Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Podsumowanie

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Streszczenie

Węzły chłonne (LN), rozmieszczone w całym organizmie, stanowią integralny element układu odpornościowego. Służą one jako miejsce indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, a tym samym rozwoju komórek efektorowych. W związku z tym węzły chłonne są kluczowe w walce z naciekającymi patogenami i utrzymaniu stanu zdrowia. Wybór węzła chłonnego do badania zależy od dostępności oraz pożądanego modelu; węzeł chłonny pachwinowy jest dobrze położony i ułatwia prowadzenie badań nad biologicznie istotnymi modelami infekcji skóry oraz błon śluzowych narządów płciowych¹.

Węzeł chłonny (LN) pachwinowy, podobnie jak wszystkie LN, posiada rozbudowaną sieć mikronaczyniową dostarczającą krew. Generalnie sieć mikronaczyniowa ta obejmuje główną tętniczkę doprowadzającą do LN, która następnie rozgałęzia się i zasila wysokomiąższowe żyłki (HEV). HEV są wyspecjalizowane w ułatwianiu migracji komórek odpornościowych do LN zarówno podczas homeostazy, jak i infekcji. Mechanizmy, za pomocą których HEV regulują migrację do LN w obu tych sytuacjach, są przedmiotem intensywnych badań. Tętniczka doprowadzająca do LN wywiera bezpośredni wpływ powyżej HEV i stanowi główne źródło składników odżywczych oraz krwi bogatej w komórki dostarczanych do LN. Co więcej, zmiany w tętniczce doprowadzającej są zaangażowane w ułatwianie indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej¹. Mikronaczyniowe układy LN mają oczywiste znaczenie w utrzymywaniu optymalnego ukrwienia LN i regulowaniu napływu komórek odpornościowych do LN, co stanowi kluczowe elementy prawidłowego funkcjonowania LN i w konsekwencji odpowiedzi immunologicznej¹.

Zdolność do badania mikrokrążenia węzłów chłonnych in vivo jest kluczowa dla wyjaśnienia, w jaki sposób układ odpornościowy i mikrokrążenie oddziałują na siebie i wpływają na siebie wzajemnie w obrębie węzła chłonnego. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę obrazowania in vivo pachwinowego węzła chłonnego. Koncentrujemy się na obrazowaniu mikrokrążenia węzła chłonnego, zwracając szczególną uwagę na metody zapewniające badanie zdrowych naczyń, możliwość utrzymania obrazowania żywotnych naczyń przez kilka godzin oraz ilościową ocenę wielkości naczyń. Przedstawiono również metody perfuzji mikrokrążenia lekami wazoaktywnymi, a także możliwość śledzenia i ilościowego określania ruchu komórek.

Mikroskopia intravitalna węzła chłonnego pachwinowego umożliwia bezpośrednią ocenę funkcjonalności mikrokrążenia oraz analizę w czasie rzeczywistym bezpośredniego oddziaływania między komórkami odpornościowymi, węzłem chłonnym a mikrokrążeniem. Technika ta ma potencjał do łączenia z wieloma metodami immunologicznymi i fluorescencyjnym znakowaniem komórek, a także może być modyfikowana w celu badania unaczynienia innych węzłów chłonnych.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Odczynniki wykorzystywane w całym eksperymencie należy przygotować przed rozpoczęciem protokołu chirurgicznego. Należy pamiętać, że wszystkie roztwory były sporządzane przy użyciu techniki sterylnej.
2. Sól fizjologiczna (PSS) jest najlepiej przygotowana w dwóch komponentach: podstawowym roztworze soli oraz roztworze wodorowęglanu sodu. Oba roztwory należy przygotować w stężeniu 20X i przechowywać w temperaturze 4°C. Wodorowęglan sodu w stężeniu 20X to 360,0mM NaHCO₃ (84,01g/mol), a podstawowy roztwór soli w stężeniu 20X zawiera 2638,0mM NaCl (58,44g/mol), 94,0mM KCl (74,56g/mol), 40,0mM CaCl₂•2H₂O (147,02g/mol) oraz 23,4mM MgSO₄•7H₂O (246,48g/mol). Roztwory należy przygotować w dH₂O, dodając odczynniki pojedynczo i mieszając do uzyskania klarownego roztworu przed dodaniem kolejnej substancji.
3. Przygotować 2L PSS poprzez zmieszanie równych objętości wodorowęglanu sodu i podstawowego roztworu soli, a następnie rozcieńczenie do stężenia 1X (aby uzyskać dwa 2L PSS, rozcieńczyć 100mL każdego z roztworów w dH₂O).
4. Kolbę miarową o pojemności 2L zawierającą PSS umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Roztwór należy równoważyć mieszaniną 5% CO₂ / reszta azot przez 1h przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej.
5. Substancje wazoaktywne (np. fenylefryna, acetylocholina, nitroprusyd sodu) najlepiej przygotować w stężeniu 1M w dH2O i przechowywać w alikwotach 100μl w temperaturze -20°C.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Wyznaczyć masę ciała myszy i podać dawkę początkową pentobarbitalu sodowego w ilości 90mg/kg poprzez wstrzyknięcie doszpikowe. Przez cały czas trwania procedury należy stale monitorować głębokość anestezji myszy za pomocą ucisku palca stopy oraz uważnej obserwacji częstości oddechów. W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki pentobarbitalu sodowego w ilości 20mg/kg w celu utrzymania poziomu znieczulenia. Chirurgiczny poziom anestezji jest utrzymywany zgodnie z przepisami federalnymi i instytucjonalnymi, zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (ACUC) Uniwersytetu Northern BC.
2. Usunąć sierść z okolic brzucha oraz boków i bioder za pomocą strzygarki. Pozostałe luźne włosy usunąć za pomocą gazika nasączonego alkoholem i przykładając taśmę do skóry. Jest to wystarczające, ponieważ procedura eksperymentalna ma charakter terminalny.
3. Umieścić mysz na przezroczystej desce chirurgicznej w pozycji grzbietnej i przymocować ją do deski, przyklejając każdą poduszkę stopy taśmą. Temperaturę ciała utrzymuje się za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej i monitoruje za pomocą termometru rektalnego, aby zapobiec wystąpieniu hipotermii w wyniku działania środka znieczulającego.

3. Procedura chirurgiczna

1. Przez cały czas trwania procedury chirurgicznej należy zapewnić stałą perfuzję odsłoniętej tkanki wyrównanym, ogrzanym roztworem PSS. Ważne jest również, aby nie dotykać narzędziami chirurgicznymi badanych naczyń krwionośnych oraz nie uszkadzać ich poprzez wywieranie zbyt dużego nacisku podczas manipulowania otaczającą je tkanką tłuszczową i łączną.
2. Umieść mysz pod stereomikroskopem. Wykonaj cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż brzusznej powierzchni jamy brzusznej i odsunie skórę w kierunku kręgosłupa myszy.
3. Po odsunięciu skóry w sposób umożliwiający łatwą widoczność LN, przymocuj skórę szpilkami do podstawki z przezroczystego Sylgard 184.
4. Usuń cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającej obszar wokół LN.
5. Usuń tkankę tłuszczową pokrywającą i otaczającą węzeł chłonny, aż do odsłonięcia łoża mikronaczyniowego. Główny segment tętniczy znajduje się przylegać do LN i jest zazwyczaj przykryty żyłką. Cała operacja trwa około 30 minut.

4. Obrazowanie i analiza naczyń

1. Po odsłonięciu interesującego segmentu naczynia pod mikroskopem stereoskopowym, należy zamocować preparat na mikroskopie intravitalnym. Należy pamiętać, że zwierzę pozostaje na przezroczystej desce chirurgicznej w mikroskopie intravitalnym przez cały czas trwania eksperymentu. Temperaturę ciała utrzymuje się za pomocą lampy grzewczej i mierzy termometrem rektalnym, zgodnie z opisem w sekcji chirurgicznej. Poziom znieczulenia jest również monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu, jak opisano w sekcji 2.1.
2. Należy przygotować linie do superfuzji i ssania. Superfuzja PSS odbywa się poprzez grawitacyjne zasilanie z rezerwuaru do podgrzewanego rezerwuaru z płaszczem wodnym (płaszcz wodny jest cyrkulowany i podgrzewany przez łaźnię wodną), który jest przepłukiwany azotem zrównoważonym z 5% CO₂, a następnie spływa linią kroplową z prędkością 10ml/min. Linię ssącą należy wykorzystać do ciągłego odprowadzania superfuzowanego PSS z preparatu. Należy pamiętać, że przed eksperymentem linie ssące i płaszcz wodny są dokładnie czyszczone i przechowywane po każdym badaniu. Zapewnia to sterylność przed kolejnym eksperymentem.
3. Należy sprawdzić temperaturę superfuzowanego PSS. Temperaturę cyrkulującej łaźni wodnej i/lub szybkość superfuzji PSS należy dostosować tak, aby osiągnąć temperaturę ˜37°C w obrębie preparatu.
4. Należy pozwolić naczyniom na równowagę z PSS przez co najmniej 60 minut i określić średnicę naczynia za pomocą wideo-suwmiarki. Zazwyczaj średnicę naczynia należy wyznaczyć w kilku punktach czasowych (np. w 40, 50 i 60 minucie), aby upewnić się, że naczynie się ustabilizowało.
5. Stan naczynia należy ocenić przy użyciu specyficznego agonisty mięśni gładkich (np. fenylefryny, PE) oraz specyficznego agonisty śródbłonka (np. acetylocholiny, ACh). Stężenie agonisty powinno być dostosowane do rodzaju użytego związku, jednak w przypadku PE i ACh naczynie należy oceniać przy każdym stężeniu poprzez kumulatywne dodawanie (od 10-5M do 10-9M) do superfuzatu. Każde zastosowanie agonisty powinno być oddzielone fazą płukania (zazwyczaj 30 minut) za pomocą PSS, aż naczynie powróci do średnicy spoczynkowej.
6. Po ocenie stanu naczynia można przeprowadzić kolejne eksperymenty z lekami naczynioaktywnymi, znakowaniem fluorescencyjnym i śledzeniem komórek.
7. Po zakończeniu eksperymentu zwierzęciu podaje się przedawkowaną dawkę pentobarbitalu sodowego. Następnie monitoruje się zwierzę, aby upewnić się, że nie wykazuje reakcji na uciśnięcie palca u nogi oraz że brak jest ruchów oddechowych lub bicia serca. Wówczas przeprowadza się zwichnięcie szyi.

5. Reprezentatywne wyniki:

Po okresie equilibracji preparat powinien dawać wyraźny obraz, który pozwala na identyfikację zarówno tętniczki, jak i żyłki zaopatrującej węzeł chłonny pachwinowy. Wokół naczyń powinny znajdować się minimalne ilości komórek tłuszczowych, aby ściany tętniczki i żyłki były wyraźnie widoczne, co umożliwi nałożenie wideo-suwmiarki w celu obliczenia średnicy naczynia. Kluczowym elementem prawidłowo przygotowanego preparatu jest bogate ukrwienie światła tętniczki oraz zachowanie znacznego stopnia napięcia naczyniowego (tzn. tętniczka posiada zdolność do skurczu i rozszerzenia pod wpływem odpowiednio agonistów specyficznych dla mięśni gładkich i śródbłonka).

Rysunek 1. Obraz z mikroskopii intravitalnej tętniczki doprowadzającej do węzła chłonnego pachwinowego (czerwona strzałka), zrównoważonej z roztworem soli fizjologicznej, biegnącej wzdłuż głównej żyłki (zielona strzałka).

Rysunek 2. Normalna odpowiedź naczynioruchowa na superfuzję fenylefryny (PE) przy kumulatywnym dodawaniu do soli fizjologicznej w zakresach stężeń od 10^-9M do 10^-5M. Wystąpienie silnego skurczu naczyń sugeruje prawidłową funkcję mięśni gładkich w tętniczce.

Rysunek 3. Normalna odpowiedź naczynioruchowa na superfuzję acetylocholiny (ACh) poprzez kumulatywne dodawanie do soli fizjologicznej w stężeniach od 10^-9M do 10^-5M. Wystąpienie silnego rozszerzenia naczyń sugeruje prawidłową funkcję śródbłonka w tętniczce.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj mikroskopia intravitalna węzła chłonnego pachwinowego umożliwia obrazowanie mikrokrążenia węzła chłonnego in-vivo. W związku z tym ułatwia ona bezpośrednią obserwację w czasie rzeczywistym. Obrazowanie mikrokrążenia węzła chłonnego stanowi unikalną możliwość badania interfejsu między odpowiedzią immunologiczną a układem naczyniowym. Wykorzystując tę metodę, można skupić się konkretnie na odpowiedzi immunologicznej, zmianach w naczyniach krwionośnych lub na oddziaływaniu między tymi dwoma elementami.

Jak w przypadku wszystkich podejść eksperymentalnych, standardowa mikroskopia intravitalna posiada zarówno zalety, jak i ograniczenia^{1,2,3,4,5,6,7}. Standardową IVM, taką jak opisane tutaj przygotowanie, można łatwo zmodyfikować; autorzy wykazali wcześniej, że umożliwia ona mikroskopię epifluorescencyjną poprzez wprowadzenie fluorescencyjnych barwników śledzących lub znakowanych populacji komórek^{1,2,3,4,5,6,7}. Chociaż standardowa IVM nie daje możliwości obrazowania trójwymiarowego i śledzenia, jakie zapewnia mikroskopia dwufotonowa lub angiografia, śledzenie komórek w dwóch wymiarach jest nadal możliwe, co pozwala na obserwację i kwantyfikację interakcji międzykomórkowych oraz interakcji komórek z naczyniami krwionośnymi. W połączeniu z podaniem in-vivo i późniejszym barwieniem przeciwciałami fluorescencyjnymi metoda ta może być wykorzystywana do uzyskiwania danych o ekspresji białek/markerów w czasie rzeczywistym^{1,2,3,4,5,6,7}.

Warto zauważyć, że alternatywne techniki obrazowania wymagają statycznego środowiska; często konieczne jest unieruchomienie obszaru chirurgicznego lub zastosowanie szkiełka nakrywkowe na płaskim preparacie. Ogranicza to, a wręcz uniemożliwia, aktywną perfuzję mediatorów naczyniowych lub innych substancji nad preparatem w celu oceny integralności i fizjologii naczyń itp., a także stosowanie innych technik, takich jak eksperymenty z wazodylatacją w obrębie preparatu IVM^2,3,4,6,7. Co więcej, standardowe IVM nie wymaga całkowicie płaskiego preparatu i nie jest podatne na ruchy, np. wywołane oddychaniem zwierzęcia^{1,2,3,4,5,6,7}. Pozwala to na zastosowanie standardowego IVM w większej liczbie obszarów chirurgicznych z lepszą powtarzalnością. Przykładem jest opisany tutaj preparat węzła chłonnego pachwinowego. Ze względu na rozmiar i kształt węzła chłonnego, preparat nie może zostać spłaszczony bez uszkodzenia tkanki, a lokalizacja węzła powoduje znaczne przemieszczenia wynikające z oddychania zwierzęcia. Takie problemy byłyby trudne do pokonania przy użyciu innych metod, lecz są łatwo rozwiązywane dzięki opisanemu standardowemu przygotowaniu IVM.

Podsumowując, opisane powyżej przygotowanie można połączyć z dowolną liczbą innych technik biochemicznych, naczyniowych i/lub immunologicznych, takich jak transfer subpopulacji komórek aktywowanych lub znakowanych, indukcja hipoksji oraz nadekspresja lub deplekcja mediatorów naczyniowych. Jednakże dodatkowe zastosowania są zależne od stanu zdrowia początkowego preparatu. Dlatego kluczowe jest zawsze badanie kondycji naczyń krwionośnych poddawanych obrazowaniu i ocenie. Głównymi punktami pozwalającymi na uzyskanie prawidłowego preparatu są zapewnienie stałej perfuzji zrównoważonym PSS w temperaturze ciała oraz minimalizacja kontaktu i stresu wywieranego na obszar operacyjny podczas zabiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Węglan sodu	Sigma-Aldrich
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich
Dwuwodnian chlorek wapnia	Sigma-Aldrich
Nitroprusyd sodu	Sigma-Aldrich
Fenylefryna	Sigma-Aldrich
Acetylocholina	Sigma-Aldrich
Siedmiowodnian chlorku magnezu	Sigma-Aldrich
Pentobarbital sodu