Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Podsumowanie

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Streszczenie

Do tej pory większość badań HCA (High Content Analysis) przeprowadzano z wykorzystaniem adhezyjnych linii komórkowych hodowanych na jednorodnym podłożu w mikropłytkach przeznaczonych do hodowli tkankowych. W takich warunkach komórki rozprzestrzeniają się i dzielą we wszystkich kierunkach, co prowadzi do naturalnej zmienności kształtu, morfologii i zachowania komórek. Wysoka wariancja międzykomórkowa w całej populacji utrudnia sukces analiz HCA, szczególnie w procesie opracowywania leków. Zdolność mikrowzorów do normalizacji kształtu i polarności wewnętrznej każdej poszczególnej komórki stwarza ogromną szansę na rozwiązanie tego krytycznego problemu ^1-2.

Aby ułatwić dostęp i wykorzystanie technologii mikrowzorowania, firma CYTOO opracowała szereg gotowych mikrowzorów, dostępnych w formatach szkiełek nakrywkowych i mikroworków. W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe protokoły wszystkich procedur: od wysiewania komórek na mikrowzory CYTOOchip, przez traktowanie lekiem, fiksację i barwienie, aż po zautomatyzowaną akwizycję, zautomatyzowane przetwarzanie obrazów i końcową analizę danych. Na tym przykładzie ilustrujemy, w jaki sposób mikrowzory mogą usprawnić testy komórkowe. Zmiany w cytoszkielecie komórkowym są trudne do ilościowego określenia w komórkach hodowanych na jednorodnych podłożach, natomiast hodowla komórek na mikrowzorach prowadzi do powtarzalnej organizacji sieci aktynowej dzięki systematycznemu rozmieszczeniu kontaktów adhezyjnych w każdej komórce. Taka normalizacja architektury wewnątrzkomórkowej pozwala na kwantyfikację nawet niewielkich efektów w obrębie cytoszkieletu aktynowego, co zostało zademonstrowane w tym zestawie protokołów z wykorzystaniem blebbistatyny, inhibitora oddziaływania aktyna i miozyny.

Protokół

1. Przygotowanie komórek i ich wysiew na mikrowzory

1. Umieść 2 płytki CYTOOchip w 2 niezależnych dołkach płytki 6-dołkowej, upewniając się, że napis „CYTOO” znajduje się w prawym dolnym rogu płytki CYTOOchip. Mikrowzory mogą być znakowane fluorescencyjnie barwnikami Cy3 lub Cy5. Płytki CYTOOchip użyte w tym doświadczeniu posiadają mikrowzory znakowane fluorescencyjnie Cy3.
   UWAGA: Przechowywać płytki w ciemności.
2. Zebierz komórki HeLa (~80% konfluencji) poprzez trypsynizację. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki zostały prawidłowo rozproszone w wyniku traktowania trypsyną. Zbierz i odwiruj komórki przy 300g przez 4 min, a następnie delikatnie zresuspenduj osad komórkowy. Policz komórki i rozcieńcz je do stężenia 15,000 cells/ mL w kompletnej pożywce hodowlanej DMEM/F12.
3. Rozdystrybuj 4 mL (60,000 cells) do każdego dołka zawierającego płytkę CYTOOchip.
   UWAGA: Płytką należy poruszać jak najmniej, aby uniknąć wywołania ruchów rotacyjnych w pożywce, ponieważ sprzyja to koncentracji komórek w centrum.
4. Pozostaw komórki do sedymentacji na 10 min pod dygestorem, a następnie przenieś je do inkubatora komórkowego. Po 10-20 min komórki zaczną przylegać do mikrowzorów. Po 10 min regularnie sprawdzaj stan komórek pod mikroskopem.
5. Jak tylko komórki przywrą, wymień pożywkę komórkową i delikatnie przepłucz powierzchnię szkiełka przedmiotowego zgodnie z poniższą procedurą:
6. Trzymając płytkę płasko, delikatnie odessaj pożywkę pipetą z boku dołka.
   UWAGA: Nigdy nie dopuszczaj do wyschnięcia płytki; oznacza to, że nie należy odsysać całej cieczy, lecz zawsze pozostawiać jej ilość wystarczającą do przykrycia płytki CYTOOchip.
7. Dodaj 4 mL PBS i odessaj ponownie, zaczynając od środka płytki, a następnie przesuwając się ku krawędzi dołka. Odessaj PBS w opisany sposób, nie wystawiając płytki na działanie powietrza. Powtórz 3-4 razy.
8. Sprawdź pod mikroskopem obecność komórek pływających:
   • Jeśli pozostała duża liczba komórek pływających, powtórz procedurę płukania.
   • Jeśli widzisz bardzo mało komórek, odessaj część PBS i zastąp ją 2 mL świeżej pożywki. Odessaj i dodaj 4 mL świeżej pożywki dwukrotnie.
9. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ na minimum trzy godziny, aby umożliwić komórkom pełne rozprzestrzenienie się.
   UWAGA: Stosując tę metodę, od 10-30% (2000-6500) mikrowzorów zostanie zajętych przez pojedynczą lub wiele komórek.
   UWAGA: Czas potrzebny na przywrócenie komórek przed etapem płukania oraz czas potrzebny na pełne rozprzestrzenienie się komórek na mikrowzorach będą specyficzne dla każdej linii komórkowej.

2. Traktowanie blebbistatyną

1. Rozpuścić blebbistatynę w 100% DMSO, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 17 mM. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 5 mM za pomocą 100% DMSO. Przygotować końcowe rozcieńczenie w pożywce hodowlanej, aby uzyskać stężenie końcowe 5 μM blebbistatyny w 0,1% DMSO.
2. Dla warunków kontrolnych przygotować 4 mL pożywki zawierającej wyłącznie 0,1% DMSO.
3. Odssać pożywkę z komórek i zastąpić ją 4 mL pożywki przygotowanej dla warunków badanych i kontrolnych.
4. Inkubować komórki przez 1hr w temperaturze 37°C.

3. Fiksacja komórek i barwienie aktyny

1. Przygotowanie roztworów do fiksacji komórek
   Przygotowanie buforu do cytoszkieletu (CB) oraz 5% PFA opisano w sekcji odczynników. CB jest szczególnie zalecany do znakowania fluorescencyjnego filamentów aktynowych i mikrotubul.
   • Przygotuj 1xCB-sacharoza: dodaj 1 g sacharozy do 2 mL CB.
     Dodatek sacharozy pomaga w zachowaniu wewnętrznych struktur komórkowych.
   • Przygotuj 4% PFA-CB-sacharoza: dodaj 1 mL 1xCB-sacharoza do 4 mL ciepłego 5% PFA.
     UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w 4°C tylko przez kilka dni.
2. Fiksacja PFA
   • Za pomocą pęsety chwyć CYTOOchip za logo CYTOO i umieść go (bez płukania) w dołku płytki 6-dołkowej zawierającej 2 mL roztworu 4% PFA-CB-sacharoza
   • Inkubuj przez 10 min w RT
   • Usuń PFA-CB-sacharoza i wypłucz raz w PBS
   • Przeprowadź drugie płukanie za pomocą 2 mL 100 mM NH₄Cl przez 10 min, aby zneutralizować resztkową aktywność sieciującą PFA
     UWAGA: Preparaty ufiksowane w PFA można przechowywać w PBS przez kilka dni w 4°C przed barwieniem organelli do obrazowania fluorescencyjnego.
3. Permeabilizacja błony komórkowej za pomocą Triton X-100
   Permeabilizacja komórek detergentem umożliwia przeciwciałom lub innym sondom przeniknięcie przez błonę komórkową i eliminuje część cytozolowej puli białek cytoszkieletu, która w przeciwnym razie mogłaby zmniejszyć kontrast polimerów cytoszkieletu, utrudniając analizę ich lokalizacji.
   • Usuń NH₄Cl i dodaj 2 mL/dołek 0,1% Triton X-100-CB na 3 min w RT
   • Wypłucz dwa razy w 2 mL PBS
4. Barwienie aktyny
   Do barwienia filamentów aktynowych stosuje się faloidynę fluorescencyjną, która wiąże się wyłącznie z natywną aktyną.
   • Dodaj 2 mL faloidyny sprzężonej z FITC, rozcieńczonej 1:2000 w PBS z 1,5% BSA
   • Inkubuj przez 1 h w RT
   • Wypłucz raz w 2 mL PBS
5. Barwienie jąder komórkowych
   • Dodaj 2 mL Hoechst (barw stężeniem 1μg/ mL w PBS)
   • Inkubuj przez 3 min w RT
   • Wypłucz 2 razy w 2 mL PBS
6. Montowanie preparatu
   • Chwyć CYTOOchips za logo CYTOO i zamontuj CYTOOchip na standardowym szkiełku przedmiotowym, używając 25-30 μL Mowiolu lub innego medium montażowego.

4. Konfiguracja mikroskopu i zautomatyzowany pobór obrazów

Istnieje wiele pakietów oprogramowania do obrazowania, które sterują mikroskopem w celu szybkiej, zautomatyzowanej akwizycji i wyświetlania obrazów. W tym przykładzie wykorzystano oprogramowanie do obrazowania Metamorph, a automatyczną akwizycję przeprowadzono na mikroskopie Nikon Eclipse Ti wyposażonym w kamerę CCD Hamamatsu oraz rtęciowy iluminator światłowodowy Intensilight. Obrazy pozyskiwano przy powiększeniu 20x w trzech długościach fal odpowiadających DAPI (jądra komórkowe), Cy-3 (mikrowzory) i FITC-Faloidynie (aktyna). Liczba mikrowzorów widocznych w jednym polu widzenia będzie się różnić w zależności od konfiguracji kamery i obiektywu. Mikrowzory CYTOO są rozmieszczone w określonych odstępach od siebie (100 lub 130 μm) na całej powierzchni chipa, co znacznie ułatwia proces akwizycji.

1. Wybierz powiększenie 20x
2. Otwórz funkcję Multidimensional Acquisition (w pasku menu: Apps/Multidimensional Acquisition) i skonfiguruj poszczególne parametry eksperymentu:
   • Liczba długości fal: 3
   • Typy długości fal: DAPI, FITC, Cy3
   • Ustaw czas ekspozycji dla każdej długości fali, najpierw ustawiając ostrość na polu z komórkami
   • Autofokus można przeprowadzić dla każdej długości fali
   • Wybierz miejsce zapisu danych
3. Wybierz długość fali Cy3 i ustaw kamerę tak, aby widocznych było 12 mikrowzorów, wycentrowanych w polu widzenia kamery (4 kolumny i 3 rzędy wzorów).
4. Utwórz dziennik (journal) uruchamiający MultiDimensional Acquisition. Procedura tworzenia dziennika została opisana na Rysunku 1.
5. Otwórz funkcję Scan stage (w pasku menu: Devices/Stage/Scan Stage). Aby pozyskać 24 obrazy, z których każdy zawiera 12 mikrowzorów przy powiększeniu 20x, wprowadź 6 kolumn i 4 rzędy z rozstawem kroku X wynoszącym -400 μm i rozstawem kroku Y wynoszącym 300 μm. W polu Set Journal to Execute prześlij dziennik MDA.JNL. Następnie naciśnij Scan, aby rozpocząć automatyczną akwizycję całego bloku w trzech długościach fal.
   UWAGA: Wskazane tutaj wartości kroku X i Y będą się różnić w zależności od liczby mikrowzorów znajdujących się w polu widzenia kamery. W zależności od konfiguracji stolika, kierunek w osi X i/lub Y może wymagać wartości ujemnych dla ruchu w odpowiednim kierunku.

5. Automatyczne przetwarzanie i analiza obrazów

Istnieje wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów. Poniższe procedury opisują etapy przetwarzania i analizy obrazu realizowane przez dwa niestandardowe makra napisane dla programu open source ImageJ. Pierwsze makro, CellRef, tworzy komórkę referencyjną, a drugie, Hypotenuse, mierzy sztywność/zapadanie się błony komórkowej. Oba są dostępne na zapytanie za pośrednictwem strony www.cytoo.com.

1. Utworzenie stosów obrazów dla wszystkich trzech kanałów wycentrowanych na mikrowzorach (makro CellRef).
   Zastosowanie mikrowzorów zapobiega agregacji i skupianiu się komórek, co znacznie upraszcza pierwszy krok zautomatyzowanego przetwarzania obrazów, którym jest lokalizacja i segmentacja poszczególnych komórek. Obrazy z fluorescencyjnie znakowanymi mikrowzorami są wykorzystywane do zdefiniowania i wyznaczenia obszarów wycentrowanych na mikrowzorach. Obszary te są następnie przenoszone na obrazy pozyskane w innych kanałach i przycinane. Odpowiednio przycięte obrazy są następnie łączone w stosy dla każdej długości fali. Tworzony jest również stos RGB z połączenia trzech kanałów (Rysunek 2).
2. Zastosowanie filtra selekcji pojedynczych komórek (makro CellRef)
   Jak wskazano powyżej, 10-30% (2000-6500) mikrowzorów jest zajętych przez pojedynczą komórkę lub wiele komórek, podczas gdy pozostałe mikrowzory pozostają puste. Aby wybrać obrazy przedstawiające mikrowzory zajęte przez tylko jedną komórkę, makro wykrywa liczbę jąder na obraz i usuwa ze wszystkich stosów (RGB i różnych długości fal) te, które zawierają więcej niż jedno jądro lub nie zawierają żadnego jądra (Rysunek 3).
3. Eliminacja komórek nienormalizowanych oraz komórek, które nie rozciągają się w pełni na mikrowzorze, przy użyciu filtra odcięcia powierzchni komórki (makro CellRef)
   W celu usunięcia dzielących się komórek, które mogłyby uniknąć filtra jąder, stosuje się kolejny filtr wykorzystujący kanał FITC dla aktyny. Obliczana jest powierzchnia komórki, a te poniżej określonego progu odcięcia (powierzchnie komórek około 2 razy mniejsze niż powierzchnia komórki w fazie interfazy) są usuwane ze wszystkich stosów. Powierzchnia otoczki komórki jest określona przez rozmiar wzoru.
4. Wyrównanie obrazów komórek (makro CellRef)
   W poprzednich krokach wyselekcjonowano obrazy zawierające pojedyncze komórki na mikrowzorach. Mimo że obrazy te są wycentrowane na mikrowzorach, nigdy nie są one wszystkie idealnie wyrównane względem siebie. Aby zakończyć przetwarzanie obrazów, stosuje się wtyczkę ImageJ (MultiStackReg), aby ponownie wyrównać wszystkie zebrane obrazy i wszystkie kanały w oparciu o pozycję mikrowzoru. Krok ten generuje wyrównane stosy pojedynczych obrazów, które mogą być teraz wykorzystane do analizy pojedynczych komórek lub stworzenia komórki referencyjnej (Reference Cell) (Rysunek 4).
5. Budowa komórki referencyjnej (makro CellRef)
   Hodowla komórek na mikrowzorach oznacza, że wszystkie komórki mają podobne kształty. Ta normalizacja umożliwia precyzyjne wyrównanie i nakładanie wielu obrazów komórek. Sumowanie sygnału w każdym obrazie w całym stosie pozwala na wizualizację i pomiar „średniego efektu leku”. Końcowy obraz ogólny lub komórka referencyjna jest unikalnym i użytecznym narzędziem do reprezentacji i analizy obrazu i może być uzyskana wyłącznie przy użyciu komórek na mikrowzorach (Rysunek 4). W programie ImageJ komórka referencyjna jest konstruowana poprzez wykonanie projekcji przefiltrowanych i wyrównanych obrazów ze stosu (Image>Stacks>Z-project). Można zastosować kilka metod projekcji, takich jak średnia lub maksymalna intensywność, ale zazwyczaj wybierana jest projekcja medianowa, która eliminuje główne wartości odstające ze stosu obrazów. Aby ułatwić analizę wyników, stosowana jest LUT (Look Up Tables), która konwertuje obraz jednobarwny na zakodowaną kolorami mapę częstotliwości.
6. Pomiar i kwantyfikacja parametrów zainteresowania (makro Hypotenuse)
   W niniejszym artykule wideo zastosowano mikrowzory w kształcie litery L, ponieważ ta forma organizuje cytoszkielet aktynowy w jedno główne włókno stresowe. Dzięki takiemu uwypukleniu aktyny, wpływ blebbistatyny na cytoszkielet można określić na wiele sposobów: poprzez pomiar zmian w krzywiźnie włókna stresowego aktyny, intensywności barwienia, długości lub grubości włókna stresowego, zmian w cechach morfometrycznych filamentów aktynowych lub kształcie komórki itp. Parametry te można mierzyć zarówno na obrazach pojedynczych komórek, jak i na końcowej komórce referencyjnej.
   W tym przypadku wpływ 5 μM blebbistatyny scharakteryzowano poprzez zliczenie liczby zapadniętych komórek przy użyciu drugiego makra ImageJ o nazwie Hypotenuse (Rysunek 7). W skrócie, obrazy z progiem (thresholded) mikrowzoru L są wykorzystywane do zdefiniowania teoretycznej przeciwprostokątnej trójkątnego kształtu komórki. Następnie przeprowadza się progowanie obrazów barwionych na aktynę w celu przybliżenia rzeczywistego kształtu komórki. Następnie mierzy się obszar między teoretyczną przeciwprostokątną trójkąta komórki a rzeczywistą wklęsłą błoną komórkową. Gdy komórka ulegnie zapadnięciu, pojawia się obszar pod teoretyczną przeciwprostokątną. Procent zapadniętych komórek jest wykorzystywany do porównania warunków kontrolnych i traktowanych.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady wyglądu komórek na mikrowzorach bezpośrednio oraz kilka godzin po krytycznych etapach płukania opisanych w punktach 1.6-1.8 przedstawiono na Ryc. 5. Po 15 min na płytkach CYTOOchips obserwuje się okrągłe komórki HeLa w równych odstępach, co wskazuje na ich przyleganie do mikrowzorów z fibronektyny (Ryc. 5a). Adhezja jest zakończona, gdy komórki pozostają unieruchomione mimo delikatnego potrząsania naczyniem hodowlanym. Aby zminimalizować liczbę mikrowzorów zajętych przez wiele komórek, płytki płucze się następnie PBS w celu usunięcia komórek unoszących się nad obszarami cytofobowymi. Po kilku godzinach komórki w pełni rozciągnięte na mikrowzorach będą wyglądać jak te przedstawione na Ryc. 5b.

Typowe obrazy pojedynczych komórek uzyskane po inkubacji komórek z blebbistatyną, fiksacji oraz barwieniu aktyny i jąder przedstawiono na rysunku 6. Po zautomatyzowanym pozyskaniu wielu obrazów i ich przetworzeniu za pomocą makra ImageJ CellRef, generowana jest kodowana kolorami mapa częstotliwości, która obrazuje intensywność aktyny uśrednioną dla wszystkich obrazów komórek (rysunek 6c i 6f). Porównanie komórki referencyjnej (Reference Cell) dla warunków nieleczonych i leczonych wykazuje potencjał tej metody w łatwej obserwacji badanego fenotypu i jest szczególnie przydatna w badaniu komórkowych efektów działania leków.

Przykład jednej z możliwych analiz wpływu blebbistatyny na komórki przedstawiono na Rysunku 7. Przedstawiono liczbę zapadniętych komórek (tj. komórek z obszarem pustym znajdującym się pod teoretyczną przeciwprostą) wykrytą w 50 komórkach kontrolnych oraz 50 komórkach traktowanych 5 μM blebbistatyną, za pomocą makra ImageJ Hypotenuse. Zwiększona liczba zapadniętych komórek w populacji traktowanej blebbistatyną odzwierciedla rozluźnienie włókien stresowych, a tym samym napięcia błony, wynikające z inhibicji sił kurczliwych aktynomiozyny wewnątrz komórki przez blebbistatynę.

Rysunek 1. Procedura tworzenia nowego dziennika w programie Metamorph.

Rysunek 2. Schemat blokowy automatycznej procedury przetwarzania obrazów.

Rysunek 3. Odfiltrowywanie pojedynczych komórek.

Rysunek 4. Tworzenie komórki referencyjnej.

Rysunek 5. Wysiew komórek. A) Komórki HeLa przylegające do mikrowzorów po etapie płukania (powiększenie 4x) B) Komórki HeLa po pełnym rozprzestrzenieniu się na mikrowzorach L (powiększenie 10x).

Rysunek 6. Porównanie komórek bez wzorca i komórek na mikrowzorcach w warunkach kontrolnych oraz po zastosowaniu leku. Komórki HeLa wysiano na 3 godziny i poddano działaniu 5 μM blebbistatyny przez 1 godzinę (panel dolny) lub pozostawiono bez preparacji (panel górny). W kontrolnych komórkach bez wzorca (a) aktyna organizuje się w liczne włókna, które ulegają niezauważalnemu rozpadowi po zastosowaniu 5 μM blebbistatyny (d). Na mikrowzorcach w kształcie litery L komórki kontrolne przyjmują kształt trójkątny (b) i wykształcają główne włókno aktynowe (włókno stresowe) między dwoma wierzchołkami litery L. W porównaniu do komórek bez wzorca (d), blebbistatyna indukuje znaczną zmianę fenotypową w komórkach na mikrowzorcach L (e). Bezpośrednią wizualizację efektów działania leku oraz porównanie warunków kontrolnych i traktowanych można szybko przeprowadzić za pomocą prezentacji komórki referencyjnej (Reference Cell) zbudowanej z 20 komórek. Podobnie jak w przypadku pojedynczych komórek, w kontrolnej komórce referencyjnej obecne jest wyraźne i intensywne włókno stresowe (c), podczas gdy komórki traktowane blebbistatyną zapadają się, a główne włókno stresowe znika (f).

Rysunek 7. Przykład analizy wpływu blebbistatyny na komórki z wykorzystaniem makra Hypothenuse. Podczas gdy zapadły się 25% komórek kontrolnych, w komórkach traktowanych 5 μM blebbistatyną odsetek ten wzrósł 3-krotnie do 75%, co odzwierciedla osłabienie kurczliwej sieci aktynomiozyny (n=50 komórek).

Dyskusja

Wybór mikrowzoru

Podczas gdy efekty działania 5 μM blebbistatyny są ledwo zauważalne na standardowych podłożach hodowlanych, wydajna kwantyfikacja jest możliwa na mikrowzorach, które koncentrują aktynę w jednym głównym włóknie stresowym. Ułatwia to wizualizację cytoszkieletu aktynowego, pomagając w dokładnej kwantyfikacji wpływu blebbistatyny na komórkę. Wybór kształtu mikrowzoru jest kluczowy w projekcie testu i jest dobierany zgodnie ze zmianą fenotypową, którą zamierza się wyróżnić w badaniu.

Wnioski

Mikrowzory ułatwiają wizualizację i kwantyfikację efektów działania leków, szczególnie przy niskich stężeniach. Zastąpienie jednorodnych substratów płaskich adhezyjnymi mikrowzorami w testach komórkowych poprawia dokładność, czułość i jakość uzyskiwanych danych. W konsekwencji do analizy wymagana jest mniejsza liczba komórek w celu osiągnięcia wiarygodnych wyników statystycznych ³. Adhezyjne mikrowzory stanowią realną szansę na usprawnienie badań funkcjonalnych oraz badanie zmian fenotypowych przy niższych stężeniach leków, aby uniknąć wywoływania toksycznych lub pośrednich efektów działania leku. Przy zastosowaniu odpowiednich platform przesiewowych, mikrowzory mogą sprostać wymaganiom firm farmaceutycznych w zakresie usprawnienia aplikacji do przesiewania genów i leków. Poniżej przytoczono kilka dodatkowych przykładów z niedawnych publikacji, w których wykorzystano mikrowzory do analizy i kwantyfikacji zjawisk komórkowych ^3-13.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CYTOOchips 20x20 L-M-FN	CYTOO	10-114	CYTOOchips są dostępne do adsorpcji wybranego białka
PBS 1x	GIBCO, firmy Life Technologies	14040-091
Komora liczenia (Kova slide)	Prolabo	71287.01
DMEM/F-12 + Glutamax-I	GIBCO, firmy Life Technologies	25300-054
FBS (surowica bydlęca)	Laboratoria PAA	31331-028
Penicylina & Streptomycyna	PAA Laboratories	A15-101
6-dołkowa płytka	Wirówka	do 353046
	Fisher Scientific	M65838
Mikroskop	Nikon Instruments
Bufor cytoszkieletu 1X (CB)	Sigma-Aldrich	MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889	10 mM MES pH 6,1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S2395
PFA 32 %	Mikroskopia elektronowa Sciences	15714
PFA 5%			Wymieszaj 10 ml PFA 32% z 54 ml tabletek CB 1.185X
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
PBS	GIBCO, firmy Life Technologies	18912-014
Albumina surowicy Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7806
Phallodin-FITC	Sigma-Aldrich	P5282
H– scht	Invitrogen	H3570
Blebbistatin	Euromedex	BN0640
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
NH4Cl 0,1M	Sigma-Aldrich	M11209
Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon Instruments	Eclipse Ti
CCD Camera	TBC	TBC
Oprogramowanie	ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/