Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Borelioza jest wywoływana przez zakażenie krętkami z gatunku Borrelia burgdorferi, których obecność w naturze jest podtrzymywana przez cykl zakażeń kleszcz-gryzoń 1. W celu badania boreliozy w warunkach laboratoryjnych opracowano mysi model przenoszony przez kleszcze 2. Choć naiwne kleszcze mogą zostać zakażone B. burgdorferi poprzez żerowanie na zakażonych myszach, proces linienia trwa od kilku tygodni do kilku miesięcy. Dlatego opracowanie szybszych i bardziej wydajnych technik zakażania kleszczy, takich jak procedura oparta na mikroiniekcji, stanowi istotne narzędzie w badaniach nad boreliozą 3,4. Procedura ta wymaga zaledwie kilku godzin w celu uzyskania zakażonych kleszczy i pozwala na kontrolę nad podaniem równych ilości krętków w kohorcie kleszczy. Jest to szczególnie ważne, ponieważ generowanie kleszczy zakażonych B. burgdorferi poprzez naturalny proces żerowania na myszach nie gwarantuje 100% wskaźnika zakażeń i może prowadzić do zmienności ładunku patogenów wśród nakarmionych kleszczy. Ponadto mikroiniekcję można wykorzystać do zakażania kleszczy izolatami B. burgdorferi w przypadkach, gdy szczep atenuowany nie jest w stanie wywołać zakażenia u myszy, a tym samym nie może zostać nabyty naturalnie przez kleszcze 5. Technika ta może być również stosowana do wprowadzania do kleszczy różnych innych materiałów biologicznych, na przykład specyficznych przeciwciał lub dwuniciowego RNA 6. W niniejszym artykule zaprezentujemy mikroiniekcję nimf kleszczy krętkami B. burgdorferi hodowanymi in vitro. Opiszemy również metodę lokalizacji patogenów boreliozy w jelicie kleszcza z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Protokół
1. Mikroiniekcja nimf kleszczy Ixodes scapularis
1. Przygotowanie igieł
- Wykonaj kilka igieł do mikroiniekcji poprzez podgrzanie i wyciągnięcie szklanych kapilar o średnicy 1 mm (World Precision Instruments) w urządzeniu do wyciągania mikropipet (Narishige). Ostrożnie wyjmij delikatne kapilary.
- Przechowuj wyciągnięte igły (koncówkami skierowanymi do góry) na taśmie klejącej w szalce Petriego.
2. Przygotowanie B. burgdorferi
- Hodować B. burgdorferi w pożywce BSK 7 do uzyskania stężenia około 107 komórek na mL. Spirochety należy policzyć pod mikroskopem w ciemnym polu za pomocą komory liczbowej Petroffa-Haussera (Hausser scientific).
- Osadzić B. burgdorferi poprzez wirowanie przy 3,0 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i całkowicie resuspender osad w pożywce BSK, delikatnie przepuszczając go przez sterylną końcówkę 20 μL, aż do uzyskania końcowego stężenia 109 komórek na mL. Ponieważ komórki są resuspenderowane przy wysokiej gęstości i mogą się aglomerować, zawiesinę komórkową należy wykorzystać do mikroiniekcji natychmiast.
3. Przygotowanie kleszczy
- Naklej przezroczystą, dwustronną taśmę klejącą na szkiełko przedmiotowe.
- Pracując na matie klejącej, ostrożnie przenieś nimfy kleszczy z pojemnika za pomocą małego pędzla.
- Umieść wymaganą liczbę kleszczy przeznaczonych do iniekcji na taśmie klejącej, stroną brzuszną do góry, wszystkie skierowane w tym samym kierunku.
4. Iniekcja kleszczy
- Do wyciągniętej igły kapilarnej pobierz 5 μL kultury B. burgdorferi, używając końcówki mikropipety 20 μL (Eppendorf). Sprawdź, czy w igle nie ma pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby ponownie pobierz kulturę bakterii.
- Obejrzyj kleszcza pod binokularowym mikroskopem stereotypowym i ustaw ostrość na obszar otworu odbytniczego kleszcza. Delikatnie dotknij końcówką igły kapilarnej w celu przełamania rurki w miejscu, gdzie jej średnica jest nieco mniejsza niż średnica otworu odbytniczego kleszcza, tworząc igłę do mikroiniekcji. Ten krok jest krytyczny, ponieważ każda próba iniekcji kleszczy za pomocą niewłaściwej końcówki igły powoduje obrażenia i możliwą śmierć iniekcyjnego kleszcza.
- Umieść unieruchomione kleszcze pod binokularowym mikroskopem stereotypowym i ustaw ostrość na otwór odbytniczy, który jest przykryty dwiema ruchomymi płytkami analnymi. Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie dotknij i wywrzyj bardzo lekki nacisk na dowolny obszar w pobliżu otworu odbytniczego. Pozwoli to na rozdzielenie płytek analnych i otwarcie poru analnego prowadzącego do jelita. Ostrożnie wprowadź końcówkę igły lekko do otworu odbytniczego przez wymuszone otwarcie płytek analnych. Wprowadzenie igły powinno być ograniczone do minimum, ponieważ szklana końcówka mogłaby uszkodzić półprzezroczyste jelito tylne łączące się z odbytnicą. Używając mikroinjektora wyposażonego w automatyczny sterownik nożny (Eppendorf), wstrzyknij roztwór B. burgdorferi, stosując następujące parametry: ciśnienie iniekcji 1 0 hektopaskali (hPa), czas iniekcji 0,2 sekundy oraz ciśnienie kompensacyjne 8 hPa. Każdy kleszcz otrzymuje jedną iniekcję.
- Po mikroiniekcji kleszcze powinny zachowywać się podobnie jak przed zabiegiem. Na przykład kleszcz powinien pełzać w odpowiedzi na bodźce.
- Zazwyczaj pozwalamy kleszczom regenerować się przez 48 godzin w komorze klimatycznej ustawionej na 24°C z fotoperiodem 16 godzin światła/8 godzin ciemności i wilgotnością 95%. Jeśli komora nie jest dostępna, iniekcyjne kleszcze można przechowywać w temperaturze pokojowej w wilgotnych warunkach w szczelnym pojemniku, takim jak zwykła komora eksykatora. W razie potrzeby czas regeneracji kleszczy można skrócić do kilku godzin przed wykorzystaniem ich do żerowania na myszach.
2. Lokalizacja B. burgdorferi za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej
1. Disekcja kleszczy
- Nanieś kroplę soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na czyste szkiełko przedmiotowe do sekcji oraz kolejną kroplę na poly-L-szkiełko pokryte lizyną (Sigma) do mikroskopii. Przygotować drugie szkiełko przedmiotowe z dwustronną taśmą klejącą.
- Wyjąć kleszcza z pojemnika i umieścić go na dwustronnej taśmie klejącej za pomocą małego pędzelka.
- Obejrzyj i ustaw ostrość na kleszcza w mikroskopie sekcyjnym. Umieść ostrze brzytwy na kleszczu pomiędzy pierwszą a drugą parą odnóży. Mocno naciśnij, przecinając kleszcza na dwie części, aby uzyskać dostęp do odwłoka. Bezzwłocznie zanurz odwłok w kropli PBS.
- Za pomocą bardzo precyzyjnej pęsety chwyć grzbietowy i brzuszny egzoszkielet wokół miejsca nacięcia. Ostrożnie odciągnij tarczę grzbietową od kleszcza, odsłaniając brunatne dywertykuła jelitowe. Należy pamiętać, aby preparowane kleszcze przez cały czas znajdowały się w PBS.
- Półprzezroczyste pęczki gruczołów ślinowych znajdują się po obu stronach przedniego odcinka przewodu pokarmowego i mogą zostać w tym momencie usunięte, jeśli jest to pożądane. Trzymając pozostałą część egzoszkieletu pęsetą, ostrożnie wyciągnij przewód pokarmowy z jamy brzusznej.
- Ostrożnie oczyść jelito, usuwając wszelkie uwięzione tkanki (np. tchawicę).
- Za pomocą końcówki precyzyjnej pęsety szybko przenieś jelito kleszcza w kropli PBS na poly-Lszkiełko z lizyną. Podziel jelito na mniejsze fragmenty, używając cienkich ostrzy lub delikatnie naciskając końcówką precyzyjnej pęsety. Ostrożnie odessij nadmiar buforu PBS znajdujący się wokół tkanek jelita.
- Pozostawić tkanki jelitowe do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
- Utrwal prążki jelita kleszcza, zanurzając je w acetonie na 10 minut. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Na tym etapie preparaty na szkiełkach mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze -20°C w szczelnym pojemniku.
2. Barwienie
- Używając ręcznika papierowego, usuń nadmiar wilgoci wokół tkanki i obrysuj wysuszone jelito kleszcza za pomocą pisaka do wosku lub innego urządzenia tworzącego barierę hydrofobową. Pomoże to zatrzymać roztwory barwiące podczas kolejnych etapów inkubacji.
- Przykryj jelito kleszcza jedną lub kilkoma kroplami buforu blokującego (0,05% Tween-20, 5% surowicy koziej w PBS) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Surowica użyta do blokowania zależy od gatunku zwierzęcia gospodarza, z którego pochodzi przeciwciało. Od tego momentu nie dopuść do wyschnięcia preparatu na szkiełku.
- Powoli odessij bufor blokujący. Inkubuj jelito z odpowiednimi roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i/lub drugorzędowych. Stosujemy przeciwciała anty-B. burgdorferi znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Kirkegaard & Perry Laboratories) w rozcieńczeniu 1:10 w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przykryj pojemnik folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło.
- Usuń roztwór przeciwciał poprzez delikatne odessanie. Inkubuj jelito z barwnikiem fluorescencyjnym do znakowania tkanek kleszcza, takim jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub jodek propidyny. Zazwyczaj stosujemy 20 μg/mL jodku propidyny (Sigma) w PBS przez 5 min. w temperaturze pokojowej.
- Przemyj 3 razy roztworem 0,05% Tween-20 w PBS.
- Zamocuj preparat na szkiełku w buforowanym glicerolu zawierającym odczynnik zapobiegający blaknięciu, taki jak Slowfade (Invitrogen), i ostrożnie przykryj szkiełkiem coverglass. Na tym etapie preparaty można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4°C w szczelnym pojemniku. Wykonaj obrazowanie i zlokalizuj B. burgdorferi pod mikroskopem konfokalnym.
3. Reprezentatywne wyniki
Na rysunku 1 przedstawiono pozycję nimfy kleszcza do mikroiniekcji oraz obraz reprezentujący lokalizację B. burgdorferi w jelicie kleszcza.
Rycina 1. Mikroiniekcja i lokalizacja B. burgdorferi do jelita kleszcza.
(A) Widok brzuszny nimfy *I. scapularis* Kleszcz w pozycji do mikroiniekcji. Otwór odbytniczy (grot strzałki) z wprowadzoną igłą do mikroiniekcji (strzałka) przedstawiono w powiększeniu na wstawce. Do wywarcia delikatnego nacisku na ciało użyto precyzyjnej pęsety, co pozwoliło na rozdzielenie płytek odbytniczych i otwarcie otworu odbytniczego w celu przeprowadzenia mikroiniekcji. Igła jest wypełniona roztworem Coomassie brilliant blue w celu zwiększenia widoczności. (B) Reprezentatywne wyniki obrazowania immunofluorescencyjnego konfokalnego dla B. burgdorferi wewnątrz jelita kleszcza. Przedstawiono przednią część dywertykulum jelita. Jądra komórkowe jelita i spirochety (strzałka) są znakowane jodkiem propidyny (kolor czerwony) lub przeciwciałami sprzężonymi z FITC przeciwkoB. burgdorferi (kolor zielony), odpowiednio. Pasek skali = 20 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy prezentujemy procedurę opartą na mikroiniekcji w celu szybkiego i wydajnego zakażania nimf kleszczy z rodzaju Ixodes bakteryjnym patogenem B. burgdorferi. Opisujemy również procedurę konfokalnej immunofluorescencji do detekcji B. burgdorferi w jelicie kleszcza in situ. Choć nasza demonstracja dotyczy jelit nimf, podobne procedury można zastosować również w innych stadiach rozwojowych kleszczy, takich jak larwy lub osobniki dorosłe 8,9. Jednak ze względu na ich mnie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Serdecznie dziękujemy członkom laboratorium Pal za pomoc w przygotowaniu tej demonstracji. Badanie to było wspierane przez granty PHS AI076684 oraz AI080615 z NIH/NIAID.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szklane kapilary | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Pionowy wyciągacz do szkła | Narishige International | PC-10 | |
| Komora licząca Petroffa-Haussera | Hausser Scientific | 3900 | |
| Końcówki do pipety Microloader | Eppendorf | 930001007 | |
| Mikroinjektor Femtojet | Eppendorf | 920010504 | |
| Sterownik nożny FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Fosforanowy bufor solny | Fisher Scientific | BP665-1 | Sterylizowany filtracyjnie |
Bibliografia
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
