Mikroprzepływowa pułapka hydrodynamiczna dla pojedynczych cząstek

Pułapka hydrodynamiczna składa się z dwuwarstwowego hybrydowego (polidimetylosiloksanu (PDMS) / szkła) urządzenia mikroprzepływowego do zatrzymywania cząstek. Kroki 1-2 opisują wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych, a kroki 3-4 omawiają konstrukcję i działanie urządzenia.

1. Produkcja form SU-8 (nie pokazane na filmie)

1. Oczyść dwie płytki krzemowe (o średnicy 3") acetonem i alkoholem izopropylowym (IPA).
2. Wysuszyć wafle za pomocą N₂ i umieścić je na płycie grzejnej w temperaturze 65°C na 1 minutę, aby usunąć resztki wilgoci.
3. Wiruj wafel #1 z fotorezystem SU-8 2050 (PR) przez 30 sekund przy 4000 obr./min, aby stworzyć formę o grubości ~40 μm dla warstwy płynnej. Wiruj wafel #2 z PR przez 30 sekund z prędkością 1500 obr./min, aby utworzyć formę o grubości ~150 μm dla warstwy kontrolnej.
4. Miękki wafelek #1 pieczemy w temperaturze 65°C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 95°C przez 6 minut. Miękki wafelek #2 pieczemy w temperaturze 65°C przez 5 minut, a następnie w temperaturze 95°C przez 20 minut.
5. Wystaw wafle na działanie promieniowania UV za pomocą odpowiednich masek (wafel #1: porty i kanały fluidyczne, wafel #2: port i warstwa kontrolna) i odpowiedniej intensywności ekspozycji (odpowiednio ~150 mJ/^cm2, ~260 mJ/^cm2).
6. Wafel #1 upiec w temperaturze 65°C przez 1 minutę, a następnie w temperaturze 95°C przez 6 minut. Wafel #2 upiec w temperaturze 65°C przez 5 minut, a następnie w temperaturze 95°C przez 10 minut.
7. Opracowuj wafle z octanem eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA), aż do usunięcia nieutwardzonego PR. Wafle opłukać IPA i osuszyć N₂.

2. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

1. Silanizować powierzchnię form SU-8, umieszczając wafle w eksykatorze pod próżnią na ~10 minut za pomocą szklanego naczynia zawierającego kilka kropli trichlorosilanu. Silanizacja powierzchni pomaga w odklejaniu replik (PDMS) od form SU-8.
2. Mieszaj i odgazowuj PDMS w proporcjach baza:środek sieciujący 15:1 i 5:1 odpowiednio dla warstwy płynnej i kontrolnej.
3. Wiruj mieszaninę PDMS w proporcji 15:1 na formie warstwy płynnej (wafel #1) przez 30 sekund z prędkością 750 obr./min, a następnie umieść wafel na szalce Petriego. Umieść formę warstwy kontrolnej na szalce Petriego i wlej mieszaninę 5:1 PDMS na formę na grubość ~ 4 mm.
4. Piecz wafle/PDMS przez 30 minut w temperaturze 70°C, aby częściowo utwardzić warstwy PDMS.
5. Po schłodzeniu wafli/PDMS do temperatury pokojowej, odetnij skalpelem replikę PDMS, która utworzy warstwę kontrolną (wafel #2), z szalki Petriego i oderwij ją od formy SU-8. Przebij otwór w porcie dostępowym do mikrokanału, który będzie działał jako zawór membranowy na chipie za pomocą igły o rozmiarze 21.
6. Umieść replikę PDMS z warstwą kontrolną na płytce #1 (która ma warstwę fluidyczną PDMS pokrytą spinowo). Ostrożnie wyrównaj i uszczelnij warstwę kontrolną do warstwy płynowej za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie kieszenie powietrzne między warstwami i piecz w temperaturze 70°C przez noc, aby w pełni utwardzić obie warstwy. Ten etap pieczenia spowoduje, że powstanie monolityczna płyta PDMS z dwiema warstwami.
7. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej, odetnij i oderwij replikę PDMS zawierającą zarówno warstwę kontrolną, jak i płynną z formy SU-8 za pomocą skalpela. Usuń nadmiar PDMS i oddziel każdą jednostkę urządzenia żyletką. Porty dostępowe do otworów do mikrokanalików w warstwie płynowej za pomocą igły o rozmiarze 21.
8. Przymocuj płytę PDMS do szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać kompletne urządzenie. Najpierw wyczyść szkiełko nakrywkowe (nr: 1,5, 24 x 45 mm) acetonem i IPA. Następnie należy potraktować zarówno powierzchnię szkiełka nakrywkowego, jak i repliki PDMS plazmą tlenową poniżej 500 mTorr przez 30 sekund i natychmiast doprowadzić do zetknięcia się obu powierzchni, aby utworzyć nieodwracalne uszczelnienie.
9. Piecz urządzenia przez noc, aby zwiększyć wiązanie między warstwami PDMS a szkiełkiem nakrywkowym.

Kroki 3-4 opisują implementację pułapki hydrodynamicznej za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opisanego powyżej.

3. Eksperymentalna konfiguracja pułapki hydrodynamicznej

1. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu odwróconego i zabezpiecz je klipsami stolika.
2. Napełnij oddzielnie dwie gazoszczelne strzykawki roztworami buforu i próbki i umieść je na pompie strzykawkowej Harvard Apparatus (PHD 2000 Programmable). Bufor i roztwory próbki są dostarczane do urządzenia mikroprzepływowego odpowiednio przez strzykawkę o pojemności 1 ml i 250 μl. Zazwyczaj jako roztwór buforowy stosuje się 50 mM roztwór buforowy Tris/Tris HCl (pH 8,0) zawierający 0,02% v/v Triton X-100. Roztwór próbki składa się z zawiesiny cząstek (np. fluorescencyjnych kulek polistyrenu) w roztworze buforowym.
3. Ustalić połączenia płynowe między strzykawkami (dostarczającymi próbkę i buforem) a urządzeniem mikroprzepływowym. Podłączyć strzykawki do rurki perfluoroalkoksylowej (PFA) o średnicy zewnętrznej 1/16" x 0,020" średnicy wewnętrznej (ID) za pomocą adapterów luer-lock. Podłącz drugi koniec rurki PFA do portów wlotowych urządzenia mikroprzepływowego za pomocą metalowej rurki o rozmiarze 24. Zawór T można umieścić między strzykawką z próbką a portem próbki w urządzeniu mikroprzepływowym w celu kontrolowania dostarczania próbki.
4. Ustanowić połączenia hydrauliczne dla kanałów wylotowych w urządzeniu mikroprzepływowym. Podłącz dwa kanały wylotowe do rurki PFA (1/16" OD x 0,020" ID) za pomocą metalowej rurki o średnicy 24. Rurki PFA do wylotów powinny mieć równą długość. Zanurz obie probówki wylotowe w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej roztworem buforowym, który służy do utrzymania stałego spadku ciśnienia między strzykawkami a kanałami wylotowymi.
5. Napełnij zawór na chipie fluorowanym olejem nośnikowym za pomocą plastikowej strzykawki typu luer-lock o pojemności 3 ml, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do warstwy płynu podczas pracy. Powietrze w komorze zaworu jest przepychane przez membranę PDMS do mikrokanalika w warstwie płynowej, a następnie usuwane z urządzenia wraz z przepływem płynu przez porty wylotowe.
6. Podłącz zasilanie gazem obojętnym (azotem) pod ciśnieniem do portu w warstwie sterującej w celu obsługi zaworu na chipie. W tym celu używamy zbiornika azotu (2200 psi) i elektronicznego regulatora ciśnienia, który dostarcza 0-30 psi do zaworu na chipie w urządzeniu mikroprzepływowym. Zbiornik azotu jest podłączony do regulatora ciśnienia za pomocą rurki o średnicy zewnętrznej 1/4" x 0,170". Regulator ciśnienia jest podłączony do urządzenia mikroprzepływowego za pomocą rurki PFA 1/16" OD x 0,020" ID z metalową rurką o średnicy 24 na końcu.
7. Przepłukać połączenia fluidyczne i urządzenie mikroprzepływowe 0,5 ml roztworu buforowego, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z systemu, w tym z kanałów wylotowych. Typowe natężenia przepływu stosowane do usuwania pęcherzyków powietrza wahają się od 2000 do 5000 μl/h. Po wypłukaniu pęcherzyków powietrza z kanałów mikroprzepływowych należy zmniejszyć natężenie przepływu do 50-100 μl/h, co jest typowym objętościowym natężeniem przepływu dla wychwytywania cząstek.
8. W tym momencie ustanawiane są połączenia płynowe, próbka i roztwory buforowe są dostarczane do urządzenia mikroprzepływowego o stałym natężeniu przepływu (50-100 μl/h), a urządzenie jest gotowe do pułapki hydrodynamicznej.

4. Procedura pułapki hydrodynamicznej

1. Uruchom niestandardowy kod LabVIEW, który automatyzuje wychwytywanie cząstek (patrz Uwaga dotycząca użycia kodu LabVIEW poniżej).
2. Korzystając ze stolika translacyjnego x-y mikroskopu, umieść obszar zalewkowania (szczelinę krzyżową) na środku widoku kamery. Ustaw ostrość obszaru pułapkowania na soczewce obiektywu i dostosuj ustawienia aparatu, aby zoptymalizować warunki obrazowania.
3. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w polu widzenia kamery, tak aby środek obszaru zainteresowania był położeniem środka pułapki.
4. Zainicjuj ciśnienie przesunięcia przyłożone do zaworu w układzie scalonym. W jednym z kanałów wylotowych wprowadzane jest zwężenie o szerokości 100-200 μm, aby zapewnić zrównoważenie ciśnienia dla zaworu na chipie. Stałe ciśnienie przesunięte umożliwia zaworowi na chipie regulację położenia punktu stagnacji w pobliżu środka szczeliny poprzecznej kanału. W przypadku większości eksperymentów ciśnienie przesunięcia jest ustawiane w zakresie 0-12 psi w zależności od wymiarów kanału (wysokość i szerokość), szerokości zwężenia i specyfikacji zaworu w układzie scalonym (rozmiar zaworu, grubość membrany itp.).
5. Zainicjuj kontroler sprzężenia zwrotnego i dostosuj proporcjonalne wzmocnienie, aby zoptymalizować reakcję pułapki. Sterownik sprzężenia zwrotnego dostosuje ciśnienie przyłożone do zaworu w układzie scalonym w celu przesunięcia pozycji punktu stagnacji, co minimalizuje błąd lub odległość między pozycją cząstek a wartością zadaną (środek pułapki). W zależności od natężenia przepływu i położenia zaworu na chipie, istnieje optymalna proporcjonalna wartość wzmocnienia, która zwiększa stabilność pułapki i eliminuje niepożądane oscylacje cząstek.
6. Uwięzić cząstkę. Kod LabVIEW automatycznie wychwyci jedną z cząstek wchodzących do obszaru pułapki. Po uwięzieniu pożądanej cząstki możliwe jest odcięcie przepływu próbki i w razie potrzeby odizolowanie uwięzionej cząstki w roztworze buforowym.
7. Monitoruj uwięzioną cząstkę i utrzymuj ostrość cząstki w płaszczyźnie obrazu za pomocą ręcznego ustawiania ostrości lub automatycznej konfiguracji mikroskopu ostrości. Może być konieczne nieznaczne dostosowanie proporcjonalnego wzmocnienia sterownika ze sprzężeniem zwrotnym w celu zapewnienia stabilności pułapki w trakcie zdarzenia pułapki o długiej skali czasowej (od minut do godzin).

Kod LabVIEW: Uwaga dotycząca użycia kontrolera sprzężenia zwrotnego

Automatyczne wychwytywanie cząstek jest osiągane za pomocą algorytmu kontroli liniowego sprzężenia zwrotnego zaimplementowanego za pomocą niestandardowego kodu LabVIEW. Kod LabVIEW przechwytuje obrazy z kamery CCD i przesyła potencjał elektryczny (napięcie) do regulatora ciśnienia, który aktywnie moduluje położenie (stan częściowo otwarty/zamknięty) dynamicznego zaworu pneumatycznego na chipie. Wraz ze zmianą położenia zaworu, hydrodynamiczne natężenie przepływu w jednym przewodzie wylotowym jest regulowane, co powoduje zmianę położenia punktu stagnacji i umożliwia hydrodynamiczne uwięzienie. Kroki w pętli sprzężenia zwrotnego są wykonywane sekwencyjnie i iteracyjnie z szybkością przechwytywania obrazu (10-60 Hz). Kod LabVIEW wykonuje następujące kroki podczas każdego cyklu pętli sprzężenia zwrotnego:

• Przechwytywanie obrazu. Obraz jest uzyskiwany dla "docelowej" cząstki w obszarze pułapki urządzenia mikroprzepływowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z soczewką obiektywu 10x (NA: 0,4) i kamerą CCD.
• Śledzenie cząstek. Określane jest położenie środka ciężkości cząstek i inicjowany jest algorytm śledzenia cząstek. Cząstki są lokalizowane poprzez dopasowanie profilu intensywności emisji cząstki do funkcji rozrzutu punktowego (PSF), na podstawie której określa się położenie środka ciężkości.
• Sterowanie polem przepływu. Zaktualizowane ciśnienie przeznaczone dla wbudowanego zaworu dynamicznego jest obliczane przy użyciu algorytmu sterowania ze sprzężeniem zwrotnym ze sterownikiem proporcjonalnym. W ten sposób działanie zaworu polega na przesunięciu punktu stagnacji, który wywiera siłę hydrodynamiczną na cząstkę w celu skierowania cząstki w kierunku środka pułapki.

Kod LabVIEW rejestruje następujące dane dla każdego obrazu przechwyconego podczas wychwytywania cząstek: 1) czas, który upłynął, 2) położenie środka ciężkości (x,y) uwięzionej cząstki, 3) położenie środka pułapki, 4) odległość cząstki od środka pułapki, 5) ciśnienie przyłożone do zaworu na chipie. Ponadto kod nagrywa również film z uwięzioną cząstką w formacie pliku AVI.

5. Reprezentatywne wyniki

Uwięziliśmy fluorescencyjne kulki polistyrenowe o różnych rozmiarach (100, 540, 830 nm i średnicy 2,2 μm) za pomocą pułapki hydrodynamicznej. Rysunek 1(a) przedstawia obraz cząstki uwięzionej na skrzyżowaniu szczelinowym w urządzeniu mikroprzepływowym. Trajektoria uwięzionej cząstki może być wyznaczona bezpośrednio na podstawie danych o położeniu środka ciężkości zarejestrowanych przez kod LabVIEW podczas zdarzenia pułapkowania lub poprzez śledzenie i lokalizowanie uwięzionej cząstki z nagranego pliku filmowego. Rysunek 1(b) przedstawia trajektorię uwięzionej cząstki (2,2 μm fluorescencyjnej kulki polistyrenowej) wzdłuż kierunku kanału wylotowego. Koralik jest początkowo uwięziony (kwadraty) przez 3 minuty, a następnie jest uwalniany z pułapki i ucieka wzdłuż jednego z kanałów wylotowych (kółek). Trajektorie cząstek wzdłuż osi przepływu ściskającego (kierunek kanału wlotowego; dane nie pokazane) są podobne do trajektorii cząstek wzdłuż osi przepływu rozciągliwego (kierunek odpływu), jak pokazano na rysunku 1(b). Histogram przemieszczenia cząstek od środka pułapki dla uwięzionego koralika (średnica 2,2 μm) wzdłuż kierunków kanału wylotowego pokazano na rysunku 1(c). Korzystając z algorytmu sterowania ze sprzężeniem zwrotnym opisanego w tej pracy, uwięzione cząstki są ograniczone do ±1 μm od środka pułapki wzdłuż kierunku kanału wlotowego i wylotowego.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego używanego do hydrodynamicznego pułapkowania jest pokazany na rysunku 2. Zintegrowane urządzenie mikroprzepływowe składa się z warstwy płynowej i warstwy kontrolnej i jest wytwarzane przy użyciu standardowej wielowarstwowej miękkiej litografii, jak opisano w tym artykule. Warstwa płynowa zawiera kanały buforowe i próbki, a także geometrię kanału poprzecznego w celu ułatwienia pułapki hydrodynamicznej. Warstwa kontrolna składa się z zaworu pneumatycznego umieszczonego nad jednym z kanałów wylotowych w warstwie fluidalnej, a warstwa kontrolna i fluidyczna są oddzielone cienką membraną elastomerową. Podczas pracy urządzenia zawór w warstwie regulacyjnej jest pod ciśnieniem gazowego azotu, który wtłacza cienką membranę w warstwę płynową, wywołując w ten sposób zwężenie w kanale wylotowym. Dynamiczny zawór pneumatyczny zwęża kanał wylotowy o zmienne wartości poprzez zmianę ciśnienia przyłożonego do warstwy kontrolnej, która dostosowuje względne natężenia przepływu w kanałach wylotowych i umożliwia precyzyjną kontrolę punktu stagnacji.

Rysunek 1: Pułapkowanie cząstek. a) Obraz pojedynczego koralika zamkniętego w pułapce hydrodynamicznej. Oprócz ściegu w środku pułapki, w obszarze zalewkowania pokazanych jest kilka nieuwięzionych koralików. (b) Trajektoria uwięzionej cząstki wzdłuż kanałów wylotowych (kwadratów). Kiedy cząstka zostanie uwolniona z pułapki (strzałka), ucieka wzdłuż jednego z kanałów wylotowych (okręgów). (c) Histogram przemieszczeń uwięzionego koralika (o średnicy 2,2 μm) od środka pułapki wzdłuż kanałów wylotowych.

Rysunek 2: Schemat urządzenia mikroprzepływowego do pułapki hydrodynamicznej. Pułapka hydrodynamiczna zbudowana jest przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego. Warstwa fluidyczna składa się z wlotu próbki, czterech wlotów buforowych i dwóch wylotów odpadów. Warstwa kontrolna składa się z pneumatycznego zaworu membranowego umieszczonego na szczycie jednego z kanałów wylotowych w warstwie płynowej. Zwężenie w przeciwległym kanale wylotowym zapewnia ciśnienie przesunięcia dla zaworu pneumatycznego. Typowe wymiary kanałów wahają się od 100 do 500 μm. W obszarze (A) wlot próbki jest skoncentrowany na przepływie przez dwa wloty buforowe. W regionie (B) przeciwległe strumienie wlotowe zbiegają się na skrzyżowaniu ze szczeliną krzyżową, gdzie dochodzi do odłowu. Zawór pneumatyczny (C) jest umieszczony na górze jednego z kanałów wylotowych. Położenie punktu stagnacji jest modulowane poprzez regulację ciśnienia w tym zaworze.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.