Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.
Artykuł metodologiczny
Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Do tej pory większość badań HCA (High Content Analysis) przeprowadzano z wykorzystaniem adhezyjnych linii komórkowych hodowanych na jednorodnym podłożu w mikropłytkach przeznaczonych do hodowli tkankowych. W takich warunkach komórki rozprzestrzeniają się i dzielą we wszystkich kierunkach, co prowadzi do naturalnej zmienności kształtu, morfologii i zachowania komórek. Wysoka wariancja międzykomórkowa w całej populacji utrudnia sukces analiz HCA, szczególnie w procesie opracowywania leków. Zdolność mikrowzorów do normalizacji kształtu i polarności wewnętrznej każdej poszczególnej komórki stwarza ogromną szansę na rozwiązanie tego krytycznego problemu 1-2.
Aby ułatwić dostęp i wykorzystanie technologii mikrowzorowania, firma CYTOO opracowała szereg gotowych mikrowzorów, dostępnych w formatach szkiełek nakrywkowych i mikroworków. W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe protokoły wszystkich procedur: od wysiewania komórek na mikrowzory CYTOOchip, przez traktowanie lekiem, fiksację i barwienie, aż po zautomatyzowaną akwizycję, zautomatyzowane przetwarzanie obrazów i końcową analizę danych. Na tym przykładzie ilustrujemy, w jaki sposób mikrowzory mogą usprawnić testy komórkowe. Zmiany w cytoszkielecie komórkowym są trudne do ilościowego określenia w komórkach hodowanych na jednorodnych podłożach, natomiast hodowla komórek na mikrowzorach prowadzi do powtarzalnej organizacji sieci aktynowej dzięki systematycznemu rozmieszczeniu kontaktów adhezyjnych w każdej komórce. Taka normalizacja architektury wewnątrzkomórkowej pozwala na kwantyfikację nawet niewielkich efektów w obrębie cytoszkieletu aktynowego, co zostało zademonstrowane w tym zestawie protokołów z wykorzystaniem blebbistatyny, inhibitora oddziaływania aktyna i miozyny.
Protokół
1. Przygotowanie komórek i ich wysiew na mikrowzory
- Umieść 2 płytki CYTOOchips w dwóch oddzielnych dołkach płytki 6-dołkowej, upewniając się, że napis „CYTOO” znajduje się w prawym dolnym rogu CYTOOchip.
Mikrowzory mogą być znakowane fluorescencyjnie barwnikami Cy3 lub Cy5. Płytki CYTOOChips użyte w tym eksperymencie posiadają mikrowzory znakowane fluorescencyjnie Cy3.
OSTROŻNIE: Przechowywać płytki w ciemności. - Zebierz komórki HeLa (~80% konfluencji) poprzez trypsynizację. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki zostały prawidłowo rozdzielone po traktowaniu trypsyną. Zbierz komórki i odwiruj je przy 300g przez 4 min, a następnie delikatnie zresuspenduj osad komórkowy. Policz komórki i rozcieńcz je do stężenia 15 000 cells/ mL w pełnej pożywce hodowlanej DMEM/F12.
- Dodaj 4 mL (60 000 cells) do każdego dołka zawierającego CYTOOchip.
OSTROŻNIE: Płytkę należy przesuwać jak najmniej, aby uniknąć wywołania ruchów obrotowych pożywki, ponieważ może to prowadzić do koncentracji komórek w centrum. - Pozostaw komórki do osadzenia na 10 min pod dygestorium, a następnie przenieś je do inkubatora komórkowego. Po 10-20 min komórki zaczną przylegać do mikrowzorów. Po 10 min regularnie kontroluj proces pod mikroskopem.
- Gdy tylko komórki przywrą, wymień pożywkę komórkową i delikatnie przepłucz powierzchnię szkiełka przedmiotowego zgodnie z poniższą procedurą:
- Trzymając płytkę poziomo, delikatnie odessaj pożywkę pipetą z boku dołka.
OSTROŻNIE: Nigdy nie dopuszczaj do wyschnięcia płytki; oznacza to, że nie wolno odessać całego płynu, lecz zawsze pozostawić go tyle, aby pokrywał CYTOOchip. - Dodaj 4 mL PBS i ponownie odessać, zaczynając od środka płytki, a następnie przesuwając się w stronę boku dołka. Odessać PBS w opisany sposób, nie narażając płytki na kontakt z powietrzem. Powtórzyć 3-4 razy.
- Sprawdzić pod mikroskopem obecność pływających komórek:
- Jeśli pozostaje duża liczba pływających komórek, powtórzyć procedurę płukania.
- Jeśli widać bardzo mało komórek, odessać część PBS i zastąpić ją 2 mL świeżej pożywki. Odessać i dodać 4 mL świeżej pożywki dwukrotnie.
- Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C z 5% CO2 na minimum trzy godziny, aby umożliwić komórkom pełne rozprzestrzenienie się.
UWAGA: Stosując tę metodę, od 10-30% (2000-6500) mikrowzorów zostanie zajętych przez pojedyncze lub wiele komórek.
OSTROŻNIE: Czas potrzebny na przywrastanie komórek przed etapem płukania oraz czas niezbędny do pełnego rozprzestrzenienia się komórek na mikrowzorach będą specyficzne dla każdej linii komórkowej.
2. Traktowanie blebbistatyną
- Rozpuścić blebbistatinę w 100% DMSO, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 17 mM. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 5 mM przy użyciu 100% DMSO. Przygotować końcowe rozcieńczenie w pożywce hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM blebbistatyny w 0,1% DMSO.
- Dla warunków kontrolnych przygotować 4 mL pożywki zawierającej wyłącznie 0,1% DMSO.
- Odssać pożywkę z komórek i zastąpić ją 4 mL pożywki przygotowanej dla warunków traktowanych i kontrolnych.
- Inkubować komórki przez 1hr w temperaturze 37°C.
3. Fiksacja komórek i barwienie aktyny
- Przygotowanie roztworów do fiksacji komórek
Przygotowanie buforu do cytoszkieletu (CB) oraz PFA 5% opisano w sekcji odczynników. CB jest szczególnie zalecany do znakowania fluorescencyjnego filamentów aktynowych i mikrotubul.- Przygotuj 1xCB-sacharoza: dodaj 1 g sacharozy do 2 mL CB.
Dodatek sacharozy pomaga w zachowaniu wewnętrznych struktur komórkowych. - Przygotuj 4% PFA-CB-sacharoza: dodaj 1 mL 1xCB-sacharoza do 4 mL ciepłego PFA 5%.
UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4°C tylko przez kilka dni.
- Przygotuj 1xCB-sacharoza: dodaj 1 g sacharozy do 2 mL CB.
- Fiksacja PFA
- Za pomocą pęsety chwyć CYTOOchip za logo CYTOO i umieść go (bez przemywania) w dołku płytki 6-dołkowej zawierającej 2 mL roztworu 4% PFA-CB-sacharoza
- Inkubuj przez 10 min w RT
- Usuń PFA-CB-sacharoza i przemyj raz PBS
- Wykonaj drugie przemywanie 2 mL 100 mM NH4Cl przez 10 min w celu zneutralizowania resztkowej aktywności sieciującej PFA
UWAGA: Preparaty utrwalone PFA można przechowywać w PBS przez kilka dni w temperaturze 4°C przed barwieniem organelli do obrazowania fluorescencyjnego.
- Permeabilizacja błony komórkowej za pomocą Triton X-100
Permeabilizacja komórek detergentem umożliwia przeciwciałom lub innym sondom przeniknięcie przez błonę komórkową i eliminuje część cytosolowej puli białek cytoszkieletu, co w przeciwnym razie mogłoby zmniejszyć kontrast polimerów cytoszkieletu, utrudniając analizę ich lokalizacji.- Usuń NH4Cl i dodaj 2 mL/dołek 0,1% Triton X-100-CB na 3 min w RT
- Przemyj dwukrotnie 2 mL PBS
- Barwienie aktyny
Do barwienia filamentów aktynowych stosuje się fluorescencyjną faloidynę, która wiąże się wyłącznie z natywną aktyną.- Dodaj 2 mL faloidyny sprzężonej z FITC, rozcieńczonej 1:2000 w PBS z 1,5% BSA
- Inkubuj przez 1 h w RT
- Przemyj raz 2 mL PBS
- Barwienie jąder komórkowych
- Dodaj 2 mL Hoechst (barw stężeniem 1μg/ mL w PBS)
- Inkubuj przez 3 min w RT
- Przemyj 2 razy 2 mL PBS
- Montowanie preparatu
- Chwyć CYTOOchips za logo CYTOO i zamontuj CYTOOchip na standardowym szkiełku mikroskopowym, używając 25-30 μL Mowiolu lub innego medium montażowego.
4. Konfiguracja mikroskopu i zautomatyzowana akwizycja obrazów
Istnieje wiele pakietów oprogramowania do obrazowania, które sterują mikroskopem w celu szybkiego, zautomatyzowanego pozyskiwania i wyświetlania obrazów. W tym przykładzie zastosowano oprogramowanie do obrazowania Metamorph, a automatyczne akwizycje są wykonywane na mikroskopie Nikon Eclipse Ti wyposażonym w kamerę CCD Hamamatsu oraz iluminator rtęciowo-włóknowy Intensilight. Obrazy są pozyskiwane przy powiększeniu 20x w trzech długościach fal odpowiadających DAPI (jądra komórkowe), Cy-3 (mikrowzory) oraz FITC-Phalloidin (aktyna). Liczba mikrowzorów widocznych w jednym polu widzenia będzie się różnić w zależności od konfiguracji kamery i obiektywu. Mikrowzory CYTOO są rozmieszczone w określonych odstępach od siebie (100 lub 130 μm) na całym chipie, co znacznie ułatwia akwizycję.
- Wybierz powiększenie 20x
- Otwórz funkcję Multidimensional Acquisition (w pasku menu: Apps/Multidimensional Acquisition) i ustaw poszczególne parametry eksperymentu:
- Liczba długości fal: 3
- Typy długości fal: DAPI, FITC, Cy3
- Ustaw czas ekspozycji dla każdej długości fali, uprzednio ustawiając ostrość na polu z komórkami
- Autofokus może zostać wykonany dla każdej długości fali
- Wybierz miejsce zapisu danych
- Wybierz długość fali Cy3 i ustaw kamerę tak, aby w polu widzenia widocznych było 12 wycentrowanych mikrowzorów (4 kolumny i 3 rzędy wzorów).
- Utwórz dziennik uruchamiający MultiDimensional Acquisition. Procedura tworzenia dziennika została opisana na Rysunku 1.
- Otwórz funkcję Scan stage (w pasku menu: Devices/Stage/Scan Stage). Aby pozyskać 24 obrazy, z których każdy zawiera 12 mikrowzorów przy powiększeniu 20x, wprowadź 6 kolumn i 4 rzędy z rozstawem kroków -400 μm w osi X i 300 μm w osi Y. W sekcji Set Journal to Execute wgraj dziennik MDA.JNL. Następnie naciśnij Scan, aby rozpocząć zautomatyzowaną akwizycję całego bloku w trzech długościach fal.
UWAGA: Wskazane tutaj wartości kroków w osi X i Y będą różnić się w zależności od liczby mikrowzorów znajdujących się w polu widzenia kamery. W zależności od konfiguracji stolika, kierunek w osi X i/lub Y może wymagać wartości ujemnych dla ruchu w odpowiednim kierunku.
5. Zautomatyzowane przetwarzanie i analiza obrazów
Istnieje wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów. Opisane poniżej procedury przedstawiają etapy przetwarzania i analizy obrazu wykonywane przez 2 niestandardowe makra napisane dla programu open source ImageJ. Pierwsze makro, CellRef, tworzy komórkę referencyjną, a drugie, Hypotenuse, mierzy sztywność lub zapadanie się błony komórkowej. Oba są dostępne na zapytanie za pośrednictwem strony www.cytoo.com.
- Utworzenie stosów obrazów dla wszystkich trzech kanałów wycentrowanych na mikrowzorach (makro CellRef).
Stosowanie mikrowzorów zapobiega grupowaniu i skupianiu się komórek, co znacznie upraszcza pierwszy krok zautomatyzowanego przetwarzania obrazów, jakim jest lokalizacja i segmentacja poszczególnych komórek. Obrazy mikrowzorów znakowanych fluorescencyjnie służą do definiowania i wyznaczania obszarów wycentrowanych na mikrowzorach. Obszary te są następnie przenoszone na obrazy pozyskane w innych kanałach i wycinane. Odpowiadające im wycięte obrazy są następnie łączone w stosy dla każdej długości fali. Tworzony jest również stos RGB z połączenia trzech kanałów (Rycina 2). - Zastosowanie filtra wyboru pojedynczych komórek (makro CellRef)
Jak wskazano powyżej, 10-30% (2000-6500) mikrowzorów jest zajętych przez pojedynczą komórkę lub wiele komórek, podczas gdy pozostałe mikrowzory są puste. Aby wybrać obrazy przedstawiające mikrowzory zajęte przez tylko jedną komórkę, makro wykrywa liczbę jąder na obraz i usuwa ze wszystkich stosów (RGB i różnych długości fal) te, które zawierają więcej niż jedno jądro lub nie zawierają żadnego jądra (Rycina 3). - Eliminacja komórek nienormalizowanych oraz takich, które nie są w pełni rozciągnięte na mikrowzorze, przy użyciu filtra odcięcia powierzchni komórki (makro CellRef)
Aby usunąć dzielące się komórki, które mogłyby uniknąć filtra jąder, stosowany jest kolejny filtr wykorzystujący kanał FITC dla aktyny. Obliczana jest powierzchnia komórki, a te poniżej określonego progu odcięcia (powierzchnia komórki około 2 razy mniejsza niż powierzchnia komórki w interfazie) są usuwane ze wszystkich stosów. Powierzchnia otoczki komórki jest określana przez rozmiar wzoru. - Wyrównanie obrazów komórek (makro CellRef)
W poprzednich krokach wybrano obrazy zawierające pojedyncze komórki na mikrowzorach. Mimo że obrazy te są wycentrowane na mikrowzorach, nigdy nie są one wszystkie idealnie wyrównane względem siebie. Aby zakończyć przetwarzanie obrazów, stosowany jest wtyczka ImageJ (MultiStackReg) w celu ponownego wyrównania wszystkich zebranych obrazów i wszystkich kanałów w oparciu o pozycję mikrowzoru. Krok ten generuje wyrównane stosy poszczególnych obrazów, które mogą teraz zostać użyte do analizy pojedynczych komórek lub stworzenia komórki referencyjnej (Rycina 4). - Budowa komórki referencyjnej (makro CellRef)
Hodowla komórek na mikrowzorach sprawia, że wszystkie komórki mają podobne kształty. Ta normalizacja umożliwia precyzyjne wyrównanie i nałożenie wielu obrazów komórek. Sumowanie sygnału z każdego obrazu w całym stosie pozwala na wizualizację i pomiar „średniego efektu leku”. Końcowy obraz zbiorczy, czyli komórka referencyjna, jest unikalnym i użytecznym narzędziem do reprezentacji i analizy obrazu, a można go uzyskać wyłącznie przy użyciu komórek na mikrowzorach (Rycina 4). W programie ImageJ komórkę referencyjną konstruuje się poprzez wykonanie projekcji przefiltrowanych i wyrównanych obrazów ze stosu (Image>Stacks>Z-project). Można zastosować kilka metod projekcji, takich jak średnia lub maksymalna intensywność, ale zazwyczaj wybiera się projekcję medianową, która eliminuje główne wartości odstające ze stosu obrazów. Aby ułatwić analizę wyników, stosowana jest LUT (Look Up Tables) przekształcająca jednobarwny obraz w kodowaną kolorami mapę częstotliwości. - Pomiar i kwantyfikacja interesujących parametrów (makro Hypotenuse)
W niniejszym artykule wideo zastosowano mikrowzory w kształcie litery L, ponieważ ta forma organizuje cytoszkielet aktynowy w jedno główne włókno stresowe. Dzięki takiemu uwydatnieniu aktyny, wpływ blebbistatyny na cytoszkielet można określić na wiele sposobów: mierząc zmiany w krzywiźnie włókna stresowego aktyny, intensywność barwienia, długość lub grubość włókna stresowego, zmiany w cechach morfometrycznych filamentów aktynowych lub kształtu komórki itp. Parametry te można mierzyć zarówno na obrazach pojedynczych komórek, jak i na końcowej komórce referencyjnej.
W tym przypadku wpływ 5 μM blebbistatyny scharakteryzowano poprzez zliczenie liczby zapadniętych komórek przy użyciu drugiego makra ImageJ o nazwie Hypotenuse (Rycina 7). W skrócie, obrazy mikrowzoru L po progowaniu są wykorzystywane do zdefiniowania teoretycznej przeciwprostokątnej trójkątnego kształtu komórki. Następnie przeprowadza się progowanie obrazów barwionych na aktynę w celu przybliżenia rzeczywistego kształtu komórki. Następnie mierzy się obszar między teoretyczną przeciwprostokątną trójkąta komórki a rzeczywistą wklęsłą błoną komórkową. Gdy komórka ulegnie zapadnięciu, pojawia się obszar pod teoretyczną przeciwprostokątną. Procent zapadniętych komórek jest wykorzystywany do porównania warunków kontrolnych i traktowanych.
6. Reprezentatywne wyniki
Przykłady wyglądu komórek na mikrowzorach bezpośrednio oraz kilka godzin po krytycznych etapach płukania opisanych w punktach 1.6-1.8 przedstawiono na rysunku 5. Po 15 min na płytkach CYTOOchips obserwuje się okrągłe komórki HeLa w równych odstępach, co wskazuje na ich przyleganie do mikrowzorów z fibronektyny (rysunek 5a). Adhezja jest zakończona, gdy komórki pozostają unieruchomione mimo delikatnego potrząsania naczyniem hodowlanym. Aby zminimalizować liczbę mikrowzorów zajętych przez wiele komórek, płytki przepłukuje się następnie roztworem PBS w celu usunięcia komórek dryfujących nad obszarami cytofobowymi. Po kilku godzinach komórki w pełni rozciągnięte na mikrowzorach będą wyglądać jak te przedstawione na rysunku 5b.
Typowe obrazy pojedynczych komórek uzyskane po inkubacji komórek z blebbistatyną, fiksacji oraz barwieniu aktyny i jąder przedstawiono na rysunku 6. Po zautomatyzowanym pozyskaniu wielu obrazów i ich przetwarzaniu przy użyciu makra ImageJ CellRef, generowana jest kolorystyczna mapa częstotliwości, która przedstawia średnią intensywność aktyny wyliczoną dla wszystkich obrazów komórek (rysunek 6c i 6f). Porównanie komórki referencyjnej (Reference Cell) dla warunków nieleczonych i leczonych wykazuje potencjał tej metody w łatwej obserwacji badanego fenotypu i jest szczególnie użyteczna w badaniu komórkowych efektów działania leków.
Przykład jednej z możliwych analiz wpływu blebbistatyny na komórki przedstawiono na rysunku 7. Pokazano liczbę zapadniętych komórek (tj. komórek z obszarem pustym znajdującym się pod teoretyczną przeciwprostą) wykrytą w 50 komórkach kontrolnych oraz 50 komórkach traktowanych 5 μM blebbistatyny za pomocą makra Hypotenuse w programie ImageJ. Zwiększona liczba zapadniętych komórek w populacji traktowanej blebbistatyną odzwierciedla rozluźnienie włókien stresowych, a tym samym napięcia błony, wynikające z inhibicji sił kurczliwych aktynomiozyny wewnątrz komórki przez blebbistatynę.
Rycina 1. Procedura tworzenia nowego dziennika w programie Metamorph.
Rycina 2. Schemat blokowy automatycznej procedury przetwarzania obrazów.
Rycina 3. Filtrowanie pojedynczych komórek.
Rycina 4. Tworzenie komórki referencyjnej.
Rysunek 5. Wysiew komórek. A) Komórki HeLa przylegające do mikrowzorów po etapie płukania (powiększenie 4x) B) Komórki HeLa po pełnym rozprzestrzenieniu się na mikrowzorach L (powiększenie 10x).
Rycina 6. Porównanie komórek nieuformowanych i uformowanych na mikrowzorcach w warunkach kontrolnych i po podaniu leku. Komórki HeLa wysiano na 3 h, a następnie poddano działaniu 5 μM blebbistatyny przez 1 h (dolny panel) lub pozostawiono bez leczenia (górny panel). W kontrolnych komórkach nieuformowanych (a) aktyna organizuje się w liczne włókna, które ulegają niemal niezauważalnemu rozpadowi po zastosowaniu 5 μM blebbistatyny (d). Na mikrowzorcach w kształcie litery L komórki kontrolne przyjmują kształt trójkątny (b) i rozwijają główne włókno aktynowe (włókno stresowe) między dwoma wierzchołkami litery L. W porównaniu do komórek nieuformowanych (d), blebbistatyna wywołuje znaczną zmianę fenotypową w komórkach na mikrowzorcach L (e). Bezpośrednią wizualizację efektów leku oraz porównanie warunków kontrolnych i traktowanych można szybko przeprowadzić za pomocą prezentacji Komórki Referencyjnej zbudowanej z 20 komórek. Podobnie jak w przypadku pojedynczych komórek, w kontrolnej Komórce Referencyjnej występuje wyraźne i intensywne włókno stresowe (c), natomiast komórki traktowane blebbistatyną zapadają się, a główne włókno stresowe znika (f).
Rycina 7. Przykład analizy wpływu blebbistatyny na komórki z wykorzystaniem makra Hypothenuse. Podczas gdy 25% komórek kontrolnych uległo zapadnięciu, w komórkach traktowanych 5 μM blebbistatyny odsetek ten wzrósł 3-krotnie do 75%, co odzwierciedla osłabienie kurczliwej sieci aktynomiozynowej (n=50 komórek).
Dyskusja
Wybór mikrowzoru
Podczas gdy efekty działania 5 μM blebbistatyny są ledwo zauważalne na standardowych podłożach hodowlanych, wydajna kwantyfikacja jest możliwa na mikrowzorach, które koncentrują aktynę w jednym głównym włóknie stresowym. Ułatwia to wizualizację cytoszkieletu aktynowego, pomagając w dokładnej kwantyfikacji wpływu blebbistatyny na komórkę. Wybór kształtu mikrowzoru jest kluczowy w projekcie testu i jest dobierany zgodnie ze zmianą fenotypową, którą zamierza się wyróżnić w badaniu.
Wnioski
Mikrowzory ułatwiają wizualizację i kwantyfikację efektów działania leków, szczególnie przy niskich stężeniach. Zastąpienie jednorodnych substratów płaskich adhezyjnymi mikrowzorami w testach komórkowych poprawia dokładność, czułość i jakość uzyskiwanych danych. W konsekwencji do analizy wymagana jest mniejsza liczba komórek w celu osiągnięcia wiarygodnych wyników statystycznych 3. Adhezyjne mikrowzory stanowią realną szansę na usprawnienie badań funkcjonalnych oraz badanie zmian fenotypowych przy niższych stężeniach leków, aby uniknąć wywoływania toksycznych lub pośrednich efektów działania leku. Przy zastosowaniu odpowiednich platform przesiewowych, mikrowzory mogą sprostać wymaganiom firm farmaceutycznych w zakresie usprawnienia aplikacji do przesiewania genów i leków. Poniżej przytoczono kilka dodatkowych przykładów z niedawnych publikacji, w których wykorzystano mikrowzory do analizy i kwantyfikacji zjawisk komórkowych 3-13.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy z wyjątkiem Anne Béghin są pracownikami firmy CYTOO S.A, która produkuje odczynniki i instrumentarium przedstawione w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CYTOOchips 20x20 L-M-FN | CYTOO | 10-114 | Chipsety CYTOOchips są dostępne do adsorpcji wybranego białka |
| PBS 1x | GIBCO, by Life Technologies | 14040-091 | |
| Komora licznikowa (preparat Kova) | Prolabo | 71287.01 | |
| DMEM/F-12 + Glutamax-I | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| FBS (płodowa surowica bydlęca) | Laboratoria PAA | 31331-028 | |
| Penicylina & Streptomycyna | Laboratoria PAA | A15-101 | |
| płytka 6-dołkowa | Dutscher | 353046 | |
| wirówka | Fisher Scientific | M65838 | |
| Mikroskop | Nikon Instruments | ||
| Bufor do cytoszkieletu 1X (CB) | Sigma-Aldrich | MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 | 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3mM MgCl2, 2mM EGTA |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| PFA 32% | Nauki o mikroskopii elektronowej | 15714 | |
| 5% PFA | Wymieszaj 10 ml 32% PFA z 54 ml 1,185X CB | ||
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| tabletki PBS | GIBCO, by Life Technologies | 18912-014 | |
| Seryczna albumina bydlęca (BSA) | Sigma-Aldrich | A7806 | |
| Faloidyna-FITC | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| H–Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. | Invitrogen | H3570 | |
| Blebbistatyna | Euromedex | BN0640 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| NH4Cl 0,1 M | Sigma-Aldrich | M11209 | |
| Mikroskop epifluorescencyjny | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| Kamera CCD | Do uzupełnienia | Proszę podać tekst do tłumaczenia. | |
| Oprogramowanie ImageJ |  http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Bibliografia
- Thery, M. The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis. Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).
- Thery, M. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).
- Schauer, K. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nat Methods. , (2010).
- Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape. Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity. J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).
- Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction. J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).
- Kwon, M. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).
- Nelson, C. M. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).
- Pouthas, F. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).
- Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation. Nature. 447, 493-496 (2007).
- Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).
Przedruki i uprawnienia
