Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Podsumowanie

W tym filmie demonstrujemy wizualizację translokacji PKC w żywych komórkach z wykorzystaniem PKC znakowanych fluorescencyjnie.

Streszczenie

Kinazy białkowe C (PKCs) są kinazami seryno-treoninowymi, które odgrywają centralną rolę w regulacji szerokiej gamy procesów komórkowych, takich jak wzrost komórek, uczenie się i pamięć. U kręgowców znane są cztery rodziny izoform PKC: klasyczne PKCs (α, βI, βII i γ), nowatorskie typu I PKCs (ε i η), nowatorskie typu II PKCs (δ i θ) oraz atypowe PKCs (ζ i ι). Klasyczne PKCs są aktywowane przez Ca²⁺ i diacyliglicerol (DAG), podczas gdy nowatorskie PKCs są aktywowane przez DAG, lecz są niezależne od Ca²⁺. Atypowe PKCs nie są aktywowane ani przez Ca²⁺, ani przez DAG. W Aplysia californica, naszym systemie modelowym do badania formowania pamięci, występują trzy specyficzne dla układu nerwowego izoformy PKC, po jednej z każdej głównej klasy: konwencjonalna PKC Apl I, nowatorska typu I PKC Apl II oraz atypowa PKC Apl III. PKCs są kinazami aktywowanymi lipidowo, dlatego aktywację klasycznych i nowatorskich PKCs w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe często korelowano z translokacją PKC z cytoplazmy do błony komórkowej. W związku z tym wizualizacja translokacji PKC w czasie rzeczywistym w żywych komórkach stała się nieocenionym narzędziem do wyjaśniania szlaków transdukcji sygnału prowadzących do aktywacji PKC. Na przykład technika ta pozwoliła nam ustalić, że różne izoformy PKC translokują w różnych warunkach, aby pośredniczyć w odmiennych typach plastyczności synaptycznej, oraz że aktywacja PKC Apl II przez serotoninę (5HT) wymaga produkcji zarówno DAG, jak i kwasu fosfatydowego (PA) do translokacji ^1-2. Co istotne, możliwość wielokrotnej wizualizacji tego samego neuronu pozwoliła nam na przykład zmierzyć desensytyzację odpowiedzi PKC z niezwykłą dokładnością ³. W tym filmie demonstrujemy każdy etap przygotowania kultur komórek Sf9 (kultury neuronów sensorycznych Aplysia zostały opisane w innym artykule wideo ⁴), ekspresję PKC znakowanych fluorescencyjnie w komórkach Sf9 i w neuronach sensorycznych Aplysia oraz obrazowanie na żywo translokacji PKC w odpowiedzi na różne aktywatory z użyciem mikroskopii skaningowej laserem.

Protokół

1. Przygotowanie i utrzymanie monowarstwowych kultur komórek Sf9

1. Hodowlę i utrzymanie komórek Sf9 prowadzi się w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Komórki Sf9 pochodzą z komórek jajnika Spodoptera frugiperda (komórki Sf21) i mogą być zakupione jako komórki mrożone w pożywce Grace'a od firmy Invitrogen.
3. Do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm² z ukośnym szyjką należy wlać 8 mL pożywki dla owadów Grace'a, uzupełnionej (1X), z dodatkiem 30% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
4. Zamrożoną probówkę z komórkami Sf9 należy szybko rozmrozić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, delikatnie poruszając probówką przód-tył (przez około 1-2 minuty).
5. Komórki Sf9 należy przenieść do kolby hodowlanej 75 cm² i delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie, aby równomiernie rozmieścić komórki.
6. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 27°C aż do momentu przyczepienia się komórek.
7. Usunąć starą pożywkę i zastąpić ją 10 mL świeżej pożywki dla owadów Grace'a z 30% FBS.
8. Inkubować w temperaturze 27°C aż do uzyskania konfluencji komórek.
9. Aby utrzymać kultury monowarstwy, należy usunąć starą pożywkę z konfluencyjnej kolby z komórkami Sf9 i dodać 5 mL pożywki dla owadów Grace'a z 10% FBS.
10. Kilka razy lekko opukać ściankę kolby, aby odczepić komórki Sf9.
11. Za pomocą pipety 10 mL i pipetora należy raz delikatnie zassać i wypuścić pożywkę, rozpylając ją na ściankach kolby podczas wypuszczania. Następnie przenieść komórki do sterylnej probówki polistyrenowej o objętości 15 mL.
12. Do nowej kolby hodowlanej 75 cm² dodać 2 mL zawiesiny komórek Sf9 do 8 mL pożywki dla owadów Grace'a z 10% FBS (rozcieńczenie 1:5 w celu utrzymania wzrostu w fazie logarytmicznej) i delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie.
13. Inkubować w temperaturze 27°C aż do uzyskania konfluencji komórek.

2. Ekspresja PKC znakowanych fluorescencyjnie w komórkach Sf9

1. W celu przeprowadzenia eksperymentu z obrazowaniem na żywo, hoduj komórki Sf9 na szalkach hodowlanych MatTek z dnem szklanym 35 mm, o powierzchni szklanej 14 mm i grubości szkiełka od 0,16 do 0,19 mm.
2. PKC znakowane białkami fluorescencyjnymi są ekspresjonowane w komórkach Sf9 przy użyciu odczynnika do transfekcji Cellfectin II zgodnie z zaleceniami producenta z modyfikacjami szczegółowo opisanymi poniżej.
3. Dzień 1: Przed wysianiem komórek potraktuj każdą szalkę MatTek pożywką dla owadów Grace'a z 10% FBS przez co najmniej 30 minut.
4. Policz komórki Sf9 z kroku 11 (powyżej) za pomocą hemacytomieru.
5. Wysiej 0,05 x 10⁶ komórek na każde szkiełko szklane MatTek w całkowitej objętości 150 μL. Pozostaw komórki do przytwierdzenia na 30 minut w temperaturze pokojowej.
6. Dodaj 2 mL pożywki Grace'a uzupełnionej o 10% FBS do każdej szalki, dodając po 1 mL powoli, aby uniknąć odklejenia komórek.
7. Inkubuj w temperaturze 27°C przez noc.
8. Od tego momentu stosuj zalecenia producenta dotyczące transfekcji komórek Sf9 plazmidowym DNA.
9. Dzień 2: Przeprowadź transfekcję komórek Sf9 znakowanymi fluorescencyjnie PKC przy użyciu odczynnika do transfekcji Cellfectin II. W tym systemie często przeprowadzaliśmy koekspresję PKC znakowanych ulepszonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (eGFP) oraz monomerycznym czerwonym białkiem fluorescencyjnym (mRFP) (szczegóły konstrukcji plazmidów zostały opisane wcześniej ^2,5). Ekspresja jednego białka fluorescencyjnego naraz daje około 70-80% komórek wykazujących ekspresję 72 godziny po transfekcji. Koekspresja dwóch białek fluorescencyjnych obniża wydajność transfekcji do około 30% komórek wykazujących koekspresję. Przy koekspresji PKC znakowanego eGFP i PKC znakowanego mRFP, użyj 2x więcej plazmidowego DNA dla białka znakowanego mRFP w celu uzyskania optymalnej ekspresji białka.
10. Wykonaj obrazowanie na żywo 48-72 godziny po transfekcji (dla optymalnej ekspresji białka odczekaj 72 godziny).

3. Ekspresja PKC znakowanych fluorescencyjnie w neuronach sensorycznych Aplysia

1. Przygotowanie kultur komórek neuronalnych Aplysia zostało opisane w artykule wideo opracowanym przez Zhao i współpracowników ⁴.
2. PKC znakowane białkami fluorescencyjnymi są ekspresowane w neuronach sensorycznych Aplysia przy użyciu procedury mikroiniekcji opisanej poniżej.
3. Przygotować roztwór zapasowy 1% Fast Green (FCF) w wodzie destylowanej, przefiltrować go za pomocą strzykawki i filtra strzykawkowego 28 mm (0,20 μm). Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C. 
4. Mikroiniekcję neuronów sensorycznych można przeprowadzić w 1. lub 2. dniu po izolacji neuronów, jednak stwierdzono, że odczekanie 2 dni pozwala na lepszą adhezję komórek do szkiełka podstawowego.
5. W 2. dniu po izolacji neuronów sensorycznych rozmrozić alikwot Fast Green i ponownie przefiltrować go za pomocą strzykawki i filtra strzykawkowego 28 mm (0,20 μm).
6. Przygotować roztwór plazmidowego DNA w wodzie destylowanej zawierający 0,5% Fast Green. Można stosować stężenia plazmidowego DNA do 0,4 μg/μL, lecz nie zaleca się przekraczania tych wartości. 
7. Przefiltrować roztwór plazmidowego DNA / Fast Green za pomocą strzykawki 1 mL i filtra strzykawkowego 4 mm (0,20 μm).
8. Odwirować roztwór plazmidowego DNA / Fast Green w mikrocentry fudze przy 16110 x g przez 15 minut.
9. Przygotować ostre elektrody do mikroiniekcji neuronów za pomocą wyciągacza mikroelektrod (Sutter Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97). Używając włókna prostokątnego, wyciągnąć szklane mikroelektrody o średnicy zewnętrznej 1 mm, średnicy wewnętrznej 0,75 mm i długości 100 mm, stosując cienkościenne kapilary szklane z włóknem wewnątrz (World Precision Instruments TW100F-4). Więcej informacji na temat wyciągania elektrod do mikroiniekcji znajduje się w podręczniku Sutter electrode cookbook.
10. Napełnić każdą elektrodę 2 μL roztworu plazmidowego DNA / Fast Green za pomocą końcówki do mikroładowania (eppendorf CA32950-050).
11. Przenieść naczynie hodowlane MatTek z szklanym dnem zawierające kultury neuronalne Aplysia na stanowisko do mikroinjekcji.
12. Stanowisko do mikroinjekcji składa się z następujących elementów: własnoręcznie wykonanego dużego szklanego stołu do podtrzymywania naczyń hodowlanych na stole izolacyjnym od wibracji (Kinetic Systems vibration isolation workstation), stereomikroskopu z zewnętrznym oświetleniem halogenowym, mikromanipulatora (Sutter Huxley Wall Type Micromanipulator, umożliwiającego zarówno grube, jak i ultraprecyzyjne pozycjonowanie w trzech osiach) oraz uchwytu mikroelektrody podłączonego do pompy pneumatycznej (World Precision Instruments PV820 Pneumatic Pico-Pump). Wejście ciśnieniowe pompy pneumatycznej jest połączone z butlą ze sprężonym azotem.
13. Włożyć mikroelektrodę do uchwytu mikroelektrod.
14. Obserwując pod stereomikroskopem, wprowadzić końcówkę mikropipety do jądra komórkowego.
15. Podawać krótkie impulsy ciśnienia azotu (czas trwania od 10 do 100 ms; 20 lb/in²) aż do momentu, gdy jądro stanie się jednorodnie zielone.
16. Inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze pokojowej i przechowywać w 4°C do czasu użycia. Aby uzyskać optymalną translokację PKC, przeprowadzić eksperyment obrazowania na żywo 20–24 godziny po iniekcji.

4. Wizualizacja translokacji PKC w żywych komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

1. Do obrazowania wykorzystujemy odwrócony mikroskop konfokalny Zeiss LSM510 z Axiovert 200.
2. Protokół obrazowania jest taki sam dla komórek Sf9, jak i dla neuronów sensorycznych Aplysia , z wyjątkiem następujących kwestii: komórki Sf9 obrazowane są za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego x63, natomiast neurony sensoryczne Aplysia za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego x40. Komórki Sf9 obrazowane są w komorze z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną na poziomie 26-27^oC, podczas gdy neurony sensoryczne Aplysia obrazowane są w temperaturze pokojowej utrzymywanej w okolicach 18-20^oC.
3. Używamy lasera argonowego o mocy 30 mW (wzbudzenie przy 488nm) z 50% wyjściową mocą lasera do obrazowania PKC znakowanego białkiem eGFP oraz lasera HeNe (wzbudzenie przy 543nm) do obrazowania PKC znakowanego białkiem mRFP. Linie laserowe argonowa i HeNe są tłumione do odpowiednio 4% i 50% transmitancji wyjściowej przed obrazowaniem, a otwór pinhole jest ustawiony na wartość jeden.
4. Ważne jest, aby naczynie hodowlane było stabilnie zamocowane na stole obrazującym i aby uniknąć ruchu lub wibracji.
5. Delikatnie usuń 1 mL pożywki hodowlanej z naczynia za pomocą pipety 10 mL, pozostawiając w naczyniu całkowitą objętość 1 mL.
6. Wykonaj zdjęcia w sekcji środkowej komórek, w której widoczne jest jądro.
7. Ustaw serię czasową 10-20 obrazów konfokalnych, wykonując zdjęcie co 30 sekund.
8. Rozpocznij serię czasową.
9. Po wykonaniu 2 zdjęć (po punkcie czasowym 30 sekund), dodaj 1 mL leku (stężenie 2X), delikatnie kapiąc go na komórki za pomocą pipety P1000. Lek jest dodawany w sposób ciągły przez około 30 sekund.
10. Niektóre leki wywołują szybką translokację, która może być widoczna natychmiast po podaniu leku (w punkcie czasowym 60 sekund), podczas gdy inne wywołują wolną translokację, która osiąga optymalny poziom dopiero 5-10 minut po podaniu (Film 1 i Film 2).
11. Jeśli lek wymaga wypłukania, użyj dwóch pipet 10 mL do przeprowadzenia płukania, delikatnie dozując bufor płuczący jedną pipetą po jednej stronie naczynia i odsysając pożywkę drugą pipetą z drugiej strony.
12. Jeśli płukanie było skuteczne i jeśli efekt działania leku jest odwracalny, PKC powraca do cytozolu w ciągu 30-60 sekund.
13. Zapisz film jako plik LSM.
14. Użyj oprogramowania NIH Image J do otwarcia plików LSM i ilościowej analizy obrazów przed i po podaniu leku. Analiza ilościowa została opisana w innym opracowaniu ¹.

Dyskusja

Opisaliśmy technikę obrazowania translokacji PKC znakowanych fluorescencyjnie w czasie rzeczywistym w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia. Komórki Sf9 stanowią prosty system do obrazowania translokacji PKC, ponieważ ich hodowla i transfekcja są dość proste. W przeciwieństwie do nich, opanowanie mikroiniekcji w neuronach sensorycznych Aplysia wymaga czasu; może to potrwać kilka miesięcy. Trudności związane z tą techniką obejmują m.in. zatykanie się elektrod. Filtrowanie i wirowanie roztw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
zamrożone komórki Sf9	*Spodoptera frugiperda* komórki jajnika	Invitrogen	B825-01
Grace’pożywka do owadów, suplementowana (1X), płynna	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Stosować do hodowli komórek Sf9
Corning 75 cm2 kolba do hodowli komórkowych z ukośną szyjką	Narzędzie	Corning	430720	Stosować do hodowli komórek Sf9
Płodowa surowica bydlęca	Odczynnik	CanSera	CS-C08-500	Suplement Grace’pożywki z FBS przed użyciem
Strzykawka	Narzędzie	BD Biosciences	309604	Do filtrowania roztworu Fast Green
Strzykawka	Narzędzie	BD Biosciences	309602	Służy do filtrowania roztworu plazmidowego DNA / Fast Green
Filtr	Narzędzie	Corning	431229	Użyć do przefiltrowania roztworu Fast Green
Filtr	Narzędzie	Corning	431212	Użyć do przefiltrowania roztworu DNA plazmidowego / Fast Green
szalka z szklanym dnem	Narzędzie	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Stosować do hodowli komórek Sf9 przed transfekcją i obrazowaniem
Odczynnik Cellfectin II	Odczynnik	Invitrogen	10362-100	Stosowane do ekspresji PKCs znakowanych fluorescencyjnie w komórkach Sf9
Fast Green FCF	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F-7252	Służy do wizualizacji mikroiniekcji roztworu plazmidowego DNA do Aplysia neurony czuciowe
Cienkościenne kapilary szklane	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Użyj do sporządzenia mikr–elektrody do mikrowstrzykiwania
Końcówka do pipety mikrodozownika	Narzędzie	Eppendorf	CA32950-050	Autoklawować przed napełnieniem mikro...–elektrody do mikroiniekcji
Pneumatyczna pompa PicoPump PV820	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Elementy stanowiska do mikoiniekcji
Mikr–uchwyt elektrody	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Użyć do przytrzymania mikr–elektroda
Mikromanipulator	Narzędzie	Sutter Instrument Co.	MP-85	Użyć do pozycjonowania mikr–elektroda w układzie trójosiowym