Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Summary

Pokazujemy użycie mikromacierzy DNA do profilowania ekspresji układu nerwowego. Opisujemy kontrolę jakości RNA, etykietowanie próbek oraz hybrydyzację i skanowanie macierzy.

Abstract

Profilowanie ekspresji mikromacierzy w układzie nerwowym dostarcza potężnego podejścia do identyfikacji aktywności genów w różnych stadiach rozwoju, różnych stanach fizjologicznych lub patologicznych, odpowiedzi na terapię i, ogólnie, każdego stanu, który jest testowany eksperymentalnie¹. Profilowanie ekspresji tkanek nerwowych wymaga izolacji wysokiej jakości RNA, amplifikacji wyizolowanego RNA i hybrydyzacji do mikromacierzy DNA. W tym artykule opisujemy protokoły odtwarzalnych eksperymentów z mikromacierzami z tkanki guza mózgu². Zaczniemy od przeprowadzenia analizy kontroli jakości izolowanych próbek RNA za pomocą technologii "lab-on-a-chip" Bioanalyzer 2100 firmy Agilent. Wysokiej jakości próbki RNA mają kluczowe znaczenie dla powodzenia każdego eksperymentu z mikromacierzami, a bioanalizator 2100 zapewnia szybki, ilościowy pomiar jakości próbki. Próbki RNA są następnie amplifikowane i znakowane poprzez wykonanie odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania cDNA, a następnie transkrypcji in vitro w obecności znakowanych nukleotydów w celu wytworzenia znakowanego cRNA. Używając dwukolorowego zestawu do etykietowania, oznaczymy naszą próbkę eksperymentalną Cy3, a próbkę referencyjną Cy5. Obie próbki zostaną następnie połączone i zhybrydyzowane z matrycami 4x44 K firmy Agilent. Dwukolorowe matryce mają tę zaletę, że można je bezpośrednio porównać między dwiema próbkami RNA, zwiększając w ten sposób dokładność pomiarów, w szczególności w przypadku niewielkich zmian w poziomach ekspresji, ponieważ dwie próbki RNA są hybrydyzowane konkurencyjnie do jednej mikromacierzy. Tablice będą skanowane na dwóch odpowiadających sobie długościach fal, a stosunek sygnału Cy3 do Cy5 dla każdej cechy zostanie wykorzystany jako bezpośredni pomiar względnej obfitości odpowiedniego mRNA. Analiza ta identyfikuje geny, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w odpowiedzi na badane warunki eksperymentalne.

Protocol

1. Analiza kontroli jakości próbki RNA za pomocą Bioanalyzera 2100

Zanim zaczniesz,

1. Denaturację drabiny i próbek w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Natychmiast schłodzić na lodzie.
2. Wyczyść elektrody instrumentu za pomocą RNaseZAP przez 1 minutę, a następnie wodą wolną od RNaz przez 10 sekund. Pozostaw elektrody do wyschnięcia na powietrzu.
3. Przygotować matrycę żelową, pipetując 550 μl matrycy żelowej do filtra wirowego dostarczonego z zestawem. Wirować przy 1,500 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przefiltrowany żel podzielić na 65 μl porcji i przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do 1 miesiąca.
4. Aby przygotować stację zasysania wiórów,
   1. Włożyć strzykawkę o pojemności 1 ml przez klips do adaptera luer lock.
   2. Ustaw płytę podstawy w pozycji C, poluzowując pod podstawą, podnosząc płytę i ponownie dokręcając.
   3. Ustawić klips strzykawki w górnym położeniu.
5. Zrównoważyć koncentrat barwnika do temperatury pokojowej. Wirować przez 10 sekund. Dodać 1 μl barwnika do 65 μl podwielokrotności przefiltrowanego żelu. Dobrze wirować i odwirowywać przy 13 000 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zużyć w ciągu jednego dnia.
   Gdy będziesz gotowy do uruchomienia próbek,
6. Umieść chip na stacji zasysającej. W tym protokole używamy nano chipów RNA 6000. Aby załadować żel,
   1. Odpipetować 9 μl mieszanki żelu i barwnika w studzience oznaczonej białą literą "G" na czarnym tle. Upewnij się, że końcówka znajduje się na samym dnie studni.
   2. Ustawić tłok strzykawki na poziomie 1 ml. Zamknąć stację zasysającą. Upewnij się, że blokuje się na klik.
   3. Wciskać tłok powoli, ale systematycznie, aż zostanie przytrzymany przez zacisk.
   4. Odczekaj 30 sekund. Zwolnij klips.
   5. Niech tłok sam się podniesie. Po zatrzymaniu ruchu należy odczekać kilka sekund i odciągnąć tłok z powrotem do pozycji 1 ml. Otwórz stację zasysającą.
7. Odpipetować 9 μl mieszanki żelu i barwnika do każdej z 2 studzienek oznaczonych "G".
8. Odpipetować 5 μl markera w każdym z 12 dołków na próbki oraz w studzience drabinkowej.
9. Odpipetować 1 μl przygotowanej drabiny w studzience drabinowej.
10. Odpipetować 1 μl każdej próbki do dołków na próbki.
11. Odpipetować 1 μl markera do każdej niewykorzystanej studzienki na próbkę.
12. Wiruj wiór przez 1 minutę przy 2,400 obr./min.
13. Aby uruchomić chip,
    1. Uruchom oprogramowanie 2100 Expert.
    2. Ustaw chip i zamknij pokrywę. Jeśli przyrząd jest podłączony do Internetu, ikona pokaże, czy pokrywa jest otwarta, czy zamknięta i jaki rodzaj chipa jest włożony. Upewnij się, że wybrano właściwy port.
    3. Przeprowadzić test w ciągu 5 minut od załadowania próbek, aby zapobiec parowaniu.

2. Wzmocnienie i etykietowanie

Aby przygotować się do analizy mikromacierzy, próbki RNA są amplifikowane i znakowane, zwykle w reakcji opartej na polimerazie T7 RNA³. Dwuniciowe cDNA jest generowane przez odwrotną transkrypcję. cDNA jest wykorzystywane w reakcji transkrypcji in vitro do generowania tak zwanego cRNA. Reakcja ta przeprowadza się w obecności znakowanych rybonukleotydów, wytwarzając mikrogramowe ilości znakowanego RNA do hybrydyzacji macierzy. Wybór metod amplifikacji/etykietowania zależy od kolejnej platformy mikromacierzy, która ma być użyta. W tej sekcji opisujemy wytwarzanie znakowanego fluorescencyjnie RNA przy użyciu zestawu do znakowania Quick Amp firmy Agilent.

1. Odpipetować od 50 ng do 5 μg RNA w probówce o pojemności 1,5 ml. Objętość nie powinna przekraczać 8,3 μl. W razie potrzeby zagęścić próbkę RNA przez odwirowanie próżniowe lub wytrącanie alkoholem.
2. Dodać 1,2 μl startera T7.
3. Doprowadzić do końcowej objętości 11,5 μl wodą wolną od RNaz.
4. Inkubować w temperaturze 65°C przez 10 minut w celu denaturacji RNA. Zalecamy używanie termocyklera z gorącą pokrywką, aby zapobiec kondensacji pary wodnej w górnej części rurki.
5. Podczas 10-minutowej inkubacji ogrzej 5X First Nit Buffer do 80°C przez 5 minut. Wiruj i odwiruj. Przechowywać w temperaturze RT do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
6. Po 10 minutowej inkubacji szybko schłodzić zdenaturowane próbki RNA na lodzie.
7. Przygotuj główną mieszankę cDNA. Dla każdej reakcji dodaj następujące elementy:
   1. 4 μl 5X bufor pierwszej żyły
   2. 2 μl 0,1 m naziemnej telewizji cyfrowej
   3. 1 μl 10 mM dNTP
   4. 1 μl enzymu MMLV-RT
   5. 0,5 μl RNazy Out.
8. Wymieszaj składniki, odwracając rurkę 4 razy. Nie wirować. Zakręć w dół, aby zebrać zawartość na dnie tuby.
9. Dodać 8,5 μl mieszanki wzorcowej na próbkę. Mieszać, piperując w górę iw dół.
10. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 40°C, a następnie przez 10 minut w temperaturze 65°C. Zalecamy używanie termocyklera z podgrzewaną pokrywą.
11. Przenieś probówki do lodu na 5 minut.
12. Przygotuj główny miks transkrypcji. Dla każdej reakcji dodaj następujące elementy:
    1. 15,3 μl wody wolnej od nukleaz
    2. 20 μl 4-krotny bufor transkrypcyjny
    3. 6 μl 0,1 m naziemnej telewizji cyfrowej
    4. 8 μl NTP
    5. 6,4 μl 50% PEG (PEG powinien być wstępnie podgrzany do 40°C i zwirowany, aby zapewnić ponowne zawieszenie)
    6. 0,5 μl RNazy Out
    7. 0,6 μl pirofosfatazy nieorganicznej
    8. 0,8 μl polimerazy RNA T7
    9. 2,4 μl CTP Cy3 lub Cy5
13. Krótko obrócić próbki, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
14. Dodać 60 μl Transcription Master Mix na próbkę.
15. Inkubować w temperaturze 40°C przez 2 godziny.
16. Dodać 20 μl wody wolnej od RNaz.
17. Oczyść znakowane cRNA, aby usunąć nieinkorporowane nukleotydy. Zalecamy korzystanie z mini kolumn RNeasy firmy Qiagen.
18. Określ ilościowo znakowane cRNA. Zalecamy używanie spektrofotometru NanoDrop2000 w trybie pomiaru mikromacierzy. Upewnij się, że jako typ próbki wybrano RNA-40.
19. Zapisać stężenie próbki, wydajność (obliczoną jako stężenie pomnożone przez objętość) i aktywność właściwą (obliczoną jako 1000 pomnożoną przez stosunek stężenia barwnika do stężenia cRNA). Do hybrydyzacji mikromacierzy konieczne jest osiągnięcie wydajności co najmniej 825 ng i aktywności właściwej co najmniej 8 pmol/μg.

3. Hybrydyzacja mikromacierzy

1. Włącz stację hybrydyzacyjną i ustaw na 65°C co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem hybrydyzacji.
2. Aby przygotować próbkę hybrydyzacji, wymieszaj następujące składniki w probówce o pojemności 1,5 ml:
   1. 825 ng Cy3-cRNA (zwykle jest to próbka "poddana obróbce")
   2. 825 ng Cy5-cRNA (zwykle jest to próbka "referencyjna")
   3. 11 μl 10X Środek blokujący.
   4. Dodać wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 52,8 μl
   5. Dodać 2,2 μl buforu fragmentacyjnego.
3. Wiruj z małą prędkością, aby wymieszać.
4. Inkubować w temperaturze 60°C dokładnie przez 30 minut. Jest to etap fragmentacji cRNA, który generuje znakowane fragmenty do hybrydyzacji macierzy. Bardzo ważne jest, aby inkubować dokładnie tak, jak opisano. Zalecamy stosowanie termocyklera z podgrzewaną pokrywą. Bardzo ważne jest, aby inkubować dokładnie tak, jak opisano, aby wygenerować sondy o odpowiedniej średniej długości. Nadmierna lub niewystarczająca fragmentacja spowoduje wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
5. Dodaj 55 μl buforu hybrydyzacyjnego 2X, aby zatrzymać fragmentację. Mieszać pipetując, zwracając szczególną uwagę, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
6. Wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością, aby zebrać zawartość na dnie probówki. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki, wiruj dłużej, aby je usunąć.
7. Umieść rurkę na lodzie, chroniąc przed światłem. Załaduj próbkę do macierzy tak szybko, jak to możliwe.
8. Aby załadować tablicę, najpierw przygotuj komorę hybrydyzacyjną. Protokół ten opisuje zastosowanie macierzy 4x44K firmy Agilent z systemem hybrydyzacji Roche-Nimblegen i komorami mieszalnika A4.
   1. Umieść szkiełko z mikromacierzą w narzędziu do montażu/demontażu, stroną z kodem kreskowym do przodu.
   2. Otwórz mikser A4 i odsłoń klej. Trzymając tablicę i narzędzie do montażu/demontażu, aby zapobiec wszelkim ruchom, umieść mikser A4 na suwaku, zaczynając od drugiego końca. Upewnij się, że jest prawidłowo wyrównany z narzędziem. Przyklej mikser wzdłuż suwaka matrycy.
   3. Pociągnij za koniec miksera, aby zdjąć zespół suwaka/miksera.
   4. Za pomocą narzędzia do rykoszowania dociśnij uszczelkę samoprzylepną wzdłuż całej długości, aby upewnić się, że jest mocno przyklejona do prowadnicy. Na ciemnym tle widać małe pęcherzyki powietrza uwięzione między klejem a szkiełkiem. Poświęć więcej czasu na usunięcie tych bąbelków za pomocą narzędzia do ryczenia. Twoja tablica jest teraz gotowa do załadowania.
9. Za pomocą pipety wyporowej załadować 100 μl próbki do hybrydyzacji. Wciśnij mocno końcówkę do otworu portu; Następnie dozuj powoli i płynnie, aby powietrze nie zostało uwięzione w obszarze matrycy. Nigdy nie próbuj zasysać próbki z powrotem. Po dozowaniu całej próbki należy przytrzymać końcówkę na otworze portu, nie zwalniając tłoka. Gdy próbka pokryje całą matrycę, a ciecz zacznie wydostawać się z otworu wentylacyjnego, szybko wyjmij pipetę. Zwolnić tłok tylko wtedy, gdy końcówka znajduje się z dala od suwaka.
10. Delikatnie wklep nadmiar płynu w oba porty. Upewnij się, że nie pobierasz próbki z samej komory.
11. Zakryj otwory portów naklejkami za pomocą pęsety.
12. Umieść szkiełko na stacji hybrydyzacji i sprawdź, czy otwory pęcherza są prawidłowo umieszczone nad O-ringami. Zapewni to prawidłowe mieszanie podczas hybrydyzacji.
13. Zamknij przesuwaną pokrywę i pokrywę stacji. Ustaw stację w trybie mieszania B.
14. Hybrydyzuj matrycę w temperaturze 65°C przez 17 godzin.
15. Przygotuj bufor płuczący 2, dodając Triton X-102 do końcowego stężenia 0,005%. Przechowywać w temperaturze 37°C przez noc.

4. Mycie mikromacierzy

1. Dodaj Triton X-102 do buforu płuczącego 1 do końcowego stężenia 0,005%. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Po zakończeniu hybrydyzacji napełnij szklane naczynie "A" buforem do mycia 1. Miska powinna być wystarczająco duża, aby pomieścić narzędzie do montażu/demontażu i umożliwić pewne manewrowanie. Wszystkie prania należy wykonywać w naczyniach szklanych. Unikaj plastikowych naczyń, ponieważ mają one tendencję do wypłukiwania związków, co powoduje wysokie tło w tablicy.
3. Umieść stojak na szkiełka i mieszadło w naczyniu barwiącym "B". Napełnij buforem do mycia 1, upewniając się, że zakrywa ruszt. Umieść na talerzu mieszającym w temperaturze pokojowej.
4. Umieść mieszadło na pustym naczyniu barwiącym "C" i umieść na talerzu do mieszania.
5. Wyjmij tablicę i umieść ją w narzędziu do montażu/demontażu. Zanurz cały zespół w naczyniu "A".
6. Trzymając jedną ręką narzędzie do montażu/demontażu i prowadnicę z przeciwnych stron, ostrożnie zdejmij mikser A4. Upewnij się, że nie porysujesz obszaru tablicy.
7. Szybko umieść szkiełko w stojaku w naczyniu do barwienia "B". Od teraz narażenie na powietrze powinno być zminimalizowane, ponieważ barwnik Cy5 jest wrażliwy na ozon. Nie myj więcej niż 8 tablic na raz.
8. Myć przez 1 minutę mieszając na średnich obrotach.
9. Napełnij naczynie barwiące "C" wstępnie podgrzanym buforem do mycia 2. Przenieś szkiełka i myj przez 1 minutę.
10. Bardzo powoli wyjmij ruszt na szkiełko z naczynia do barwienia "C", aby zminimalizować kropelki pozostawione na szkiełku.
11. Wysuszyć szkiełko, wirując przez 2 minuty. Jeśli kompatybilna wirówka nie jest dostępna, odwiruj szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 ml lub przedmuchaj je argonem.
12. Umieść szkiełka w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i napełnij ją argonem. Skanuj natychmiast, aby uniknąć utraty sygnału. Zalecamy korzystanie ze skanera GenePix 4000B firmy Molecular Devices.

5. Reprezentatywne wyniki:

Dobrej jakości próbki RNA powinny wytworzyć tylko dwa główne piki po uruchomieniu w bioanalizatorze do kontroli jakości, odpowiadające dwóm głównym gatunkom rybosomalnego RNA. Pewna degradacja RNA objawi się jako rozmaz przed pierwszym pikiem rybosomalnego RNA. Poważnie zdegradowany, niskiej jakości RNA będzie wykazywał szeroki pik lub serię pików przy niskich czasach retencji, podczas gdy 2 piki rybosomalnego RNA będą miały bardzo niską intensywność lub w ogóle nie będą możliwe do zidentyfikowania. Przykłady danych wyjściowych bioanalizatora 2100 przedstawiono na rysunku 1.

Oprogramowanie Expert 2100 obliczy liczbę integralności RNA, czyli RIN, jako ilościową miarę jakości RNA. Próbki wysokiej jakości, z wartościami RIN wyższymi niż 9, są oczywiście najlepsze do zastosowań mikromacierzowych. Użyliśmy jednak próbek o wartościach RIN tak niskich, jak 5,2, do generowania danych z mikromacierzy o rozsądnej jakości.

Dobrej jakości tablice powinny generować wysoki sygnał przy stosunkowo niskich wartościach PMT. W naszym eksperymencie oczekuje się, że większość transkryptów będzie obecna na podobnych poziomach w próbie eksperymentalnej i referencyjnej; Masowe, powszechne zmiany w ekspresji genów prawdopodobnie nie będą miały żadnego znaczenia biologicznego. W związku z tym większość tablicy powinna wyglądać na żółtą, a nie zieloną lub czerwoną. Sygnały dobrej jakości powinny również znajdować się w zakresie dynamicznym, tak aby histogramy sygnałów w pełni się na siebie nakładały. Przykłady można znaleźć na rysunku 2.

Rysunek 1. Przykład czterech próbek RNA wyizolowanych z ludzkiej tkanki guza mózgu. RNA wyizolowano przy użyciu protokołu przedstawionego w 3.1.1. Jakość próbki oceniano za pomocą bioanalizatora 2100 na chipie RNA 6000, jak opisano w 3.1.3. Próbki są reprezentatywne dla 4 różnych jakości RNA: A, bardzo dobra jakość RNA (RIN>9); B, częściowo zdegradowany RNA (RIN 5-6, zwróć uwagę na znacznie niższy pik dla 28S rRNA); C, silnie zdegradowany RNA (RIN<3); D, prawie całkowicie zdegradowany RNA (RIN=2). Z powodzeniem wykorzystaliśmy próbki o jakości podobnej lub lepszej niż B (RIN>5.2) do dalszych zastosowań mikromacierzy. Solidne i otwarte groty strzałek wskazują odpowiednio położenie gatunków rRNA 18S i 28S.

Rysunek 2. Przykłady obrazów tablicowych i wykresów punktowych. A, podgląd całego slajdu, pokazujący cztery tablice w formacie 4X44K Agilent; B, skanowanie w wysokiej rozdzielczości jednego z obszarów tablicy, zauważ, że żaden z sygnałów (czerwony lub zielony) nie jest dominujący; C, wykres punktowy obrazu w B, zwróć uwagę, że sygnały całkowicie się nakładają i nie więcej niż ^1x10-6 obiektów ma intensywność nasycenia.

Discussion

Profilowanie ekspresji za pomocą mikromacierzy DNA zapewnia proste podejście do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między dwiema próbkami biologicznymi. Udane eksperymenty z profilowaniem ekspresji wymagają wysokiej jakości próbek RNA, solidnego znakowania i hybrydyzacji. Z naszego doświadczenia wynika, że komercyjne tablice i zestawy do etykietowania firmy Agilent zapewniają wysoką jakość danych za rozsądną cenę. Podczas gdy Agilent oferuje również własne maszyny do hybrydyzacji i skanowania, faworyzujemy system hybrydyzacji firmy Roche-Nimblegen i skaner mikromacierzy GenePix 4000B firmy Molecular Devices. Należy zauważyć, że jednostka hybrydyzacji Roche-Nimblegen była wcześniej znana jako system hybrydyzacji MAUI. Po niedawnym przejęciu firmy Roche, miksery A4 zostały wycofane z produkcji. W chwili pisania tego tekstu nadal można je znaleźć u innych sprzedawców, takich jak Kreatech Diagnostics (www.kreatech.com; ta strona internetowa oferuje również wygodne narzędzie do kompatybilności tablic), ale długoterminowa dostępność zapasów jest niepewna. Dostępne są inne systemy hybrydyzacji (na przykład firmy Agilent); Jeśli jednak można znaleźć kompatybilne miksery dla używanej macierzy, zalecamy system Roche-Nimblegen ze względu na jego jakość i powtarzalność.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2943CA	Zawiera stację do zasysania chipów, wirownik, oprogramowanie i laptopa
Zestaw do elektroforezy 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2947CA
RNA 6000 Nano	Agilent Technologies	5067-1511	zawiera drabinkę rozmiaru, marker, matrycę żelową, barwnik, środki do czyszczenia elektrod, filtry spinowe i nanochipy
RNase Zap	Applied Biosystems	AM9780M
Zestaw do etykietowania Quick Amp, dwukolorowy	Agilent Technologies	5190-0444
RNeasy mini zestaw	Qiagen	74104
Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genów	Agilent Technologies	5188-542	Zawiera środek blokujący, bufor fragmentacyjny i bufor hybrydyzacyjny
Zestaw do płukania ekspresji genów	Agilent Technologie	5188-5327	Zawiera myjące 1 i 2 oraz
stację hybrydyzacyjną	Grupa Roche 05223652001		model 4-suwakowy
Zestaw akcesoriów do systemu hybrydyzacji	Roche Group	05327695001	Zawiera zestaw weryfikacyjny do testowania mieszania, wymienne O-ringi, narzędzie do demontażu, kleszcze i
komory
Cały ludzki genom (4x44) Oligo Microarray	Agilent Technologies	G4112F
Pipeta wyporowa	Gilson, Inc.
Tłoki kapilarne do pipet wyporowych	Gilson, Inc.
Suszarka mikromacierzowa	Nimblegen	05223636001
Skaner fluorescencyjny Microray, Axon GenePix 4000B	Urządzenia molekularne	GENEPIX4000B
Oprogramowanie GenePix Pro 6.0	Urządzenia molekularne