Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Podsumowanie

Prezentujemy zastosowanie mikromacierzy DNA w profilowaniu ekspresji układu nerwowego. Opisujemy kontrolę jakości RNA, znakowanie próbek oraz hybrydyzację i skanowanie macierzy.

Streszczenie

Profilowanie ekspresji genów w układzie nerwowym za pomocą mikromacierzy stanowi potężne narzędzie do identyfikacji aktywności genów w różnych etapach rozwoju, w różnych stanach fizjologicznych lub patologicznych, w odpowiedzi na terapię, a w ogólnym ujęciu – w każdym stanie poddawanym testom eksperymentalnym¹. Profilowanie ekspresji tkanek neuronalnych wymaga izolacji wysokiej jakości RNA, amplifikacji wyizolowanego RNA oraz hybrydyzacji z mikromacierzami DNA. W niniejszym artykule opisujemy protokoły powtarzalnych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy w tkance guza mózgu². Rozpoczniemy od przeprowadzenia analizy kontroli jakości wyizolowanych próbek RNA przy użyciu technologii „lab-on-a-chip” z Bioanalizatora 2100 firmy Agilent. Wysoka jakość próbek RNA jest kluczowa dla powodzenia każdego eksperymentu z mikromacierzami, a Bioanalizator 2100 umożliwia szybki, ilościowy pomiar jakości próbki. Następnie próbki RNA są amplifikowane i znakowane poprzez przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania cDNA, a następnie transkrypcji in vitro w obecności znakowanych nukleotydów w celu wytworzenia znakowanego cRNA. Korzystając z zestawu do znakowania dwukolorowego, znakujemy próbkę eksperymentalną Cy3, a próbkę referencyjną Cy5. Obie próbki zostaną następnie połączone i poddane hybrydyzacji z macierzami 4x44 K firmy Agilent. Macierze dwukolorowe oferują zaletę bezpośredniego porównania dwóch próbek RNA, co zwiększa dokładność pomiarów, szczególnie w przypadku niewielkich zmian poziomów ekspresji, ponieważ dwie próbki RNA hybrydyzują konkurencyjnie do jednej mikromacierzy. Macierze zostaną przeskanowane przy dwóch odpowiadających im długościach fal, a stosunek sygnału Cy3 do Cy5 dla każdego elementu posłuży jako bezpośredni pomiar względnej zawartości odpowiadającego mRNA. Analiza ta pozwala zidentyfikować geny, których ekspresja różni się w odpowiedzi na badane warunki eksperymentalne.

Protokół

1. Analiza kontroli jakości próbki RNA za pomocą Bioanalizatora 2100

Przed rozpoczęciem,

1. Denaturuj marker wielkości oraz próbki w temperaturze 70 °C przez 10 min. Natychmiast schłodź na lodzie.
2. Oczyść elektrody instrumentu preparatem RNaseZAP przez 1 min, a następnie wodą wolną od RNaz przez 10 s. Pozostaw elektrody do wyschnięcia na powietrzu.
3. Przygotuj macierz żelową, pipetując 550 μl macierzy żelowej do filtra wirowego dołączonego do zestawu. Wirować przy 1,500 RCF przez 10 min w temperaturze pokojowej. Podziel przefiltrowany żel na aliquoty po 65 μl i przechowuj w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
4. Aby przygotować stację do przygotowania chipa,
   1. Wsuń strzykawkę 1-ml przez uchwyt do adaptera luer lock.
   2. Ustaw płytę podstawy w pozycji C, luzując śrubę pod podstawą, podnosząc płytę i ponownie dokręcając śrubę.
   3. Ustaw uchwyt strzykawki w górnej pozycji.
5. Dostosuj temperaturę koncentratu barwnika do temperatury pokojowej. Wymieszaj w wortexie przez 10 s. Dodaj 1 μl barwnika do 65 μl aliquotu przefiltrowanego żelu. Dobrze wymieszaj w wortexie i wiruj przy 13,000 RCF przez 10 min w temperaturze pokojowej. Zużyć w ciągu jednego dnia.
   Gdy będziesz gotowy do analizy próbek,
6. Umieść chip w stacji do przygotowania. W tym protokole używamy chipów RNA 6000 nano. Aby załadować żel,
   1. Pipetuj 9 μl mieszaniny żel-barwnik do dołka oznaczonego białą literą „G” na czarnym tle. Upewnij się, że końcówka znajduje się na samym dnie dołka.
   2. Ustaw tłok strzykawki na 1 ml. Zamknij stację do przygotowania. Upewnij się, że została zablokowana z kliknięciem.
   3. Powoli, ale jednostajnie naciśnij tłok w dół, aż zostanie zatrzymany przez uchwyt.
   4. Odczekaj 30 s. Zwolnij uchwyt.
   5. Pozwól tłokowi samoczynnie wrócić do góry. Po zatrzymaniu ruchu odczekaj kilka sekund i cofnij tłok do pozycji 1 ml. Otwórz stację do przygotowania.
7. Pipetuj 9 μl mieszaniny żel-barwnik do każdego z 2 dołków oznaczonych literą „G”.
8. Pipetuj 5 μl markera do każdego z 12 dołków na próbki oraz do dołka na marker wielkości.
9. Pipetuj 1 μl przygotowanego markera wielkości do dołka na marker wielkości.
10. Pipetuj 1 μl każdej próbki do dołków na próbki.
11. Pipetuj 1 μl markera do każdego nieużywanego dołka na próbki.
12. Mieszaj chip w wortexie przez 1 min przy 2,400 rpm.
13. Aby przeprowadzić analizę z chipem,
    1. Uruchom oprogramowanie 2100 Expert Software.
    2. Umieść chip w urządzeniu i zamknij pokrywę. Jeśli instrument jest w trybie online, ikona wskaże, czy pokrywa jest otwarta czy zamknięta oraz jaki typ chipa został włożony. Upewnij się, że wybrano odpowiedni port.
    3. Przeprowadź analizę w ciągu 5 min od załadowania próbek, aby zapobiec parowaniu.

2. Amplifikacja i znakowanie

W celu przygotowania do analizy mikromacierzy próbki RNA są amplifikowane i znakowane, zazwyczaj w reakcji opartej na polimerazie RNA T7³. Dwuniciowe cDNA jest generowane poprzez odwrotną transkrypcję. cDNA jest wykorzystywane w reakcji transkrypcji in vitro do wytworzenia tzw. cRNA. Reakcja ta przebiega w obecności znakowanych rybonukleotydów, co pozwala na otrzymanie mikrogramowych ilości znakowanego RNA do hybrydyzacji z macierzą. Wybór metod amplifikacji/znakowania zależy od platformy mikromacierzy, która zostanie użyta w kolejnym etapie. W tej sekcji opisujemy generowanie fluorescencyjnie znakowanego RNA przy użyciu zestawu do znakowania Agilent Quick Amp.

1. Do probówki o pojemności 1,5 ml pipetować od 50 ng do 5 μg RNA. Objętość nie powinna przekraczać 8,3 μl. W razie potrzeby próbkę RNA należy zagęścić za pomocą wirowania próżniowego lub wytrącania alkoholem.
2. Dodać 1,2 μl startera T7.
3. Uzupełnić objętość końcową do 11,5 μl wodą wolną od RNaz.
4. Inkubować w temperaturze 65°C przez 10 min w celu denaturacji RNA. Zaleca się stosowanie termocyklera z grzaną pokrywą, aby zapobiec kondensacji pary w górnej części probówki.
5. Podczas 10-minutowej inkubacji ogrzać 5X First Strand Buffer do temperatury 80°C przez 5 min. Wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia.
6. Po 10-minutowej inkubacji szybko schłodzić zdenaturowane próbki RNA na lodzie.
7. Przygotować master mix do syntezy cDNA. Na jedną reakcję dodać następujące składniki:
   1. 4 μl 5X First Strand Buffer
   2. 2 μl 0,1 M DTT
   3. 1 μl 10 mM dNTPs
   4. 1 μl enzymu MMLV-RT
   5. 0,5 μl RNase Out.
8. Wymieszać składniki, odwracając probówkę 4 razy. Nie używać wirówki typu vortex. Odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
9. Dodać 8,5 μl master mixu do każdej próbki. Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.
10. Inkubować przez 2 h w temperaturze 40°C, a następnie przez 10 min w temperaturze 65°C. Zaleca się stosowanie termocyklera z grzaną pokrywą.
11. Przenieść probówki na lód na 5 min.
12. Przygotować master mix do transkrypcji. Na jedną reakcję dodać następujące składniki:
    1. 15,3 μl wody wolnej od nukleaz
    2. 20 μl 4X transcription buffer
    3. 6 μl 0,1 M DTT
    4. 8 μl NTPs
    5. 6,4 μl 50% PEG (PEG należy uprzednio ogrzać do 40°C i wymieszać na wirówce typu vortex, aby zapewnić resuspensję)
    6. 0,5 μl RNase Out
    7. 0,6 μl nieorganicznej pirofosfatazy
    8. 0,8 μl polimerazy RNA T7
    9. 2,4 μl Cy3- lub Cy5 CTP
13. Krótko odwirować próbki, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
14. Dodać 60 μl Transcription Master Mix do każdej próbki.
15. Inkubować w temperaturze 40°C przez 2 h.
16. Dodać 20 μl wody wolnej od RNaz.
17. Oczyścić znakowane cRNA w celu usunięcia niewbudowanych nukleotydów. Zaleca się stosowanie kolumienek RNeasy mini firmy Qiagen.
18. Oznaczyć ilość znakowanego cRNA. Zaleca się stosowanie spektrofotometru NanoDrop2000 w trybie Microarray Measurement. Należy upewnić się, że jako typ próbki wybrano RNA-40.
19. Zanotować stężenie próbki, wydajność (obliczaną jako iloczyn stężenia i objętości) oraz aktywność właściwą (obliczaną jako iloczyn 1000 i stosunku stężenia barwnika do stężenia cRNA). Dla hybrydyzacji mikromacierzy konieczne jest uzyskanie wydajności co najmniej 825 ng oraz aktywności właściwej co najmniej 8 pmol/μg.

3. Hybrydyzacja mikromacierzy

1. Włącz stację do hybrydyzacji i ustaw temperaturę 65°C co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem hybrydyzacji.
2. Aby przygotować próbkę do hybrydyzacji, wymieszaj następujące składniki w probówce 1,5 ml:
   1. 825 ng Cy3-cRNA (zazwyczaj jest to próbka „traktowana”)
   2. 825 ng Cy5-cRNA (zazwyczaj jest to próbka „referencyjna”)
   3. 11 μl 10X czynnika blokującego.
   4. Dodaj wodę wolną od RNaz do uzyskania objętości końcowej 52,8 μl
   5. Dodaj 2,2 μl buforu do fragmentacji.
3. Wymieszaj w wirówce typu vortex przy niskich obrotach.
4. Inkubuj w temperaturze 60°C przez dokładnie 30 min. Jest to etap fragmentacji cRNA, który generuje znakowane fragmenty do hybrydyzacji na macierzy. Bardzo ważne jest zachowanie dokładnego czasu inkubacji zgodnie z opisem. Zaleca się stosowanie termocyklera z grzaną pokrywą. Precyzyjna inkubacja jest kluczowa dla uzyskania sond o prawidłowej średniej długości. Nadmierna lub niewystarczająca fragmentacja doprowadzi do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich.
5. Dodaj 55 μl 2X buforu do hybrydyzacji, aby zatrzymać fragmentację. Wymieszaj poprzez pipetowanie, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
6. Wiruj przez 1 min przy maksymalnej prędkości, aby zebrać zawartość na dnie probówki. Jeśli zauważysz pęcherzyki powietrza, wydłuż czas wirowania w celu ich usunięcia.
7. Umieść probówkę na lodzie, chroniąc ją przed światłem. Nanieś próbkę na macierz tak szybko, jak to możliwe.
8. Aby nanieść próbkę na macierz, przygotuj najpierw komorę hybrydyzacyjną. Niniejszy protokół opisuje użycie macierzy Agilent 4x44K z systemem hybrydyzacyjnym Roche-Nimblegen i komorami mieszającymi A4.
   1. Umieść szkiełko z mikromacierzą w narzędziu do montażu/demontażu, zaczynając od strony z kodem kreskowym.
   2. Otwórz mieszalnik A4 i odsłoń warstwę klejącą. Trzymając macierz i narzędzie do montażu/demontażu w sposób zapobiegający przesunięciom, nałóż mieszalnik A4 na szkiełko, zaczynając od dalnego końca. Upewnij się, że jest on prawidłowo wyrównany względem narzędzia. Przyklej mieszalnik wzdłuż całego szkiełka z macierzą.
   3. Pociągnij za koniec mieszalnika, aby wyjąć zespół szkiełko/mieszalnik.
   4. Za pomocą narzędzia do dociskania dociśnij całą długość uszczelki klejącej, aby upewnić się, że jest ona szczelnie przyklejona do szkiełka. Małe pęcherzyki powietrza uwięzione między klejem a szkiełkiem są widoczne na ciemnym tle. Poświęć dodatkowy czas na ich usunięcie za pomocą narzędzia do dociskania. Macierz jest teraz gotowa do naniesienia próbki.
9. Używając pipety z tłokiem wypierającym, nanieś 100 μl próbki do hybrydyzacji. Wciśnij końcówkę ściśle do otworu wlotowego, a następnie dozuj powoli i płynnie, aby powietrze nie zostało uwięzione w obszarze macierzy. Nigdy nie próbuj zasysać próbki z powrotem. Po dozowaniu całej próbki pozostaw końcówkę w otworze wlotowym, nie zwalniając tłoka. Gdy próbka pokryje całą macierz, a ciecz zacznie wypływać przez otwór odpowietrzający, szybko wyjmij pipetę. Zwolnij tłok dopiero po odsunięciu końcówki od szkiełka.
10. Delikatnie odsącz nadmiar cieczy z obu portów. Upewnij się, że nie wyciągasz próbki z wnętrza komory.
11. Zaklej otwory portów naklejkami za pomocą pęsety.
12. Umieść szkiełko na stacji do hybrydyzacji i sprawdź, czy otwory pęcherzyka są prawidłowo ustawione nad o-ringami. Zapewni to właściwe mieszanie podczas hybrydyzacji.
13. Zamknij osłonę szkiełka oraz pokrywę stacji. Ustaw stację w trybie mieszania B.
14. Przeprowadź hybrydyzację macierzy w temperaturze 65°C przez 17 godzin.
15. Przygotuj Bufor Płuczący 2, dodając Triton X-102 do stężenia końcowego 0,005%. Przechowuj w temperaturze 37°C przez noc.

4. Przemywanie mikromacierzy

1. Dodaj Triton X-102 do Buforu do przemywania 1 do stężenia końcowego 0.005%. Przechowuj w temperaturze pokojowej.
2. Po zakończeniu hybrydyzacji napełnij szklany pojemnik „A” Buforem do przemywania 1. Pojemnik powinien być wystarczająco duży, aby pomieścić narzędzie do montażu/demontażu i umożliwić swobodne manewrowanie. Wszystkie etapy przemywania należy przeprowadzać w szkle. Należy unikać pojemników plastikowych, ponieważ mają one tendencję do wymywania związków, co skutkuje wysokim tłem w matrycy.
3. Umieść statyw na szkiełka i mieszadło magnetyczne w kuwecie do barwienia „B”. Napełnij ją Buforem do przemywania 1, upewniając się, że statyw jest całkowicie zakryty. Postaw na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej.
4. Umieść mieszadło magnetyczne w pustej kuwecie do barwienia „C” i postaw na mieszadle magnetycznym.
5. Wyjmij matrycę i umieść ją w narzędziu do montażu/demontażu. Zanurz cały zespół w pojemniku „A”.
6. Trzymając jedną ręką narzędzie do montażu/demontażu oraz szkiełko po przeciwnych stronach, ostrożnie odklej mikser A4. Upewnij się, że nie porysowałeś obszaru matrycy.
7. Szybko umieść szkiełko w statywie w kuwecie do barwienia „B”. Od tego momentu należy zminimalizować ekspozycję na powietrze, ponieważ barwnik Cy5 jest wrażliwy na ozon. Nie przemywaj więcej niż 8 matryc jednocześnie.
8. Przemywaj przez 1 minutę, mieszając z umiarkowaną prędkością.
9. Napełnij kuwetę do barwienia „C” uprzednio ogrzanym Buforem do przemywania 2. Przenieś szkiełka i przemywaj przez 1 minutę.
10. Bardzo powoli wyjmij statyw ze szkiełkami z kuwety do barwienia „C”, aby zminimalizować ilość kropel pozostających na szkiełku.
11. Osusz szkiełko poprzez wirowanie przez 2 minuty. Jeśli odpowiednia wirówka nie jest dostępna, odwiruj szkiełko w stożkowej probówce 50 ml lub przedmuchaj je gazem argonowym.
12. Umieść szkiełka w stożkowej probówce 50 ml i napełnij ją argonem. Przystąp do skanowania natychmiast, aby uniknąć utraty sygnału. Zalecamy użycie skanera GenePix 4000B firmy Molecular Devices.

5. Reprezentatywne wyniki:

Próbki całkowitego RNA dobrej jakości powinny wykazać jedynie dwa główne piki podczas analizy w Bioanalyzerze w celu kontroli jakości, odpowiadające dwóm głównym gatunkom RNA rybosomalnego. Pewna degradacja RNA objawi się jako rozmycie przed pierwszym pikiem RNA rybosomalnego. Silnie zdegradowane RNA niskiej jakości wykaże szeroki pik lub serię pików przy niskich czasach retencji, podczas gdy dwa piki RNA rybosomalnego będą miały bardzo niską intensywność lub nie będą w ogóle identyfikowalne. Przykłady wyników z Bioanalyzer 2100 przedstawiono na rysunku 1.

Oprogramowanie Expert 2100 obliczy wskaźnik integralności RNA, czyli RIN, jako ilościowy pomiar jakości RNA. Próbki wysokiej jakości, z wartościami RIN wyższymi niż 9, są oczywiście najlepsze do zastosowań w mikromacierzach. Jednakże, do generowania danych z mikromacierzy o zadowalającej jakości wykorzystywaliśmy próbki z wartościami RIN tak niskimi jak 5,2.

Zespoły macierzy wysokiej jakości powinny generować silny sygnał przy stosunkowo niskich wartościach PMT. W naszym doświadczeniu oczekuje się, że większość transkryptów będzie występować na podobnych poziomach w próbce eksperymentalnej i referencyjnej; masywne, rozległe zmiany w ekspresji genów prawdopodobnie byłyby pozbawione znaczenia biologicznego. W związku z tym większość macierzy powinna mieć kolor żółty, a nie zielony lub czerwony. Sygnały wysokiej jakości powinny znajdować się również w zakresie dynamicznym takim, aby histogramy sygnałów w pełni się pokrywały. Przykłady przedstawiono na rysunku 2.

Rysunek 1. Przykład czterech próbek RNA wyizolowanych z tkanki guza mózgu człowieka. RNA wyizolowano zgodnie z protokołem przedstawionym w 3.1.1. Jakość próbek oceniono za pomocą Bioanalyzer 2100 na chipie RNA 6000, zgodnie z opisem w 3.1.3. Próbki są reprezentatywne dla 4 różnych poziomów jakości RNA: A, bardzo dobra jakość RNA (RIN>9); B, częściowo zdegradowane RNA (RIN 5-6, zwróć uwagę na znacznie niższy pik dla 28S rRNA); C, silnie zdegradowane RNA (RIN<3); D, prawie całkowicie zdegradowane RNA (RIN=2). Z sukcesem wykorzystaliśmy próbki o jakości podobnej lub lepszej niż B (RIN>5,2) w dalszych zastosowaniach z wykorzystaniem mikromacierzy. Pełne i puste groty strzałek wskazują odpowiednio pozycje frakcji 18S i 28S rRNA.

Rycina 2. Przykłady obrazów macierzy i wykresów rozrzutu. A, podgląd całego slajdu, pokazujący cztery macierze w formacie 4X44K Agilent; B, skan o wysokiej rozdzielczości jednego z obszarów macierzy, należy zauważyć, że żaden z sygnałów (czerwony lub zielony) nie dominuje; C, wykres rozrzutu obrazu z B, należy zauważyć, że sygnały w pełni się pokrywają i nie więcej niż 1x10^-6 cech znajduje się na poziomie intensywności nasycenia.

Dyskusja

Profilowanie ekspresji z wykorzystaniem mikromacierzy DNA stanowi bezpośrednie podejście do identyfikacji genów o różnym poziomie ekspresji pomiędzy dwiema próbkami biologicznymi. Pomyślne eksperymenty z profilowania ekspresji wymagają wysokiej jakości próbek RNA, skutecznego znakowania oraz hybrydyzacji. W naszym doświadczeniu komercyjne macierze i zestawy do znakowania firmy Agilent dostarczają wysokiej jakości dane przy rozsądnym koszcie. Choć Agilent oferuje również własne urządzenia do hybrydyzacji i skanowania, preferujemy system hybrydyzacji firmy Roche-Nimblegen oraz skaner mikromacierzy GenePix 4000B firmy Molecular Devices. Należy zauważyć, że jednostka hybrydyzacyjna Roche-Nimblegen była wcześniej znana jako system hybrydyzacji MAUI. Po niedawnym przejęciu korporacyjnym przez Roche, mieszalniki A4 zostały wycofane z produkcji. W momencie pisania tego tekstu można je nadal znaleźć u innych sprzedawców, takich jak Kreatech Diagnostics (www.kreatech.com; ta strona oferuje również wygodne narzędzie do sprawdzania kompatybilności macierzy), jednak długoterminowa dostępność zapasów jest niepewna. Dostępne są inne systemy hybrydyzacji (na przykład od firmy Agilent); niemniej jednak, jeśli uda się znaleźć kompatybilne mieszalniki dla używanej macierzy, rekomendujemy system Roche-Nimblegen ze względu na jego jakość i powtarzalność.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	G2943CA	Obejmuje stację przygotowawczą do chipów, wortexer, oprogramowanie i komputer przenośny
Zestaw do elektroforezy Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	G2947CA
Zestaw RNA 6000 Nano	Agilent Technologies	5067-1511	obejmuje drabinę wielkości, marker, macierz żelową, barwnik, środki do czyszczenia elektrod, filtry wirówkowe i nanochipy
RNase Zap	Applied Biosystems	AM9780M
Zestaw do znakowania Quick Amp, dwukolorowy	Agilent Technologies	5190-0444
Zestaw RNeasy mini	Qiagen	74104
Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genów	Agilent Technologies	5188-542	Obejmuje środek blokujący, bufor do fragmentacji i bufor do hybrydyzacji
Zestaw buforów do przemywania ekspresji genów	Agilent Technologies	5188-5327	Obejmuje bufory do przemywania 1 i 2 oraz Triton X-102
Stacja hybrydyzacyjna	Roche Group	05223652001	Model na 4 slajdy
Zestaw akcesoriów do systemu hybrydyzacyjnego	Roche Group	05327695001	Zawiera zespół weryfikacyjny do testowania mieszania, zapasowe pierścienie O-ring, narzędzie do demontażu, pęsetę i wałek
Komory hybrydyzacyjne z mieszadłem A4
Oligo Microarray całego ludzkiego genomu (4x44)	Agilent Technologies	G4112F
Pipeta o wyporze dodatnim	Gilson, Inc.	F148504
Tłoki kapilarne do pipety o wyporze dodatnim	Gilson, Inc.	F148415
Suszarka do mikromacierzy	Nimblegen	05223636001
Fluorescencyjny skaner mikromacierzy, Axon GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX4000B
Oprogramowanie GenePix Pro 6.0	Molecular Devices