Artykuł metodologiczny

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

53.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2540

⸱

2 lutego 2011

 ,  ,  , 
1Division of Pediatrics, MD Anderson Cancer Center - University of Texas

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Streszczenie

Komórki NK (natural killer) odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym przeciwko różnorodnym mikroorganizmom zakaźnym i nowotworom. Ograniczona dostępność komórek NK oraz możliwości ich ekspansji in vitro hamowały rozwój immunoterapii opartej na tych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji dużych ilości funkcjonalnych komórek NK ex vivo z wykorzystaniem komórek K562 wykazujących ekspresję związanego z błoną IL21, pełniących rolę sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC).

Dotychczasowe terapie adopcyjne z wykorzystaniem komórek NK opierały się na produkcie komórkowym uzyskanym poprzez leukaferezę dawcy w stanie stacjonarnym, a następnie deplecję limfocytów T lub selekcję pozytywną komórek NK. Produkt ten jest zazwyczaj aktywowany w IL-2 przez noc, a następnie podawany następnego dnia 1. Ze względu na niską częstotliwość występowania komórek NK we krwi obwodowej, w badaniach klinicznych podawano stosunkowo niewielkie liczby komórek NK.

Brak możliwości namnażania komórek NK in vitro był czynnikiem ograniczającym w generowaniu wystarczającej liczby komórek dla uzyskania optymalnego efektu klinicznego. Pewna ekspansja komórek NK (5-10 krotnie w ciągu 1-2 tygodni) została osiągnięta przy zastosowaniu wyłącznie wysokich dawek IL-2 2. Aktywacja autologicznych limfocytów T może pośredniczyć w ekspansji komórek NK, prawdopodobnie również poprzez uwalnianie lokalnych cytokin 3. Wsparcie za pomocą stromy mezenchymalnej lub sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) może wspomagać ekspansję komórek NK zarówno z krwi obwodowej, jak i krwi pępowinowej 4. Połączona aktywacja NKp46 i CD2 za pomocą kulek powlekanych przeciwciałami jest obecnie oferowana komercyjnie w celu ekspansji komórek NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), co skutkuje około 100-krotnym wzrostem liczby komórek w ciągu 21 dni.

Trwają badania kliniczne z wykorzystaniem komórek NK rozszerzonych lub aktywowanych za pomocą aAPC, w tym jedno z użyciem linii komórek białaczkowych CTV-1 do primingu i aktywacji komórek NK5 bez znaczącej ekspansji. Drugie badanie wykorzystuje EBV-LCL do ekspansji komórek NK, osiągając średni 490-krotny wzrost w ciągu 21 dni6. Trzecie badanie wykorzystuje aAPC na bazie K562 transdukowane 4-1BBL (CD137L) oraz błonową IL-15 (mIL-15)7, co pozwoliło na średnio 277-krotną ekspansję komórek NK w ciągu 21 dni. Chociaż komórki NK rozszerzone przy użyciu aAPC K562-41BBL-mIL15 wykazują wysoką cytotoksyczność in vitro i in vivo w porównaniu do nierozszerzonych komórek NK oraz uczestniczą w ADCC, ich proliferacja jest ograniczona przez starzenie się przypisywane skracaniu telomerów8. Niedawno zgłoszono 350-krotną ekspansję komórek NK z wykorzystaniem K562 wykazujących ekspresję MICA, 4-1BBL oraz IL159.

Opisana tutaj metoda ekspansji komórek NK zapewnia szybką proliferację tych komórek bez indukowania starzenia się, osiągając medianę 21 000-krotnej ekspansji w ciągu 21 dni.

Protokół

1. Izolacja PBMC z warstwy leukocytarnej (buffy coat)

Mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) uzyskuje się poprzez wirowanie w gradiencie gęstości na Ficoll-Paque z próbek warstwy leukocytarnej od zdrowych dawców, pobranych metodą leukaferezy.

  1. Wirowanie z użyciem Ficoll-Paque przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta z niewielkimi modyfikacjami.
  2. Do warstwy leukocytarnej (buffy coat) pobranej od zdrowego dawcy z banku krwi dodać PBS do uzyskania objętości końcowej 140 mL (typową objętością warstwy leukocytarnej jest 40-70 mL).
  3. Nanieść 35 mL próbki warstwy leukocytarnej na 15 mL Ficoll-Paque (do 4 probówek).
  4. Wirować przy 400g przez 20 minut bez hamowania.
  5. Odessać PBMC z interfejsu Ficoll-Paque:plazma; nie usuwać erytrocytów znajdujących się na dnie warstwy Ficoll-Paque.
  6. Przemyć PBMC trzy razy PBS, wirować za każdym razem przy 400g przez 10 minut.
  7. Na tym etapie PBMC można wykorzystać bezpośrednio do ekspansji komórek NK lub można wyizolować komórki NK za pomocą metody RosetteSep (Sekcja 4).
  8. Pozostałe PBMC można zamrozić w FBS zawierającym 10% DMSO w ciekłym azocie.
  9. Odssać Ficoll i zebrać erytrocyty z kroku 5 do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 mL, przemyć trzy razy PBS (uzupełniając do poziomu 50 mL), za każdym razem odsysając nadosad z powierzchni warstwy erytrocytów w celu usunięcia granulocytów.
  10. Erytrocyty można wykorzystać natychmiast do oczyszczania komórek NK metodą RosetteSep (patrz Sekcja 4) lub przechowywać w równej objętości roztworu Alsevera w temperaturze 4°C do późniejszego użycia (erytrocyty można przechowywać maksymalnie przez 4 tygodnie).

2. Ekspansja komórek NK

Ekspansję komórek NK można rozpocząć, używając PBMC lub oczyszczonych komórek NK. Ilość PBMC wykorzystywanych do ekspansji może być zróżnicowana w zależności od pożądanej liczby komórek NK po trzech tygodniach ekspansji; szczegóły znajdują się w sekcji z reprezentatywnymi wynikami. (Patrz Uwaga 1)

STYMULACJA 1

Dzień 0

  1. Dla każdej porcji 5x106 PBMC przeznaczonych do ekspansji, odlicz i napromieniuj 10x106 komórek K562 Cl9 mIL21 za pomocą irradiatora gamma dawką 100 Gy.
  2. Po napromieniowaniu przemyj komórki PBS i resuspenduj w pośrodku do ekspansji komórek NK (NKEM).
  3. Wysiej 5x106 PBMC wraz z 10x106 napromieniowanych komórek K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:2) w 40 mL NKEM w kolbie T75, a następnie umieść ją w pozycji pionowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.

Dzień 3 i 5

  1. Odwirować komórki przy 400g przez 5 min, wymienić połowę pożywki na świeżą NKEM (dodając świeże IL2 dla całej objętości pożywki) i kontynuować hodowlę.

STYMULACJA 2

Dzień 7

  1. Policz liczbę komórek w hodowli po upływie jednego tygodnia.
  2. Odstaw 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej (Patrz Uwaga 2)
  3. Dla każdych 5x106 komórek przeznaczonych do restymulacji, policz i napromieniuj 5x106 K562 Cl9 mIL21 przy użyciu irradiatora gamma dawką 100 Gy.
  4. Dodaj równą liczbę napromieniowanych komórek K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:1) i resuspenduj w NKEM do stężenia 2.5x105 całkowitej liczby komórek/mL (Patrz Uwaga 3).
  5. Wysiej komórki do kolb T75 (maksymalnie 50 mL na kolbę).

Dzień 10 i 12

  1. Policz liczbę komórek.
  2. Wymień całe medium na świeże NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (zobacz Notatkę 3).

Dzień 14

  1. Po dwóch tygodniach ekspansji należy policzyć liczbę komórek w hodowli.
  2. Osobno należy odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej (patrz Uwaga 2).
  3. Jeśli ekspansja została rozpoczęta z PBMC, komórki NK można oczyścić na tym etapie ekspansji, stosując protokół oczyszczania RosetteSep (patrz Sekcja IV). Jeśli ekspansja została rozpoczęta z oczyszczonych komórek NK, należy przejść do stymulacji 3.
  4. Po oczyszczaniu należy odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej w celu zweryfikowania czystości komórek NK (podobnie jak w kroku 8).
  5. Należy przejść do stymulacji 3, wykorzystując wszystkie oczyszczone komórki NK (patrz Uwaga 4).

STYMULACJA 3

  1. Resuspendować komórki NK wraz z napromieniowanymi komórkami K562 Cl9 mIL21 (w stosunku 1:1) w pożywce NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (patrz Uwaga 3).

Dni 17 i 19

  1. Policz liczbę komórek.
  2. Wymień medium na świeże NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (zob. Uwaga 3).

Dzień 21

  1. Po trzech tygodniach ekspansji należy policzyć liczbę komórek w hodowli.
  2. Odzyskać 1x106 komórek do analizy cytometrycznej z wykorzystaniem pełnego panelu przeciwciał do fenotypowania komórek NK (patrz Tabela 1).
  3. Zamrozić komórki w FBS zawierającym 10% DMSO przy maksymalnej gęstości 5x107 komórek na fiolkę do późniejszego użycia.

3. Test cytotoksyczności komórek NK

  1. Odmrozić fiolkę komórek NK i wysiać je w pożywce NKEM na jeden dzień przed wykonaniem testu cytotoksyczności, aby umożliwić ich regenerację.
  2. Do każdego testu cytotoksyczności komórek NK z użyciem pojedynczej linii komórek docelowych wymagane jest 6x105 komórek NK oraz 3x105 komórek docelowych (patrz Uwaga 5).
  3. Przygotować pożywkę CAM, rozcieńczając Calcein-AM (roztwór stokowy 1 mg/mL w DMSO) w NKEM (patrz Uwaga 6).
  4. Resuspendować 106 komórek docelowych w 1 mL pożywki CAM (patrz Uwaga 7).
  5. Inkubować przez 1 h w 37 °C, okazjonalnie wstrząsając.
  6. Resuspendować komórki NK do stężenia 1x106 komórek/mL i dodać 200uL zawiesiny komórek NK do każdego z 3 dołków płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, odpowiadających stosunkowi E:T 10:1 przedstawionemu na Rysunku 1. (patrz Uwaga 8)
  7. Dodać 100uL pełnej pożywki do wszystkich pozostałych dołków, z wyjątkiem dołka „Maximum”.
  8. Dodać 100uL 2% Triton X-100 do dołka „Maximum”.
  9. Wykonać rozcieńczenia seryjne komórek NK dla 5 kolejnych stosunków E:T, przenosząc za każdym razem 100uL komórek i dokładnie mieszając. Odrzucić 100uL z ostatnich dołków (stosunek E:T 0,3125:1).
  10. Po 1 godzinie ładowania kalceinyy przemyć komórki docelowe dwukrotnie w NKEM, wirując przez 5 min przy 1200 rpm. (patrz Uwaga 9)
  11. Ponownie policzyć komórki docelowe i resuspendować do stężenia 1x105 komórek/mL.
  12. Dodać 100 μL komórek docelowych do każdego dołka (1x104/dołek). Wirować przez 1 min przy 100g, aby zainicjować kontakt między komórkami.
  13. Inkubować w 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
  14. Delikatnie wymieszać kulturę, pipetując dozakiem 100 μL w celu jednorodnego zawieszenia uwolnionej kalceiny, odwirować płytkę przy 100g przez 5 minut, aby osadzić komórki, a następnie przenieść 100 μL supernatantu do nowej płytki, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki usunąć za pomocą cienkiej igły.
  15. Odczytać płytkę za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (filtr wzbudzenia 485 nm, filtr emisji 530 nm). Zalecany jest odczyt od dna.
  16. Obliczyć procent specyficznej lizy zgodnie ze wzorem [(uwolnienie testowe - uwolnienie spontaniczne)/(uwolnienie maksymalne - uwolnienie spontaniczne)] x 100.

4. Oczyszczanie komórek NK metodą RosetteSep

  1. Do probówki o pojemności 50 mL przenieść 100-krotną nadwyżkę RBC względem liczby PBMCs lub komórek namnożonych (stosunek RBC:PBMC 100:1).
  2. W przypadku użycia świeżych RBC przejść bezpośrednio do następnego kroku; jeśli RBC były przechowywane w roztworze Alsevera, należy policzyć RBC i wyprać odpowiednią ilość (100-krotna nadwyżka) w PBS uzupełnionym o 2% FBS trzykrotnie, wirując przy 1200 rpm przez 10 minut w każdym cyklu.
  3. Połączyć RBC z PBMCs z kroku 1.7 lub komórkami namnożonymi z kroku 2.10 w PBS + 2% FBS do objętości końcowej 1 mL na każde 5x107 PBMCs lub komórek namnożonych.
  4. Dodać 1μL RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail na każde 1x106 PBMCs lub komórek namnożonych.
  5. Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
  6. Dodać taką samą objętość PBS + 2% FBS, delikatnie wymieszać i nanieść warstwowo na Ficoll-Paque.
  7. Powtórzyć etapy wirowania na Ficoll-Paque opisane dla izolacji PBMCs (Sekcja I).
  8. Policzyć odzyskane komórki NK po oczyszczaniu i odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek NK (Krok 8).

5. Uwagi

UWAGA 1. Komórki NK można namnażać bezpośrednio z PBMC lub z komórek NK oczyszczonych metodą RosetteSep. Odnotowano podobną wydajność namnażania, jednak u niektórych dawców liczba komórek NK może być bardzo niska, co może utrudnić oczyszczanie metodą RosetteSep przed namnażaniem.

UWAGA 2. Do fenotypowania podczas ekspansji rutynowo stosujemy CD56-FITC, CD16-PE oraz CD3-PE-Cy5, licząc komórki NK jako te, które są CD3-ujemne i CD16- lub CD56-dodatnie.

UWAGA 3. Przy każdej wymianie pożywki lub stymulacji resuspenderze komórki w stężeniu 2.5 x 105/mL, aby utrzymać liczbę komórek PBMC/NK na poziomie 2 milionów na mL lub poniżej w szczytowych fazach ekspansji. Zapobiegnie to wyczerpaniu składników odżywczych i pomoże osiągnąć maksymalną ekspansję oraz przeżywalność.

UWAGA 4. Szybkość ekspansji komórek NK zależy od dawcy; po pierwszej lub drugiej stymulacji część komórek można zamrozić, a część dalej namnażać, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Osiągnęliśmy dobre wyniki, wykorzystując zamrożone komórki do ekspansji w późniejszym terminie.

UWAGA 5. Aby zachować margines błędu, zalecamy użycie minimum 7x105 komórek NK resuspenderowanych w 700 uls NKEM oraz 4x105 komórek docelowych zabarwionych Calcein-AM resuspenderowanych w 4 mL NKEM do przygotowania testu cytotoksyczności. W przypadku użycia pipety wielokanałowej do wysiewu komórek docelowych, w zależności od wielkości zastosowanego zbiornika na medium, mogą być wymagane większe objętości komórek (do 6x105 w 6 mL). Ponadto zalecana liczba komórek NK odnosi się konkretnie do stosunków E:T przedstawionych w protokole; w przypadku stosowania wyższych stosunków E:T należy odpowiednio zwiększyć liczbę komórek NK na mL (np. dla stosunku E:T 40:1 należy użyć 4x106 komórek/mL)

UWAGA 6. Zalecamy przeprowadzenie wstępnego miareczkowania ładowania Calcein-AM dla wybranej linii komórkowej, stosując następujące rozcieńczenia: 1:500, 1:400, 1:300, 1:200 oraz 1:100, aby uzyskać optymalną różnicę między uwalnianiem maksymalnym a spontanicznym.

UWAGA 7. W przypadku użycia adherentnej linii komórkowej jako komórek docelowych, należy najpierw przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, korzystając z nieenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek. Jeśli przeprowadzany jest test ADCC, należy przygotować drugą probówkę z komórkami docelowymi w medium CAM.

UWAGA 8. W przypadku przeprowadzania ADCC, należy dodać te same komórki NK do 3 studzienek odpowiadających stosunkowi E:T 10:1 dla ADCC. Powtórzyć procedurę dla dodatkowych dawców. Powtórzyć procedurę dla dodatkowych komórek docelowych.

UWAGA 9. W przypadku przeprowadzania eksperymentu ADCC, po 45 minutach ładowania kalceiny, należy dodać 10ug przeciwciała specyficznego dla indukcji ADCC przeciwko komórkom docelowym. Po kolejnych 15 minutach komórki docelowe należy dwukrotnie przemyć w pożywce kompletnej, wirując przez 5 min przy 1200 rpm. Komórki należy resuspender do stężenia 1x105 cells/ mL i przejść do następnego kroku protokołu.

6. REPREZENTATYWNE WYNIKI

Wykres danych dotyczących krotności ekspansji; analiza poszczególnych dawców; wykres punktowy z słupkami błędów.
Rycina 2. Gdy ekspansja jest przeprowadzana zgodnie z powyższym schematem, z wykorzystaniem 5x10⁶ PBMC jako materiału wyjściowego, typowe wydajności komórek NK wynoszą od 1x109 do 1010 komórki (zmienność zależna od dawcy). Rycina przedstawia krotność ekspansji komórek NK (n=19) w porównaniu do liczby komórek NK obecnych w produkcie wyjściowym (mediana +/- kwartyl).

Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiające markery powierzchniowe komórek, analiza przed i po ekspansji w dniu 21.
Rycina 3. Ekspandowane komórki NK wykazują ekspresję różnych receptorów komórek NK, która jest porównywalna do nieekspandowanych pierwotnych komórek NK, z kilkoma wyjątkami (CD11b, CD160 oraz CD244).

Schemat cytometrii przepływowej obrazujący PBMC i namnożone komórki NK za pomocą markerów CD3, CD16, proces RosetteSep.
Rycina 4. Odzysk PBMC z warstwy leukocytarnej (Buffy coat) jest zależny od dawcy i może wynosić od 300x106 do 800x106. Komórki NK mogą stanowić 2% - 18% PBMC. W przypadku oczyszczania namnożonych komórek metodą RosetteSep, odzysk czystych komórek NK w 14. dniu wynosi od 40-70%. Stosując zalecany protokół namnażania i oczyszczania, można oczekiwać czystości komórek NK na poziomie 99%.

Liza komórek AML w zależności od stosunku E:T; wykres porównujący AML10 i AML13; analiza cytotoksyczności; komórki NK.
Rycina 5. Ekspandowane komórki NK wykazały cytotoksyczność wobec szeregu linii komórkowych nowotworowych, w tym neuroblastoma, AML, osteosarcoma i melanoma (przedstawiono reprezentatywną aktywność zabijania komórek AML jako procent specyficznej lizy).

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Laurence Cooper, Harjeet Singh oraz Lence Hurton za ich pracę przy tworzeniu początkowych wektorów fuzyjnych K562 aAPC i mIL21.

Finansowanie niniejszej pracy zostało zapewnione przez UT MD Anderson Physician Scientist Program, St. Baldrick's Foundation oraz Legends of Friendswood.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Pożywka do ekspansji i aktywacji komórek NK (NKEM)

90% RPMI 1640Cellgro
10% płodowej surowicy bydlęcejGibco
1x penicylina / streptomycynaCellgro
1x L-glutaminaGibcoPrzed użyciem wysterylizować pożywkę przez filtr.
50 U/ mL IL2Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)Rozcieńczone z roztworu zapasowego 200 IU/μl. Dodawać IL2 do wymaganej ilości pożywki bezpośrednio przed każdym użyciem.
[header]

Izolacja PBMC i komórek NK

Ficoll-PaqueGE Healthcare
roztwór AlseveraSigma)
koktajl do wzbogacania ludzkich komórek NK RosetteSepStemcell Technologies)
[header]

Test cytotoksyczności komórek NK

Calcein-AMInvitrogen
[header]

Przeciwciała

Lista przeciwciał użytych do fenotypowania komórek NK znajduje się w poniższej tabeli:

Probówka 1: (objętość całkowita 100)

Przeciwciało: izotyp FITCBD Pharmingen555748Objętość: 5
Przeciwciało: izotyp FITCBD Pharmingen555749Objętość: 5
Przeciwciało: izotyp FITCBD Pharmingen557224Objętość: 5
Przeciwciało: izotyp FITCBD Pharmingen340442Objętość: 5
Przeciwciało: bufor FACSBD PharmingenObjętość: 80

Probówka 2: (objętość całkowita 100)

Przeciwciało: CD56 FITCBD Pharmingen340410Objętość: 5
Przeciwciało: NKp30 PEBD Pharmingen558407Objętość: 5
Przeciwciało: NKp44 PEBD Pharmingen558563Objętość: 5
Przeciwciało: NKp46 PEBD Pharmingen557991Objętość: 5
Przeciwciało: CD3 PE-Cy5BD Pharmingen555341Objętość: 5
Przeciwciało: CD16 Alexa 647BD Pharmingen557710Objętość: 5
Przeciwciało: bufor FACSBD PharmingenObjętość: 70

Probówka 3: (objętość całkowita 100)

Przeciwciało: CD56 FITCBD Pharmingen340410Objętość: 5
Przeciwciało: KIR2DL1 PER&D SystemsFAB1844PObjętość: 5
Przeciwciało: KIR2DL2/3 PEMiltenyi Biotec130-092-618Objętość: 5
Przeciwciało: KIR3DL1 PER&D SystemsFAB12251PObjętość: 5
Przeciwciało: CD3 PE-Cy5BD Pharmingen555341Objętość: 5
Przeciwciało: NKG2D APCBD Pharmingen558071Objętość: 5
Przeciwciało: bufor FACSBD PharmingenObjętość: 70

Probówka 4: (objętość całkowita 100)

Przeciwciało: CD56 FITCBD Pharmingen340410Objętość: 5
Przeciwciało: CD11b PEBD Pharmingen555388Objętość: 5
Przeciwciało: CD3 PE-Cy5BD Pharmingen555341Objętość: 5
Przeciwciało: CD27 APCBD Pharmingen558664Objętość: 5
Przeciwciało: bufor FACSBD PharmingenObjętość: 80

Probówka 5: (objętość całkowita 100)

Przeciwciało: CD56 FITCBD Pharmingen340410Objętość: 5
Przeciwciało: CD266 (DNAM-1) PEBD Pharmingen559789Objętość: 5
Przeciwciało: CD3 PE-Cy5BD Pharmingen555341Objętość: 5
Przeciwciało: CD160 Alexa647eBiosciences51-1609-42Objętość: 5
Przeciwciało: bufor FACSBD PharmingenObjętość: 80

Probówka 6: (objętość całkowita 100)

Przeciwciało: CD56 FITCBD Pharmingen340410Objętość: 5
Przeciwciało: CD244 (2B4) PEBD Pharmingen550816Objętość: 5
Przeciwciało: CD3 PE-Cy5BD Pharmingen555341Objętość: 5
Przeciwciało: CD197 (CCR7) APCeBiosciences17-1979-42Objętość: 5
Przeciwciało: bufor FACSBD PharmingenObjętość: 80

Bibliografia

  1. McKenna, D. H. Jr Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience. Transfusion. 47, 520-520 (2007).
  2. Koehl, U. ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children. Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).
  3. Klingemann, H. G., Martinson, J. ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications. Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).
  4. Ayello, J. Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering. Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).
  5. Carlens, S. A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells. Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).
  6. Boissel, L. Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells. Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).
  7. North, J. Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation. J Immunol. 178, 85-85 (2007).
  8. Berg, M. Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells. Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).
  9. Fujisaki, H. Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy. Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).
  10. Fujisaki, H. Replicative potential of human natural killer cells. Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).
  11. Gong, W. Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15. Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspansja komórek NKsztuczne komórki prezentujące antygen K562IL-21 związana z błonąoczyszczanie metodą rozetki SEPfenotypowanie metodą cytometrii przepływowejtest cytotoksycznościtest uwalniania wapniahodowla komórkowa ex vivonapromieniowanie gamma
Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.