Artykuł metodologiczny

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów boreliozy w jelicie kleszcza

DOI:

10.3791/2544

⸱

14 lutego 2011

 ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, University of Maryland, 2Department of Entomology, Connecticut Agricultural Experiment Station

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad boreliozą często wymagają generowania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co zwykle trwa kilka tygodni. Tutaj demonstrujemy procedurę infekcji kleszcza opartą na mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Demonstrujemy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi w kleszczach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Borelioza jest spowodowana zakażeniem patogenem krętka Borrelia burgdorferi, który jest utrzymywany w naturze przez cykl infekcji kleszcz-gryzoń 1. Mysi model 2 przenoszony przez kleszcze został opracowany do badania boreliozy w laboratorium. Podczas gdy naiwne kleszcze mogą zostać zarażone B. burgdorferi, żywiąc się nimi na zakażonych myszach, proces linienia trwa od kilku tygodni do miesięcy. Dlatego opracowanie szybszych i skuteczniejszych technik zakażeń kleszczami, takich jak procedura oparta na mikroiniekcjach, jest ważnym narzędziem do badania boreliozy 3,4. Procedura wymaga tylko kilku godzin do wygenerowania zakażonych kleszczy i pozwala na kontrolę nad dostarczaniem równych ilości krętków w kohorcie kleszczy. Jest to szczególnie ważne, ponieważ wytwarzanie się kleszczy zakażonych B. burgdorferi w naturalnym procesie żerowania na myszach nie zapewnia 100% wskaźnika infekcji i potencjalnie prowadzi do zmienności obciążenia patogenami wśród karmionych kleszczy. Ponadto mikroiniekcja może być stosowana do zakażania kleszczy izolatami B. burgdorferi w przypadkach, gdy atenuowany szczep nie jest w stanie wywołać infekcji u myszy, a zatem nie może zostać naturalnie nabyty przez kleszcze 5. Technika ta może być również stosowana do dostarczania kleszczom wielu innych materiałów biologicznych, na przykład specyficznych przeciwciał lub dwuniciowego RNA 6. W tym artykule zademonstrujemy mikroiniekcję kleszczy nimfalnych za pomocą B. burgdorferi wyhodowanych in vitro. Opiszemy również metodę lokalizacji patogenów boreliozy w jelicie kleszcza za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikroiniekcja kleszczy Nimfala Ixodes scapularis

1. Przygotowanie igieł

  1. Wytwarzanie kilku igieł do mikroiniekcji poprzez podgrzanie i wyciągnięcie szklanych kapilar o średnicy 1 mm (World Precision Instruments) w szklanym urządzeniu do ściągania mikropipet (Narishige). Ostrożnie wyjmij delikatne rurki kapilarne.
  2. Trzymaj wyciągnięte igły (końcówką skierowaną do góry) na taśmie klejącej na szalce Petriego.

2. Przygotowanie B. burgdorferi

  1. Hodować B. burgdorferi w pożywkach hodowlanych BSK 7 do stężenia około 10-7 komórek na ml. Krętki są liczone pod mikroskopem ciemnego pola za pomocą komory liczącej Petroffa-Haussera (Hausser scientific).
  2. Osad B. burgdorferi przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant i całkowicie ponownie zawiesić osad w pożywce BSK, delikatnie przechodząc przez sterylną mikrokońcówkę o pojemności 200 μl do końcowego stężenia10-9 komórek na ml. Ponieważ komórki są ponownie zawieszane przy dużej gęstości komórek i mogą się zlepiać, zawiesinę komórkową należy natychmiast użyć do mikroiniekcji.

3. Przygotowanie kleszczy

  1. Umieść przezroczystą, dwustronną taśmę klejącą na szklanym szkiełku.
  2. Pracując na lepkiej macie, ostrożnie usuń nimfalne kleszcze z pojemnika za pomocą małej szczoteczki.
  3. Umieść wymaganą liczbę kleszczy do wstrzyknięcia na taśmie samoprzylepnej, brzuszną stroną do góry, skierowaną w tym samym kierunku.

4. Wstrzykiwanie kleszczy

  1. Załadować 5 μl kultury B. burgdorferi do wyciągniętej igły kapilarnej za pomocą końcówki do pipety z mikroładowarką o pojemności 20 μl (Eppendorf). Sprawdzić, czy w igle nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby ponownie załadować igłę kulturą bakteryjną.
  2. Obejrzyj kleszcza pod mikroskopem dwuokularowym i skup się na obszarze otworu odbytu kleszcza. Delikatnie dotknąć końcówki igły kapilarnej, aby przerwać rurkę, której średnica jest nieco mniejsza niż średnica otworu odbytu kleszcza, tworząc igłę do mikroiniekcji. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ każda próba wstrzyknięcia kleszcza za pomocą nieodpowiedniej końcówki igły powoduje obrażenia i możliwą śmierć wstrzykniętego kleszcza.
  3. Umieść unieruchomione kleszcze pod mikroskopem dwuokularowym i skup się na otworze odbytu, który jest pokryty dwiema ruchomymi płytkami odbytu. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie dotknij i delikatnie uciskaj dowolny obszar w pobliżu otworu odbytu. Umożliwi to oddzielenie płytek odbytu i otwarcie porów odbytu, które łączą się z jelitami. Ostrożnie włóż końcówkę igły lekko do otworu odbytu przez wymuszony otwór płytek odbytu. Wkłucie igły powinno być ograniczone do minimum, ponieważ szklana końcówka może uszkodzić półprzezroczyste jelito tylne, które łączy się z odbytnicą. Za pomocą mikrowstrzykiwacza wyposażonego w automatyczne sterowanie nożne (Eppendorf) wstrzyknąć roztwór B. burgdorferi, stosując następujące parametry: ciśnienie iniekcji 1 000 hektopaskali (hPa), czas wstrzyknięcia 0,2 sekundy i ciśnienie kompensacyjne 8 hPa. Każdy kleszcz otrzymuje pojedynczą iniekcję.
  4. Po mikroiniekcji kleszcze powinny zachowywać się podobnie do stanu sprzed iniekcji. Na przykład kleszcz powinien czołgać się w odpowiedzi na bodźce.
  5. Zwykle pozwalamy kleszczom na regenerację przez 48 godzin w komorze środowiskowej ustawionej na 24°C z 16 godzinami/8 godzinami jasnego/ciemnego schematu fotoperiodycznego i wilgotnością 95%. Jeśli komora nie jest dostępna, wstrzyknięte kleszcze można przechowywać w temperaturze pokojowej w wilgotnych warunkach w hermetycznym pojemniku, takim jak zwykła komora eksykatora. W razie potrzeby czas rekonwalescencji kleszczy można również skrócić do kilku godzin przed użyciem do żerowania na myszach.

2. Lokalizacja B. burgdorferi za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej

1. Analizowanie kleszczy

  1. Umieść kroplę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na czystym szkiełku w celu rozwarstwienia, a drugą na szkiełku pokrytym poli-L-lizyną (Sigma) do mikroskopii. Przygotuj kolejne szkiełko z dwustronną taśmą klejącą.
  2. Usuń kleszcza z pojemnika i umieść na dwustronnej taśmie klejącej za pomocą małego pędzelka.
  3. Obejrzyj i ustaw ostrość kleszcza w mikroskopie preparacyjnym. Umieść ostrą żyletkę na kleszczu między pierwszą a drugą parą nóg. Mocno dociśnij, przecinając kleszcza na dwie części, umożliwiając dostęp do brzucha. Natychmiast zanurz brzuch w kropli PBS.
  4. Za pomocą bardzo cienkich kleszczy chwyć egzoszkielet grzbietowy i brzuszny wokół miejsca cięcia. Ostrożnie pociągnij tarczę grzbietową do góry i odsuń ją od kleszcza, odsłaniając brązowawe uchyłki jelit. Uważaj, aby przez cały czas trzymać kleszcze preparujące pod PBS.
  5. Półprzezroczyste wiązki gruczołów ślinowych znajdują się po obu stronach przedniej części jelita i w razie potrzeby można je usunąć w tym momencie. Trzymając pozostały egzoszkielet na miejscu za pomocą kleszczy, ostrożnie wyciągnij jelito z brzucha.
  6. Delikatnie oczyść jelito, usuwając wszelkie uwięzione tkanki (na przykład tchawicę).
  7. Za pomocą końcówki cienkich kleszczyków szybko przenieś jelito kleszcza w kropelce PBS na szkiełku z poli-L-lizyny. Podziel jelito na mniejsze kawałki za pomocą cienkich ostrzy lub delikatnie dociskając końcówką cienkich kleszczyków. Ostrożnie odessać nadmiar PBS wokół tkanek jelitowych.
  8. Pozostaw tkanki jelitowe do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
  9. Napraw jelito kleszcza, zanurzając je w acetonie na 10 minut. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Na tym etapie preparaty można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze -20°C w hermetycznym pojemniku.

2. Barwienie

  1. Za pomocą bibułki usuń nadmiar wilgoci wokół tkanki i narysuj okrąg wokół wysuszonego jelita kleszcza za pomocą długopisu lub dowolnego hydrofobowego urządzenia wyściełającego barierę. Pomoże to zatrzymać roztwory barwiące podczas kolejnych etapów inkubacji.
  2. Przykryj jelito kleszcza jedną lub kilkoma kroplami buforu blokującego (0,05% Tween-20, 5% koziej surowicy w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Surowica używana do blokowania zależy od źródła zwierzęcia gospodarza dla przeciwciała. Nie pozwól, aby szkiełko wyschło od tego momentu.
  3. Powoli zasysać bufor blokujący. Inkubować jelito z odpowiednimi roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i/lub wtórnych. Używamy przeciwciała anty-B. burgdorferi znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Kirkegaard & Perry Laboratories) w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przykryj pojemnik folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło.
  4. Usunąć roztwór przeciwciała przez delikatne aspiracje. Inkubuj jelito za pomocą barwnika fluorescencyjnego, aby oznaczyć tkanki kleszczy, takie jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub jodek propidyny. Zwykle używamy 20 μg/ml jodku propidyny (Sigma) w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj 3 razy z 0,05% Tween-20 w PBS.
  6. Zamontuj szkiełko w buforowanym glicerolu zawierającym odczynnik zapobiegający blaknięciu, taki jak Slowfade (Invitrogen) i ostrożnie przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Na tym etapie szkiełka można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4°C w hermetycznym pojemniku. Zobrazuj i zlokalizuj B. burgdorferi pod mikroskopem konfokalnym.

3. Reprezentatywne wyniki

Pozycja kleszcza nimfalnego do mikroiniekcji oraz obraz reprezentujący lokalizację B. burgdorferi w jelicie kleszcza są przedstawione na rysunku 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Mikroiniekcja i lokalizacja B. burgdorferi w jelicie kleszcza.
(A) Widok brzuszny kleszcza nimfalnego I. scapularis ustawionego do mikroiniekcji. Przysłona odbytu (grot strzałki) z włożoną igłą do mikroiniekcji (strzałka) jest pokazana w powiększeniu we wstawce. Cienki kleszcz służy do wywierania delikatnego nacisku na ciało, co umożliwiło oddzielenie płytek odbytu i otwarcie porów odbytu w celu mikroiniekcji. Igła jest wypełniona roztworem błękitu brylantowego Coomassie w celu poprawy widoczności. (B) Reprezentatywne wyniki konfokalnego obrazowania immunofluorescencyjnego B. burgdorferi w jelicie kleszcza. Pokazany jest przedni obszar uchyłka jelita. Jądra jelitowe i krętki (strzałka) są oznaczone odpowiednio jodkiem propidyny (kolor czerwony) lub anty-B. burgdorferi sprzężonym z FITC (kolor zielony). Bar = 20 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu demonstrujemy procedurę opartą na mikroiniekcji w celu szybkiego i skutecznego zakażenia nimfalnych kleszczy Ixodes patogenem bakteryjnym B. burgdorferi. Opisano również procedurę immunofluorescencji konfokalnej do wykrywania B. burgdorferi w jelicie kleszcza in situ. Chociaż nasza demonstracja obejmuje jelito nimfalne, podobne procedury mają również zastosowanie do innych etapów rozwojowych kleszczy, takich jak larwy lub dorosłe osobniki 8,9. Jednak ze względu na ich...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy członkom laboratorium Pal za pomoc w przygotowaniu tej demonstracji. Badanie to było wspierane przez granty PHS AI076684 i AI080615 z NIH/NIAID.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szklane rurki kapilarneWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-4
Pionowy ściągacz do szkłaNarishige InternationalPC-10
Komora licząca Petroff-HausserHausser Scientific3900
Końcówki do pipet do mikroładowarekEppendorf930001007
Mikrowtryskiwacz FemtojetEppendorf920010504
Sterownik nożny FemtJetEppendorf920005098
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher ScientificBP665-1Sterylizowana filtrem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
  2. Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
  3. Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
  4. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
  5. Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
  6. Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
  7. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
  8. Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
  9. Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
  10. Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
  11. Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
  12. Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lyme Disease PathogensTick Gut LocalizationMicroinjection ProcedureConfocal MicroscopyBorrelia BurgdorferiTick DissectionImmunofluorescence LabelingGlass Capillary NeedlesBacterial Culture PreparationAnal Aperture Access

Powiązane artykuły