Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

Podsumowanie

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Streszczenie

W tej prostej procedurze guzy pęcherza moczowego są indukowane u samic myszy C57 poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację i następującą po niej adhezję komórek. Po cewnikowaniu przezcewkowym i opróżnieniu pęcherzy moczowych, zwierzęta są ponownie cewnikowane, aby umożliwić wprowadzenie platynowego drutu do pęcherzy bez uszkadzania cewki moczowej lub pęcherza. Cewniki wykonane są z teflonu, który służy jako izolator drutu przewodzącego prąd elektryczny do pęcherza w celu wywołania oparzenia. Urządzenie do elektrokoagulacji jest wykorzystywane do dostarczenia mocy 2,5W do odsłoniętego końca drutu, co prowadzi do wypalenia warstw zewnątrzkomórkowych i stworzenia miejsc przyczepienia dla komórek raka, które są wprowadzane do pęcherza w zawiesinie podczas kolejnego cewnikowania. Komórki pozostają w pęcherzu przez 90 minut, po czym cewniki są usuwane, a pęcherze opróżniają się w sposób naturalny. Rozwój guza jest monitorowany za pomocą ultradźwięków. W dołączonym materiale wideo szczególną uwagę poświęcono technice cewnikowania.

Protokół

1. Zwierzęta

1. Samice myszy C57BL/6J (Mus musculus) są weryfikowane przez dostawcę przed wysyłką pod kątem braku zaraźliwych ektopasożytów, endopasożytów z grupy helmintów oraz przeciwciał przeciwko 17 wirusom mysim. Myszy są utrzymywane w akredytowanym przez AAALAC domu zwierząt Uniwersytetu Tulane zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.¹
2. W szczególności myszy są utrzymywane grupowo (4-5 myszy/klatka) w indywidualnie wentylowanych klatkach poliwęglanowych z filtrami mikroizolacyjnymi w pokrywach, na ściółce z twardego drewna. Mają do dyspozycji wodę z kranu oraz peletowaną karmę dla gryzoni ad libitum.
3. Przed rozpoczęciem badania myszy poddawane są 7-dniowej aklimatyzacji.

2. Komórki

1. Do wywołania guzów pęcherza moczowego wykorzystywana jest linia komórkowa raka przejściowego myszy MB49.
2. Komórki hoduje się w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy wołowej, 100 units/ml penicyliny oraz 100 units/ml streptomycyny.
3. Kultury utrzymuje się w temperaturze 37°C i 5% CO₂, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni.

3. Ortotopowy model nowotworu u zwierząt

Wprowadzenie modelu nowotworu pęcherza moczowego opisanego w niniejszej pracy jest modyfikacją procedury opisanej przez Gunthera i współpracowników²

1. Znieczulenie indukuje się 2% izofluranem (MWI/VetOne, Meridian, ID, Cat# 501017) w tlenie, a następnie utrzymuje na poziomie 0,75-1,25%. (Można traktować jednocześnie wiele zwierząt, co wymagałoby zwiększenia stężenia izofluranu). Aby zapobiec wysychaniu rogówki, oczy smaruje się maścią okulistyczną z łzami sztucznymi. Ciepłotę ciała utrzymuje się za pomocą podgrzewanej podkładki pod papierową ściereczką.
2. Sierść w dolnej części grzbietu zostaje przystrzyżona, aby ułatwić kontakt z metalową płytą uziemiającą, a ogoloną powierzchnię pokrywa się żelem przewodzącym.
3. Każdą mysz umieszcza się następnie indywidualnie w pozycji grzbietnej na metalowej płycie uziemiającej, a pęcherz cewnikuje się przez cewkę moczową, używając nasmarowanego cewnika dożylnego G24 o długości 3/4 cala z usuniętym prowadnikiem.
4. Z pęcherza moczowego odprowadza się mocz, a następnie przez cewnik do pęcherza wprowadza się platynowy drut, pozostawiając odsłonięte końce drutu po obu stronach cewnika – około 2 mm na końcu światła cewnika. Zastosowano drut platynowy ze względu na odporność tego materiału na utlenianie.
5. Następnie do pęcherza przykłada się prąd o mocy 2,5 W przez około 0,5 sekundy, dotykając zewnętrznej części drutu urządzeniem do elektrokoagulacji ustawionym w trybie koagulacji.
6. Drut zostaje następnie przesunięty w drugie miejsce w pęcherzu i przyłożony zostaje kolejny ładunek o mocy 2,5 W.
7. Drut zostaje usunięty, a przez cewnik do pęcherza za pomocą strzykawki 1 ml wprowadza się 100 μl komórek MB49 o stężeniu 1x10⁶ komórek/ml.
8. Strzykawki pozostawia się podłączone do cewników, aby zapobiec wyciekowi zawiesin komórkowych, a myszy z cewnikami utrzymuje się w znieczuleniu przez 90 minut, aby umożliwić przytwierdzenie się komórek do miejsc oparzeń.
9. Przed wybudzeniem każdej myszy podaje się drogą dosytrytchalną (IP) 100-200 μl sterylnej soli fizjologicznej.
10. Po zakończeniu okresu inkubacji cewniki zostają usunięte, a zwierzęta pozostawia się na podgrzewanej podkładce do momentu powrotu odruchu prostowania, po czym myszy przenosi się do ich klatek domowych.

4. Ultradźwięki

1. Guzy pozostawia się do wzrostu przez 3-5 dni, zanim myszy zostaną poddane badaniu ultrasonograficznemu pęcherza moczowego w celu monitorowania wzrostu nowotworu.
2. Przed wstępnymi badaniami ultrasonograficznymi zwierzęta znieczula się zgodnie z powyższym opisem. Myszy układa się w pozycji grzbietowej, a skórę brzucha przygotowuje poprzez przystrzyżenie futra.
3. Przez cewkę moczową do pęcherza moczowego wprowadza się cewnik dożylny o rozmiarze 24 gauge. Na tym etapie można opróżnić pęcherz i zebrać mocz do dalszych analiz.
4. Do pęcherza, poprzez cewnik, wprowadza się 100 μl sterylnej soli fizjologicznej, aby poprawić widoczność pęcherza w badaniu ultrasonograficznym.
5. Na brzuch nakłada się żel przewodzący, a następnie wykonuje się ultrasonografię w celu oceny ściany i światła pęcherza.

5. Reprezentatywne wyniki:

Tkanka nowotworowa zacznie pojawiać się od 3 do 5 dni po inokulacji. Z naszego doświadczenia wynika, że w grupie 12 myszy u 50% lub więcej osobników do piątego dnia rutynowo stwierdza się wykrywalną masę tkankową w pęcherzu moczowym (0,5 - 1,0 μl, stosując wzór V=π/6·L·W·H). W przypadku użycia komórek MB 49 guzy będą nadal rosnąć, a w grupie zwierząt nieleczonych konieczna będzie eutanazja do 24. dnia. Eutanazję zaleca się w sytuacji, gdy myszy stają się letargiczne lub kachektyczne, wykazują zjeżone futro, zgarbioną postawę i brak reakcji na bodźce lub gdy utracą 20% początkowej masy ciała.

Guzy szybko rosną i po osiągnięciu masy 200 mg lub więcej wykazują centra martwicze,³ co prawdopodobnie wynika z faktu, że komórki w rozwijającym się guzie proliferują szybciej, niż jest w stanie zapewnić angiogenna podaż krwi. Postęp wzrostu guza można również monitorować pośrednio poprzez poziom krwiomoczu, który jest prawdopodobnie związany z szybką angiogenezą w rozwijających się guzach. Konsekwentnie odnotowano, że w moczu nieleczonych myszy z guzami krew pojawiała się do 14 dnia. Koncentracja erytrocytów u tych myszy wydawała się zwiększać w czasie, a objętość zbieranego moczu malała. Guzy o masie przekraczającej 50 mg można również z względną łatwością wyczuć palpacyjnie, zazwyczaj do 14 dni po inokulacji.

Dyskusja

Tę małoinwazyjną metodę tworzenia ortotopowych guzów pęcherza u samic myszy można zastosować również w przypadku innych typów komórek niż MB49, choć należy spodziewać się odmiennych wyników. W przypadku użycia mniej agresywnych komórek nowotworowych, niewielkie zwiększenie mocy (w przyrostach 0,5 W w celu ustalenia nowego optimum) pozwoli uzyskać obszar bardziej podatny na przyleganie komórek nowotworowych, a dłuższy czas inkubacji wstrzykniętych komórek w pęcherzu spowoduje zwiększenie stopnia przylegania komórek w miej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57Bl/6J	Jackson Laboratory	000664	3-5-tygodniowe
Klatki z poliwęglanu i wentylowany regał	Lab Products	Super Mouse 750	327mm x 190mm x 143mm
Ściółka z twardego drewna	Harlan Laboratories	SaniChips klasy laboratoryjnej –
Karma dla gryzoni	Harlan Laboratories	Rodent Diet 2019
Kaniula do żył (IV)	MWI Veterinary Supply	009231	24 G x ¾ in.
Urządzenie do elektrokoagulacji	Bovie Medical Corporation	Aaron 900
Urządzenie do USG	Sonosite	180 Plus (Vet)
Linia komórkowa MB49	Wake Forest University Baptist Medical Center	N.D.
DMEM	Invitrogen	21063-029
Płodowa surowica bydlęca	Gemini Bio Products	100106 500A57B
Penicylina-Streptomycyna	Invitrogen	15140-163