Wstrzykiwanie do ściany pęcherza moczowego myszy jest przydatnym podejściem do ortotopowych badań nad biologią komórek macierzystych pęcherza oraz biologią nowotworów. Tę precyzyjną metodę mikrochirurgiczną można opanować dzięki starannej technice i praktyce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcja w ścianę pęcherza myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Iniekcja w ścianę pęcherza myszy jest użyteczną techniką do ortotopowych badań zjawisk zachodzących w pęcherzu, w tym biologii komórek macierzystych, mięśni gładkich oraz nowotworów. Przed rozpoczęciem iniekcji obszar operacyjny należy oczyścić wodą z mydłem oraz roztworem antyseptycznym. Sprzęt chirurgiczny musi zostać wysterylizowany przed użyciem oraz pomiędzy każdym zwierzęciem. Każdą mysz poddaje się znieczuleniu wziewnemu izofluranem (2-5% do indukcji, 1-3% do podtrzymania), a pęcherz zostaje odsłonięty poprzez wykonanie nożyczkami nacięcia w linii środkowej brzucha. Jeśli pęcherz jest pełny, należy go częściowo zdekompresować, delikatnie ściskając go dwoma palcami. Odpowiednią zawiesinę komórek wstrzykuje się domięśniowo w ścianę kopuły pęcherza, używając igły o rozmiarze 29 lub 30 G oraz strzykawki o pojemności 1 cc lub mniejszej. Ranę zamyka się za pomocą klipsów chirurgicznych, a mysz zostawia się do wybudzenia na podkładce grzewczej. Iniekcja w ścianę pęcherza jest delikatną techniką mikrochirurgiczną, którą można opanować poprzez praktykę.
Protokół
1. Iniekcja w ścianę pęcherza myszy
Wybór szczepu, wieku i płci myszy jest podyktowany potrzebami eksperymentalnymi. Stosujemy myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, ponieważ jest to okres dojrzałości immunologicznej poprzedzający procesy starzenia. Jako ogólną wytyczną przyjmuje się, że myszy powinny trafić do laboratorium co najmniej tydzień przed manipulacjami eksperymentalnymi, aby uniknąć czynników zakłócających wywołanych stresem.
- Oczyścić powierzchnię stołu operacyjnego wodą z mydłem.
- Przetrzeć powierzchnię stołu operacyjnego chusteczkami Cide Swipes lub chusteczkami antyseptycznymi.
- Wyklaweklać czyste instrumenty chirurgiczne przed użyciem w operacji.
- Dodatkowo wysterylizować instrumenty chirurgiczne w sterylizatorze koralikowym bezpośrednio przed użyciem, a także pomiędzy zwierzętami w trakcie operacji.
- Oczyścić strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μL i igły o grubości 29 lub 30 G (długości 1/2 cala) poprzez wielokrotne zasysanie i wstrzykiwanie alkoholu absolutnego przed pierwszym użyciem oraz po zakończeniu ostatniej procedury chirurgicznej.
- Myć i płukać strzykawki Hamiltona sterylnym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym pomiędzy kolejnymi zwierzętami.
- Zanurzyć myszy w znieczuleniu, umieszczając je w komorze indukcyjnej z izofluranem, przy ustawieniu stężenia izofluranu w zakresie 2-5%.
- Po osiągnięciu znieczulenia ogólnego wyjąć mysz z komory i ułożyć ją w pozycji grzbietowej na ciepłej podkładce, aby pomóc w utrzymaniu normalnej temperatury ciała.
- Utrzymać znieczulenie, umieszczając nos zwierzęcia w dyszy z odparowanym izofluranem (miareczkowanym od 1-3% w zależności od potrzeb, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie).
- Ogolić skórę brzucha za pomocą trymera.
- Użyć jednorazowej, sterylnej draperii chirurgicznej do zakrycia odbytu, aby zapobiec zanieczyszczeniu kałem podczas operacji.
- Użyć drugiej jednorazowej, sterylnej draperii chirurgicznej do zakrycia pola operacyjnego (dolna część brzucha).
- Przygotować brzuch za pomocą trzech kawałków gazy nasączonej Betadyną. Powtórzyć ten krok trzy razy.
- Używając mikroskopu sekcyjnego w celu powiększenia obrazu, wykonać nożyczkami nacięcie w linii środkowej w dolnej części brzucha.
- Odsłonić pęcherz moczowy.
- Jeśli pęcherz jest pełny, częściowo go odbarczyć, wywierając delikatny nacisk w dół w obrębie kopuły pęcherza.
- Wstrzyknąć roztwór próbki (do 50 μL), używając igły o grubości 29 lub 30 G i strzykawki, w ścianę kopuły pęcherza moczowego (wtrysk wewnątrzścienny), z otworem igły skierowanym do góry.
- Przesunąć tłok strzykawki, aby wstrzyknąć roztwór próbki do ściany pęcherza. Dobrze zlokalizowany pęcherzyk (bleb) świadczy o prawidłowym wstrzyknięciu komórek do ściany pęcherza.
- Wyjąć strzykawkę, zamknąć nacięcie za pomocą klipsów chirurgicznych i pozwolić myszy dojść do siebie na podkładce grzejnej.
2. Reprezentatywne wyniki:
Dobrze zlokalizowany pęcherzyk, który nie przecieka i zachowuje stabilną wielkość, świadczy o pomyślnym wstrzyknięciu komórek w ścianę pęcherza (Rysunek 1). W celu potwierdzenia obecności wstrzykniętych komórek w ścianie pęcherza można przeprowadzić analizę histologiczną.
Rycina 1. Przykład pomyślnego wstrzyknięcia w ścianę pęcherza moczowego z wykorzystaniem tuszu indyjskiego w celu ilustracji.
Rysunek 2. Schemat procedur eksperymentalnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wstrzyknięcie w ścianę pęcherza myszy umożliwia implantację określonych komórek do wyznaczonych obszarów ściany pęcherza. Technika ta ma szerokie zastosowanie w modelach mysich raka pęcherza moczowego, biologii mięśni gładkich oraz biologii komórek macierzystych. Z definicji wstrzyknięcie w ścianę pęcherza myszy ułatwia wprowadzenie komórek raka pęcherza lub komórek macierzystych do lokalizacji ortotopowej, co pozwala na badanie ich wzrostu i różnicowania w fizjologicznie istotnym kontekście anatomicznym. W rzeczywistośc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Z wdzięcznością potwierdzamy wsparcie w ramach grantu pilotażowego z Stanford Pediatric Research Fund oraz grantu K08DK087895-01 z NIDDK.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Izofluran (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Igły o rozmiarze 29 lub 30 G | Hamilton Co | 7803-06 lub 7803-07 | |
| Strzykawka 100 µL | Hamilton Co | 7656-01 |
Bibliografia
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
