$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Izolacja PBMC z warstwy leukocytarnej (buffy coat)
Monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMC) uzyskuje się poprzez wirowanie gradientowe na Ficoll-Paque z próbek warstwy leukocytowej pobranych od zdrowych dawców drogą leukaferezy.
- Wirowanie z użyciem Ficoll-Paque przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta z niewielkimi modyfikacjami.
- Dodać PBS do warstwy leukocytowej (buffy coat) z krwi dawcy zdrowego z banku krwi do uzyskania objętości końcowej 140 mL (typowa objętość warstwy leukocytowej wynosi 40-70 mL).
- Nanieść 35 mL próbki warstwy leukocytowej na 15 mL Ficoll-Paque (4 probówki).
- Wirować przy 400g przez 20 minut bez hamowania.
- Zebrać PBMC z interfejsu Ficoll-Paque:plazma; nie odrzucać erytrocytów (RBC) znajdujących się na dnie warstwy Ficoll-Paque.
- Przemyć PBMC trzykrotnie za pomocą PBS, wirowując za każdym razem przy 400g przez 10 minut.
- Na tym etapie PBMC mogą być bezpośrednio wykorzystane do ekspansji komórek NK lub komórki NK mogą zostać wyizolowane za pomocą metody RosetteSep (Sekcja 4).
- Pozostałe PBMC można zamrozić w FBS zawierającym 10% DMSO w ciekłym azocie.
- Odssać Ficoll i zebrać erytrocyty z kroku 5 do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 mL, przemyć trzykrotnie PBS-em (do poziomu 50 mL), za każdym razem odsysając supernatant, ściągając go z powierzchni warstwy erytrocytów, aby usunąć granulocyty.
- Erytrocyty mogą być niezwłocznie użyte do oczyszczania komórek NK metodą RosetteSep (patrz Sekcja 4) lub przechowywane w równej objętości roztworu Alsevera w temperaturze 4°C do późniejszego użycia (erytrocyty mogą być przechowywane maksymalnie przez 4 tygodnie).
2. Ekspansja komórek NK
Ekspansję komórek NK można rozpocząć, wykorzystując PBMC lub oczyszczone komórki NK. Ilość PBMC użytych do ekspansji może być zróżnicowana w zależności od pożądanej liczby komórek NK po trzech tygodniach procesu; szczegóły znajdują się w sekcji z reprezentatywnymi wynikami. (Patrz Uwaga 1)
STYMULACJA 1
Dzień 0
- Dla każdych 5x106 PBMC przeznaczonych do ekspansji, należy policzyć i naświetlić 10x106 K562 Cl9 mIL21 za pomocą irradiatora gamma dawką 100 Gy.
- Po naświetlaniu komórki należy przemyć PBS i resuspender w pożywce do ekspansji komórek NK (NKEM).
- 5x106 PBMC wraz z 10x106 naświetlonych K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:2) należy wysiać w 40 mL NKEM do kolby T75, a następnie umieścić kolbę w pozycji pionowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.
Dni 3 i 5
- Odwirować komórki z prędkością 400g przez 5 min, wymienić połowę pożywki na świeże NKEM (dodając świeże IL2 dla całej objętości pożywki) i kontynuować hodowlę.
STYMULACJA 2
Dzień 7
- Policz liczbę komórek w hodowli po upływie jednego tygodnia.
- Odbierz 5x105 komórek do fenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej (zob. Uwaga 2).
- Dla każdych 5x106 komórek przeznaczonych do restymulacji, odlicz i naświetl 5x106 komórek K562 Cl9 mIL21 za pomocą irradiatora gamma dawką 100 Gy.
- Dodaj równą liczbę naświetlonych komórek K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:1) i resuspenduj w NKEM do uzyskania stężenia 2.5x105 całkowitej liczby komórek/mL (zob. Uwaga 3).
- Wysiej komórki do kolb T75 (maksymalnie 50 mL na kolbę).
Dni 10 i 12
- Policz liczbę komórek.
- Wymień całą pożywkę na świeżą pożywkę NKEM, dostosowując jej objętość do liczby komórek (patrz Uwaga 3).
Dzień 14
- Po dwóch tygodniach ekspansji należy policzyć liczbę komórek w hodowli.
- Odstawić 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej (patrz Uwaga 2).
- Jeśli ekspansję rozpoczęto z PBMC, komórki NK można oczyścić na tym etapie ekspansji, stosując protokół oczyszczania RosetteSep (patrz sekcja IV). Jeśli ekspansję rozpoczęto z oczyszczonych komórek NK, należy przejść do stymulacji 3.
- Po oczyszczaniu odstawić 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej w celu weryfikacji czystości komórek NK (podobnie jak w kroku 8).
- Przejść do stymulacji 3, wykorzystując wszystkie oczyszczone komórki NK (patrz Uwaga 4).
STYMULACJA 3
- Resuspendować komórki NK z napromienionymi komórkami K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:1) w pożywce NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (patrz Uwaga 3).
Dni 17 i 19
- Policz liczbę komórek.
- Wymień medium na świeże NKEM w zależności od liczby komórek (zob. Uwaga 3).
Dzień 21
- Po trzech tygodniach ekspansji należy policzyć liczbę komórek w hodowli.
- Odzyskać 1x106 komórek do analizy cytometrii przepływowej z pełnym panelem przeciwciał do fenotypowania komórek NK (patrz Tabela 1).
- Zamrozić komórki w FBS zawierającym 10% DMSO, przy maksymalnej gęstości 5x107 komórek na fiolkę, do przyszłego wykorzystania.
3. Test cytotoksyczności komórek NK
- Odmrozić fiolkę komórek NK i wysiać je w NKEM na jeden dzień przed przeprowadzeniem testu cytotoksyczności, aby umożliwić ich regenerację.
- Dla każdego testu cytotoksyczności komórek NK z użyciem pojedynczej linii komórek docelowych wymagane jest 6x105 komórek NK i 3x105 komórek docelowych (patrz Uwaga 5).
- Przygotować CAM-Media poprzez rozcieńczenie Calcein-AM (stok 1 mg/mL w DMSO) w NKEM (patrz Uwaga 6).
- Resuspendować 106 komórek docelowych w 1 mL CAM-media (patrz Uwaga 7).
- Inkubować przez 1 h w 37 °C, okazjonalnie wstrząsając.
- Resuspendować komórki NK do stężenia 1x106 komórek/ mL i dodać 200uL zawiesiny komórek NK do każdego z 3 dołków płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, odpowiadających stosunkowi E:T 10:1 pokazanemu na Rysunku 1. (patrz Uwaga 8)
- Dodać 100uL pełnej pożywki do wszystkich pozostałych dołków z wyjątkiem dołka „Maximum”.
- Dodać 100uL 2% Triton X-100 do dołka „Maximum”.
- Wykonać rozcieńczenia seryjne komórek NK dla 5 kolejnych stosunków E:T, przenosząc za każdym razem 100uL komórek i dokładnie mieszając. Odrzucić 100uL z ostatnich dołków (stosunek E:T 0,3125:1).
- Po 1 godzinie obciążania kalceiną, przemyć komórki docelowe dwa razy w NKEM, wirując przez 5 min przy 1200 rpm. (patrz Uwaga 9)
- Ponownie policzyć komórki docelowe i resuspendować do stężenia 1x105 komórek/ mL.
- Dodać 100 μL komórek docelowych do każdego dołka (1x104/dołek). Wirować przez 1 min przy 100g, aby zainicjować kontakt między komórkami.
- Inkubować w 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
- Delikatnie wymieszać kulturę, pipetując dozaorkiem 100 μL w celu jednorodnego zawieszenia uwolnionej kalceiny, odwirować płytkę przy 100g przez 5 minut, aby osadzić komórki, a następnie przenieść 100 μL supernatantu do nowej płytki, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przebić ewentualne pęcherzyki za pomocą cienkiej igły.
- Odczytać płytkę za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (filtr wzbudzenia 485 nm, filtr emisji 530 nm). Zalecany jest odczyt od dołu.
- Obliczyć procent specyficznej lizy zgodnie ze wzorem [(uwolnienie testowe - uwolnienie spontaniczne) / (uwolnienie maksymalne - uwolnienie spontaniczne)] x 100.
4. Oczyszczanie komórek NK metodą RosetteSep
- Do probówki o pojemności 50 mL przenieść 100-krotną nadwyżkę RBC względem liczby PBMC lub komórek namnożonych (stosunek RBC:PBMC 100:1).
- W przypadku użycia świeżych RBC przejść bezpośrednio do następnego kroku; jeśli RBC były przechowywane w roztworze Alsevera, należy policzyć RBC i trzykrotnie przemyć odpowiednią ilość RBC (100-krotna nadwyżka) w PBS uzupełnionym o 2% FBS, odwirując przy 1200 rpm przez 10 minut w każdym cyklu.
- Połączyć RBC z PBMC z kroku 1.7 lub komórkami namnożonymi z kroku 2.10 w PBS + 2% FBS do objętości końcowej 1 mL na 5x107 PBMC lub komórek namnożonych.
- Dodać 1μL koktajlu RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail na 1x106 PBMC lub komórek namnożonych.
- Wymieszać dokładnie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
- Dodać taką samą objętość mieszaniny PBS + 2% FBS, delikatnie wymieszać i nanieść warstwowo na Ficoll-Paque.
- Powtórzyć etapy wirowania z Ficoll-Paque opisane dla izolacji PBMC (Sekcja I).
- Policzyć odzyskane komórki NK po puryfikacji i odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek NK (Krok 8).
5. Uwagi
UWAGA 1. Komórki NK można namnażać bezpośrednio z PBMC lub z komórek NK oczyszczonych za pomocą RosetteSep. Odnotowaliśmy podobną wydajność namnażania, jednak u niektórych dawców liczba komórek NK może być bardzo niska, co może utrudnić oczyszczanie metodą RosetteSep przed namnażaniem.
UWAGA 2. Do fenotypowania podczas ekspansji rutynowo stosujemy CD56-FITC, CD16-PE oraz CD3-PE-Cy5, określając komórki NK jako te, które są CD3-ujemne oraz CD16- lub CD56-dodatnie.
UWAGA 3. Przy każdej zmianie medium lub stymulacji resuspenderć komórki do stężenia 2.5 x 105/mL, aby utrzymać liczbę komórek PBMC/NK na poziomie 2 milionów na mL lub poniżej w szczytowych fazach ekspansji. Zapobiegnie to wyczerpaniu składników odżywczych i pomoże osiągnąć maksymalną ekspansję oraz przeżywalność.
UWAGA 4. Tempo ekspansji komórek NK zależy od dawcy, a po zakończeniu pierwszej lub drugiej stymulacji część komórek można zamrozić, a część dalej namnażać, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Uzyskaliśmy dobre wyniki, wykorzystując zamrożone komórki do późniejszej ekspansji.
UWAGA 5. Aby zapewnić margines błędu, zaleca się użycie co najmniej 7x105 komórek NK resuspendowanych w 700 uls NKEM oraz 4x105 komórek docelowych barwionych Calcein-AM resuspendowanych w 4 mL NKEM podczas przygotowania testu cytotoksyczności. W przypadku użycia pipety wielokanałowej do wysiewu komórek docelowych, w zależności od rozmiaru używanego zbiornika na medium, może być wymagana większa objętość komórek (do 6x105 w 6 mL). Ponadto zalecana liczba komórek NK odnosi się konkretnie do stosunków E:T przedstawionych w protokole; w przypadku stosowania wyższych stosunków E:T należy odpowiednio zwiększyć liczbę komórek NK na mL (np. dla stosunku E:T 40:1 należy użyć 4x106 komórek/mL).
UWAGA 6. Zalecamy przeprowadzenie wstępnego miareczkowania ładowania Calcein-AM dla wybranej linii komórkowej, stosując następujące rozcieńczenia: 1:500, 1:400, 1:300, 1:200 oraz 1:100, aby uzyskać optymalną różnicę między uwalnianiem maksymalnym a spontanicznym.
UWAGA 7. W przypadku użycia adhezyjnej linii komórkowej jako celu, należy najpierw przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, używając nieenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek. Jeśli przeprowadzany jest test ADCC, należy przygotować drugą probówkę z komórkami docelowymi w medium CAM.
UWAGA 8. W przypadku przeprowadzania ADCC, należy dodać te same komórki NK do 3 studzienek odpowiadających stosunkowi E:T 10:1 dla ADCC. Powtórzyć procedurę dla dodatkowych dawców. Powtórzyć procedurę dla dodatkowych komórek docelowych.
UWAGA 9. W przypadku przeprowadzania eksperymentu ADCC, po 45 minutach ładowania kalceiny, należy dodać 10ug przeciwciała specyficznego dla indukowania ADCC przeciwko komórkom docelowym. Po kolejnych 15 minutach komórki docelowe należy przemyć dwukrotnie w pożywce kompletnej, wirując przez 5 min przy 1200 rpm. Następnie należy resuspenderć komórki w stężeniu 1x105 cells/ mL i przejść do następnego kroku protokołu.
6. REPREZENTATYWNE WYNIKI
Rysunek 2. W przypadku przeprowadzenia ekspansji zgodnie z opisanym powyżej schematem, przy użyciu 5x10⁶ PBMC jako materiału wyjściowego, typowe wydajności komórek NK wynoszą od 1x109 do 1010 komórek (zmienność zależna od dawcy). Rysunek przedstawia krotność ekspansji komórek NK (n=19) w porównaniu do liczby komórek NK obecnych w produkcie pierwotnym (mediana +/- kwartyle).
Rysunek 3. Namnożone komórki NK wykazują ekspresję różnych receptorów komórek NK, która jest porównywalna z ekspresją w nie-namnożonych pierwotnych komórkach NK, z kilkoma wyjątkami (CD11b, CD160 i CD244).
Rycina 4. Odzysk PBMC z warstwy leukocytarnej (buffy coat) zależy od dawcy i może wynosić od 300x106 do 800x106. Komórki NK mogą stanowić od 2% do 18% PBMC. W przypadku oczyszczania namnożonych komórek metodą RosetteSep, odzysk czystych komórek NK w 14. dniu wynosi od 40% do 70%. Przy zastosowaniu zalecanego protokołu namnażania i oczyszczania można spodziewać się czystości komórek NK na poziomie 99%.
Rysunek 5. Ekspandowane komórki NK wykazały cytotoksyczność wobec szeregu linii komórkowych nowotworowych, w tym neuroblastoma, AML, osteosarcoma i melanoma (przedstawiono reprezentatywne zabijanie komórek AML jako procent specyficznej lizy).