrowzorce, które normalizują architekturę komórkową, mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości wykrywania efektów działania leków, poprawy odtwarzalności oraz uproszczenia automatycznego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia będzie korzystna dla testów przesiewowych leków/siRNA, przeprowadzanych na konwencjonalnych podłożach hodowli komórkowych i w konsekwencji cierpiących na nadmierną zmienność między komórkami.

Abstract

Do tej pory, większość badań HCA (High Content Analysis) jest przeprowadzana z przylegającymi liniami komórkowymi hodowanymi na jednorodnym podłożu na mikropłytkach poddanych hodowli tkankowej. W tych warunkach komórki rozprzestrzeniają się i dzielą we wszystkich kierunkach, co powoduje nieodłączną zmienność kształtu, morfologii i zachowania komórek. Wysoka zmienność międzykomórkowa w całej populacji utrudnia powodzenie HCA, zwłaszcza w przypadku opracowywania leków. Zdolność mikrowzorów do normalizacji kształtu i wewnętrznej polaryzacji każdej pojedynczej komórki daje ogromną szansę na rozwiązanie tego krytycznego wąskiego gardła ^1-2.

Aby ułatwić dostęp i korzystanie z technologii mikrowzorów, CYTOO opracowało gamę gotowych do użycia mikrowzorów, dostępnych w formatach szkiełek nakrywkowych i mikrodołków. W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe protokoły wszystkich procedur, od wysiewu komórek na mikrowzorcach CYTOOchip, leczenia farmakologicznego, utrwalania i barwienia po automatyczną akwizycję, automatyczne przetwarzanie obrazu i końcową analizę danych. Na tym przykładzie pokazujemy, w jaki sposób mikrowzorce mogą ułatwić testy oparte na komórkach. Zmiany cytoszkieletu komórkowego są trudne do ilościowego określenia w komórkach hodowanych na jednorodnych podłożach, ale hodowla komórek na mikrowzorcach powoduje powtarzalną organizację siatki aktynowej dzięki systematycznemu pozycjonowaniu kontaktów adhezyjnych komórek w każdej komórce. Taka normalizacja architektury wewnątrzkomórkowej pozwala na ilościowe określenie nawet niewielkiego wpływu na cytoszkielet aktynowy, jak wykazano w tym zestawie protokołów z użyciem blebbistatyny, inhibitora interakcji aktyna-miozyna.

Protocol

1. Przygotowanie komórek i wysiewanie na mikrowzorcach

1. Umieść 2 chipy CYTOOchips w 2 niezależnych dołkach na 6-dołkowej płytce, upewniając się, że w prawym dolnym rogu chipa CYTOOchip znajduje się napis "CYTOO". Mikrowzory mogą być znakowane fluorescencyjnie barwnikami Cy3 lub Cy5. CYTOOChips użyte w tym eksperymencie mają fluorescencyjnie znakowane mikrowzory Cy3.
   ostrożność: Trzymaj frytki w ciemności.
2. Zbierz komórki HeLa (~80% zlewające się) przez trypsynizację. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są prawidłowo rozproszone przez leczenie trypsyną. Zebrać i odwirować komórki w ilości 300 g przez 4 minuty, a następnie delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy. Policz komórki i rozcieńcz do stężenia 15 000 komórek/ml w ukończonych pożywkach hodowlanych DMEM/F12.
3. Dozuj 4 ml (60 000 komórek) do każdej studzienki zawierającej CYTOOchip.
   ostrożność: Płytka powinna być przesuwana tak rzadko, jak to możliwe, aby uniknąć wywoływania jakichkolwiek ruchów obrotowych w podłożu, ponieważ będzie to miało tendencję do koncentracji komórek w środku.
4. Pozwól komórkom osadzać się przez 10 minut pod maską, a następnie przenieś je do inkubatora komórkowego. Po 10-20 minutach komórki zaczną przylegać do mikrowzorów. Po 10 minutach regularnie sprawdzaj pod mikroskopem.
5. Jak tylko komórki się zgrzebią, zmień podłoże komórkowe i delikatnie przepłucz powierzchnię szkiełka nakrywkowego, postępując zgodnie z następującą procedurą:
6. Trzymając płaską płytkę, delikatnie zassać pożywkę pipetą z boku studzienki.
   ostrożność: Nigdy nie pozwól, aby chip wyschł, oznacza to, że nigdy nie odsysaj całego płynu, ale pozostaw wystarczająco dużo, aby przykryć CYTOOchip przez cały czas.
7. Dodaj 4 ml PBS i ponownie zassaj, zaczynając od środka chipa, a następnie przesuwając się na bok dołka. Odessać PBS zgodnie z opisem, nie wystawiając chipa na działanie powietrza. Powtórz 3-4 razy.
8. Sprawdź pod mikroskopem pływające komórki:
   • Jeśli pozostanie duża liczba pływających komórek, powtórz procedurę mycia.
   • Jeśli widzisz bardzo mało komórek, odessij część PBS i zastąp ją 2 ml świeżej pożywki. Odessać i dodać dwukrotnie 4 ml świeżej pożywki.
9. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C z 5% CO₂ na co najmniej trzy godziny, aby umożliwić komórkom pełne rozłożenie się.
   nuta: Korzystając z tej metody, od 10 do 30% (2000-6500) mikrowzorów będzie zajętych przez jedną lub wiele komórek.
   ostrożność: Czas potrzebny na przyleganie komórek przed etapem mycia oraz czas potrzebny do pełnego rozprowadzenia komórek na mikrowzorach będzie specyficzny dla każdej linii komórkowej.

2. Leczenie blebbistatyną

1. Rozpuścić bróbstatynę w 100% DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 17 mM. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do 5 mM 100% DMSO. Wykonać końcowe rozcieńczenie w pożywce hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM blibistatyny w 0,1% DMSO.
2. Dla warunków kontrolnych należy przygotować 4 ml pożywki zawierającej tylko 0,1% DMSO.
3. Odessać pożywkę na komórkach i zastąpić ją pożywką o pojemności 4 ml przygotowaną do warunków poddanych działaniu substancji i kontrolnych.
4. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

3. Utrwalanie komórek i barwienie aktyny

1. Przygotowanie roztworu do utrwalania komórek
   Patrz sekcja dotycząca odczynników, aby uzyskać informacje na temat przygotowania buforu cytoszkieletu (CB) i PFA 5%. CB jest szczególnie polecany do znakowania fluorescencyjnego filamentów aktynowych i mikrotubul.
   • Przygotuj 1xCB-sacharozę: dodaj 1 g sacharozy do 2 ml CB.
     Włączenie sacharozy pomaga zachować wewnętrzne struktury komórkowe.
   • Przygotuj 4% sacharozy PFA-CB: Dodaj 1 ml 1xCB-sacharozy do 4 ml ciepłego PFA 5%.
     ostrożność: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4°C tylko przez kilka dni.
2. Utrwalanie PFA
   • Za pomocą kleszczy podnieś chip CYTOOchip z logo CYTOO i umieść go (bez mycia) w studzience 6-dołkowej płytki zawierającej 2 ml 4% roztworu PFA-CB-sacharozy
   • Inkubacja 10 minut w RT
   • Usuń PFA-CB-sacharozę i przemyj raz PBS
   • Wykonaj drugie płukanie 2 ml 100 mM NH₄Cl przez 10 minut, aby ugasić resztkową aktywność sieciowania PFA
     nuta: Szkiełka podstawowe PFA mogą być przechowywane w PBS przez kilka dni w temperaturze 4°C przed barwieniem organelli w celu obrazowania fluorescencyjnego.
3. Przepuszczalność błony komórkowej za pomocą Triton X-100
   Przenikanie komórek detergentem umożliwia przenikanie przeciwciał lub innych sond przez błonę komórkową i eliminuje część cytozolowej puli białek cytoszkieletu, które w przeciwnym razie mogą zmniejszać kontrast polimerów cytoszkieletu, utrudniając analizę ich lokalizacji.
   • Usunąć NH₄Cl i dodać 2 ml/studzienkę 0,1% Triton X-100-CB przez 3 minuty w temperaturze pokojowej
   • Przemyć dwukrotnie 2 ml PBS
4. Barwienie aktyny
   Falloidyna fluorescencyjna, która wiąże się tylko z natywną aktyną, służy do barwienia włókien aktynowych.
   • Dodać 2 ml falloidyny sprzężonej z FITC rozcieńczonej w stosunku 1:2000 w PBS z 1,5% BSA
   • Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej
   • Przemyć raz 2 ml PBS
5. Barwienie jąder
   • Dodać 2 ml Hoechst (zabarwienie 1 μg/ml w PBS)
   • Inkubacja 3 minuty w temperaturze pokojowej
   • Umyj 2 razy 2 ml PBS
6. Montaż zjeżdżalni
   • Podnieś chipy CYTOOchip z logo CYTOO i zamontuj CYTOOchip na standardowym szkiełku mikroskopowym za pomocą 25-30 μl Mowiol lub innego rozwiązania montażowego.

4. Konfiguracja mikroskopu i automatyczna akwizycja obrazu

Istnieje wiele pakietów oprogramowania do obrazowania, które sterują mikroskopem w celu szybkiego, automatycznego pozyskiwania i wyświetlania obrazów. W tym przykładzie wykorzystano oprogramowanie do obrazowania Metamorph, a automatyczne akwizycje są wykonywane na mikroskopie Nikon Eclipse Ti wyposażonym w kamerę CCD Hamamatsu i oświetlacz światłowodu rtęciowego Intensilight. Obrazy są rejestrowane przy 20-krotnym powiększeniu w trzech długościach fal odpowiadających DAPI (jądra), Cy-3 (mikrowzory) i FITC-falloidyna (aktyna). Liczba mikrowzorów wizualizowanych na pole będzie się różnić w zależności od ustawień kamery i obiektywu. Mikrowzorce CYTOO są rozmieszczone w określonych odstępach od siebie (100 lub 130 μm) w poprzek chipa, co znacznie ułatwia akwizycję.

1. Wybierz 20-krotne powiększenie
2. Otwórz Pozyskiwanie wielowymiarowe (na pasku menu: Aplikacje/Akwizycja wielowymiarowa) i skonfiguruj różne parametry eksperymentu:
   • Liczba długości fal: 3
   • Typy długości fal: DAPI, FITC, Cy3
   • Ustaw czas ekspozycji dla każdej długości fali, najpierw skupiając się na polu komórek
   • Autofokus może być wykonywany na każdej długości fali
   • Wybierz, gdzie chcesz zapisać dane
3. Wybierz długość fali Cy3 i ustaw kamerę tak, aby 12 mikrowzorów zostało zwizualizowanych i wyśrodkowanych w polu kamery (4 kolumny i 3 rzędy wzorów).
4. Utwórz arkusz z uruchomioną akwizycją wielowymiarową. Procedura tworzenia dziennika jest opisana na rysunku 1.
5. Otwórz funkcję Etap skanowania (na pasku menu: Urządzenia/Stół/Stolik skanowania). Aby uzyskać 24 obrazy, z których każdy zawiera 12 mikrowzorów przy 20-krotnym powiększeniu, wprowadź 6 kolumn i 4 wiersze z rozmiarem kroku -400 μm X i rozmiarem kroku Y 300 μm. W polu Ustaw arkusz do wykonania przekaż dziennik MDA. JNL. Następnie naciśnij Skanuj, aby rozpocząć automatyczną akwizycję całego bloku w trzech długościach fali.
   nuta: Wskazane tutaj rozmiary kroków X i Y będą się różnić w zależności od liczby mikrowzorów obecnych w polu kamery. W zależności od konfiguracji sceny, kierunek w X i/lub Y może wymagać wartości ujemnych dla ruchu we właściwym kierunku.

5. Zautomatyzowane przetwarzanie i analiza obrazu

Istnieje wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów. Opisane poniżej procedury przedstawiają etapy przetwarzania i analizy obrazu wykonywane przez 2 niestandardowe makra napisane dla programu open source ImageJ. Pierwsze makro CellRef tworzy komórkę referencyjną, drugie przeciwprostokątne mierzy sztywność/zapadnięcie się błony komórkowej. Oba są dostępne na żądanie za pośrednictwem www.cytoo.com.

1. Utwórz stosy obrazów dla wszystkich trzech kanałów wyśrodkowanych na mikrowzorcach (makro CellRef).
   Zastosowanie mikrowzorów pozwala uniknąć grupowania i zlepiania się komórek, co znacznie upraszcza pierwszy krok w zautomatyzowanym przetwarzaniu obrazu, jakim jest lokalizacja i segmentacja poszczególnych komórek. Obrazy mikrowzorów znakowane fluorescencyjnie są używane do definiowania i wyznaczania regionów wyśrodkowanych na mikrowzorcach. Obszary te są następnie transponowane na obrazy uzyskane w innych kanałach i przycinane. Odpowiednie przycięte obrazy są następnie łączone w stosy dla każdej długości fali. Stos RGB jest również tworzony w wyniku połączenia trzech kanałów (ilustracja 2).
2. Stosowanie filtru zaznaczania pojedynczej komórki (makro Odnośnik_komórki)
   Jak wskazano powyżej, 10-30% (2000-6500) mikrowzorów jest zajmowanych przez pojedynczą komórkę lub wiele komórek, podczas gdy pozostałe mikrowzorce są puste. Aby wybrać obrazy, które pokazują mikrowzory zajmowane tylko przez pojedynczą komórkę, makro wykrywa liczbę jąder na obrazie i eliminuje ze wszystkich stosów (RGB i różne długości fal) te, które zawierają więcej niż jedno jądro lub nie zawierają żadnych jąder (ryc. 3).
3. Wyeliminuj nieznormalizowane i nierozciągnięte komórki w poprzek mikrowzorca za pomocą filtra odcięcia obszaru komórki (makro CellRef)
   Aby usunąć dzielące się komórki, które uciekłyby z filtra jąder, stosuje się inny filtr wykorzystujący kanał FITC dla aktyny. Obliczana jest powierzchnia komórki, a te poniżej pewnego odcięcia (obszary komórek około 2 razy mniejsze niż obszary komórek interfazowych) są usuwane ze wszystkich stosów. Obszar obwiedni komórki jest określany przez rozmiar wzoru.
4. Wyrównywanie obrazów komórek (makro Odnośnik komórki)
   Z poprzednich etapów wybrano obrazy zawierające pojedyncze komórki z mikrowzorami. Mimo że obrazy te koncentrują się na mikrowzorcach, nigdy nie są one idealnie wyrównane względem siebie. Aby zakończyć przetwarzanie obrazu, stosowana jest wtyczka ImageJ (MultiStackReg) do wyrównania wszystkich zebranych obrazów i wszystkich kanałów w oparciu o położenie mikrowzorca. Ten krok generuje wyrównane stosy pojedynczych obrazów, które można teraz wykorzystać do analizy pojedynczej komórki lub utworzenia komórki referencyjnej (rysunek 4)
5. Budowanie komórki odwołania (makro Odnośnik_komórki)
   Hodowanie komórek na mikrowzorach oznacza, że wszystkie komórki mają podobne kształty. Ta normalizacja pozwala na precyzyjne wyrównanie i nałożenie wielu obrazów komórek. Sumowanie sygnału na każdym obrazie w całym stosie pozwala na wizualizację i zmierzenie "średniego efektu leku". Ostateczny ogólny obraz lub komórka referencyjna jest unikalnym i użytecznym narzędziem do reprezentacji i analizy obrazu i można go uzyskać tylko za pomocą komórek z mikrowzorami (ryc. 4). W ImageJ komórka referencyjna jest tworzona przez wykonanie rzutowania przefiltrowanych i wyrównanych obrazów ze stosu (Image>Stacks>Z-project). Można zastosować kilka metod projekcji, takich jak średnia lub maksymalna intensywność, ale zwykle wybierana jest projekcja medianowa, która eliminuje główne wartości odstające stosu obrazów. Aby ułatwić analizę wyników, stosowana jest tablica LUT (Look Up Tables) konwertująca obraz monokolorowy na mapę częstotliwości oznaczoną kolorami.
6. Pomiar i kwantyfikacja parametrów będących przedmiotem zainteresowania (makro przeciwprostokątna)
   W tym artykule wideo zastosowano L-mikrowzorce, ponieważ forma ta organizuje cytoszkielet aktynowy w jedno główne włókno stresu. Podkreślając aktynę w ten sposób, wpływ blebbitatyny na cytoszkielet można określić na wiele sposobów: mierząc zmiany krzywizny włókna naprężeniowego aktyny, intensywność barwienia, długość lub grubość włókna naprężeniowego, zmiany cech morfometrycznych włókien aktyny lub kształtu komórki itp. Parametry te mogą być mierzone zarówno na obrazach pojedynczych komórek, jak i na samej końcowej komórce referencyjnej.
   W tym przypadku wpływ blibstatyny 5 μM scharakteryzowano poprzez zliczenie liczby zapadniętych komórek za pomocą drugiego makra ImageJ o nazwie Hypotenuse (ryc. 7). Krótko mówiąc, progowe obrazy L-mikrowzorca są używane do zdefiniowania teoretycznej przeciwprostokątnej kształtu trójkąta komórkowego. Następnie przeprowadza się progowanie obrazów barwionych aktyną w celu przybliżenia rzeczywistego kształtu komórki. Następnie mierzy się obszar między teoretyczną przeciwprostokątną trójkąta komórkowego a rzeczywistą wklęsłą błoną komórkową. Kiedy komórka zapada się, pojawia się obszar pod teoretyczną przeciwprostokątną. Odsetek zapadniętych komórek służy do porównania warunków kontrolnych i leczonych.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady tego, jak powinny wyglądać komórki na mikrowzorcach natychmiast i kilka godzin po krytycznych krokach mycia opisanych w 1.6-1.8, są pokazane na rysunku 5. Po 15 minutach na CYTOOchips obserwuje się okrągłe komórki HeLa w równych odległościach, co wskazuje, że przylegały do mikrowzorów fibronektyny (ryc. 5a). Adhezja jest całkowita, gdy komórki pozostają unieruchomione pomimo delikatnego potrząsania naczyniem hodowlanym. Aby zminimalizować liczbę mikrowzorów zajmowanych przez wiele komórek, chipy są następnie przepłukiwane PBS w celu usunięcia komórek unoszących się nad obszarami cytofobicznymi. Po kilku godzinach komórki, które są w pełni rozciągnięte na mikrowzorcach, będą wyglądać jak te pokazane na rysunku 5b.

Typowe obrazy pojedynczych komórek uzyskane po inkubacji komórek z blebbistatyną, utrwaleniem i barwieniem aktyny i jąder są przedstawione na rysunku 6. Po zautomatyzowanym pozyskaniu wielu obrazów i przetworzeniu obrazu za pomocą makra ImageJ CellRef generowana jest mapa częstotliwości oznaczona kolorami, która przedstawia intensywność aktyny uśrednioną na wszystkich obrazach komórek (ryc. 6c i 6f). Porównanie komórki referencyjnej dla schorzeń nieleczonych i leczonych pokazuje potencjał tego podejścia w zakresie łatwej obserwacji badanego fenotypu i jest szczególnie przydatne do badania komórkowych skutków leków.

Przykład jednej z możliwych analiz wpływu blebbistatyny na komórki jest przedstawiony na rysunku 7. Pokazano liczbę zapadniętych komórek (tj. komórek z pustym obszarem występującym pod teoretyczną przeciwprostokątną) wykrytych w 50 komórkach kontrolnych i 50 komórkach poddanych działaniu blibistatyny 5 μM, jak wykryto za pomocą makra przeciwprostokątnej ImageJ. Zwiększona liczba zapadniętych komórek w populacji leczonej blebbistatyną odzwierciedla rozluźnienie włókien stresowych, a tym samym napięcie błony spowodowane hamowaniem przez blebbistatynę sił skurczowych promieniowców w komórce.

Rysunek 1. Procedura tworzenia nowego dziennika za pomocą Metamorph.

Rysunek 2. Schemat blokowy procedury automatycznego przetwarzania obrazu.

Rysunek 3. Filtrowanie pojedynczych komórek.

Rysunek 4. Budowanie komórki referencyjnej.

Rysunek 5. Wysiewanie komórek. A) Komórki Hela przylegające do mikrowzorów po etapie płukania (powiększenie 4x) B) Komórki HeLa po pełnym rozprowadzeniu na mikrowzorcach L (powiększenie 10x).

Rysunek 6. Porównanie komórek niewzorzystych i mikrowzorcowych w warunkach kontrolnych i leczonych lekami. Komórki HeLa wysiewano przez 3 godziny i traktowano 5 μM blibistatyną przez 1 godzinę (dolny panel) lub pozostawiono bez leczenia (górny panel). W kontrolnych komórkach niewzorzystych (a) aktyna składa się w wiele włókien, które niezauważalnie rozpadają się po potraktowaniu 5 μM blibistatyną (d). Na L-mikrowzorcach komórki kontrolne przyjmują trójkątny kształt (b) i rozwijają główne włókno aktynowe (włókno stresowe) między 2 wierzchołkami L. W porównaniu z komórkami bez wzoru (d), blebbistatyna indukuje poważną zmianę fenotypową na komórkach L-mikrowzorcowych (e). Bezpośrednia wizualizacja efektów działania leku oraz porównanie stanów kontrolnych i leczonych może być szybko zwizualizowane dzięki prezentacji Reference Cell zbudowanej z 20 komórek. Podobnie jak w przypadku pojedynczych komórek, w kontrolnej komórce referencyjnej (c) obecne jest przezroczyste i intensywne włókno stresowe, podczas gdy komórki traktowane blebbistatyną zapadają się, a główne włókno stresu zanika (f).

Rysunek 7. Przykład analizy wpływu bróbstatyny na komórki za pomocą makro Hypothenuse. Podczas gdy 25% komórek kontrolnych było zapadniętych, liczba ta wzrosła 3-krotnie do 75% w komórkach leczonych blibistatyną 5 μM, odzwierciedlając osłabioną sieć skurczową promienicy (n = 50 komórek).

Discussion

Wybór mikrowzoru

Podczas gdy efekty blibstatyny 5 μM są ledwo wykrywalne na standardowych podłożach hodowlanych, możliwa jest skuteczna kwantyfikacja mikrowzorców, które koncentrują aktynę w jednym głównym włóknie stresowym. Poprawia to wizualizację cytoszkieletu aktynowego, pomagając w dokładnym określeniu ilościowym wpływu blebbistatyny na komórkę. Wybór kształtu mikrowzoru ma kluczowe znaczenie w projektowaniu testu i jest projektowany zgodnie ze zmianą fenotypową, która ma zostać podkreślona w badaniu.

Wnioski

Mikrowzorce ułatwiają wizualizację i kwantyfikację działania leków, zwłaszcza przy niskich stężeniach. Zastąpienie jednorodnych płaskich substratów mikrowzorcami adhezyjnymi w testach komórkowych poprawia dokładność, czułość i jakość uzyskiwanych danych. W związku z tym do analizy potrzeba mniej komórek, aby uzyskać wiarygodne wyniki statystyczne ³. Mikrowzorce adhezyjne dają realną szansę na ulepszenie badań funkcjonalnych i zbadanie zmian fenotypowych przy niższych stężeniach leków w celu uniknięcia wywoływania toksycznych lub pośrednich skutków leku. Jeśli stosowane są odpowiednie platformy przesiewowe, mikrowzorce mogą sprostać wymaganiom firm farmaceutycznych w zakresie ulepszania aplikacji do badań przesiewowych genów/leków. Kilka dodatkowych przykładów ostatnich publikacji, w których wykorzystano mikrowzorce do analizy i kwantyfikacji zjawisk komórkowych, jest cytowanych poniżej ^3-13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CYTOOchips 20x20 L-M-FN	CYTOO	10-114	CYTOOchips są dostępne do adsorpcji wybranego białka
PBS 1x	GIBCO, firmy Life Technologies	14040-091
Komora liczenia (Kova slide)	Prolabo	71287.01
DMEM/F-12 + Glutamax-I	GIBCO, firmy Life Technologies	25300-054
FBS (surowica bydlęca)	Laboratoria PAA	31331-028
Penicylina & Streptomycyna	PAA Laboratories	A15-101
6-dołkowa płytka	Wirówka	do 353046
	Fisher Scientific	M65838
Mikroskop	Nikon Instruments
Bufor cytoszkieletu 1X (CB)	Sigma-Aldrich	MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889	10 mM MES pH 6,1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S2395
PFA 32 %	Mikroskopia elektronowa Sciences	15714
PFA 5%			Wymieszaj 10 ml PFA 32% z 54 ml tabletek CB 1.185X
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
PBS	GIBCO, firmy Life Technologies	18912-014
Albumina surowicy Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7806
Phallodin-FITC	Sigma-Aldrich	P5282
H– scht	Invitrogen	H3570
Blebbistatin	Euromedex	BN0640
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
NH4Cl 0,1M	Sigma-Aldrich	M11209
Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon Instruments	Eclipse Ti
CCD Camera	TBC	TBC
Oprogramowanie	ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/