$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie tkanki dawcy
- Przygotuj pożywkę hodowlaną, naostrz szklane szpilki, naostrz igły wolframowe.
- Zbierz zarodek ze skorupy, umyj w lodowatym PBS.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły o rozmiarze 18 usuń 1,0 ml albuminy ze spiczastego końca skorupki jajka.
- Zrób mały otwór na górze skorupy za pomocą nożyczek, a następnie wytnij okrągły otwór, aby odsłonić zarodek
- Zdejmij głowę i umieść w DMEM (bez surowicy, temperatura pokojowa)
- Wypreparuj wyrostek czołowo-nosowy z zarodka (lub innego miejsca dawczego, takiego jak wyrostek szczękowy lub żuchwowy)
- Trawić w 2,4 U / ml dypazy w PBS na lodzie przez 20 minut
- Przykryj tkanki DMEM 1% BSA, aby zatrzymać trawienie
- Użyj zaostrzonej igły wolframowej, aby oddzielić ektodermę, mezenchymę i neuroektodermę
- Przechowywać przeszczepioną tkankę w DMEM 1% BSA na lodzie, aż gospodarz będzie gotowy do przeszczepu
2. Przygotowanie gospodarza
- Odsłoń zarodek
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły o rozmiarze 18 usuń 1,0 ml albuminy ze spiczastego końca skorupki jajka.
- Zrób mały otwór na górze skorupy za pomocą nożyczek. Umieść kawałek taśmy na otworze, a następnie wytnij okrągły otwór, aby odsłonić zarodek.
- Za pomocą 2 par kleszczy chwyć owodnię i delikatnie rozerwij, aby zrobić dziurę.
- Obróć głowę, kładąc kleszcze na prawym oku i wywierając nacisk. Trzymając głowę stabilnie, użyj igły wolframowej, aby usunąć ektodermę gospodarza, aby pomieścić przeszczep.
- Przenieś przeszczep do gospodarza za pomocą szklanej pipety.
- Ustaw przeszczep tak, aby zastąpił usuniętą ektodermę. Włóż szklaną szpilkę w każdy róg przeszczepionej tkanki, aby przypiąć przeszczep na miejscu. Aby zrobić szklane szpilki, przeciągnij rurkę mikrokapilarną do drobnego punktu nad płomieniem alkoholowym.
- Umieść taśmę ciasno na otworze i włóż zarodek z powrotem do inkubatora na odpowiedni czas do analizy.
- Zobacz też: 9
3. Reprezentatywne wyniki:
Aby ocenić chimery, należy pobrać i przetworzyć zarodki do analizy rozmieszczenia tkanek gospodarza i dawcy. Do wykrywania komórek przepiórczych stosuje się immunohistochemię z wykorzystaniem przeciwciała QcPN (opisanego w pkt. 3), a do wykrywania komórek myszy stosuje się hybrydyzację in situ na skrawkach parafiny 6. Komórki dawcy powinny być ograniczone do nabłonka i nie powinno być dowodów na istnienie tkanek mezenchymalnych dawcy (ryc. 1). Obecność izolowanych komórek dawcy w mezenchymie wskazuje na obecność zanieczyszczonych komórek grzebienia nerwowego, które zakłócą każdą interpretację morfologiczną ze względu na wpływ tych komórek na wiele aspektów rozwoju twarzy (np. 10). Po przekonaniu, że technika przeszczepu jest wolna od zanieczyszczającego mezenchymy, można zastosować dalsze morfologiczne lub molekularne pomiary wyników do oceny chimer. Dla naszych celów wykryliśmy obecność ektopowych chrząstek i kości, które odpowiadały duplikacjom górnej szczęki, które zostały wywołane przez przeszczepione tkanki (ryc. 2), oraz zmiany molekularne w tkankach mezenchymalnych w odpowiedzi na przeszczepioną ektodermę (ryc. 3)5,6.
Rysunek 1. Ocena chimeryzmu (A) Barwienie anty-QcPN służy do wykrywania komórek przepiórczych w chimerach piskląt przepiórczych. Nie ma dowodów na barwienie w mezenchymie. (B) Hybrydyzacja in situ służy do wykrywania ekspresji transkryptów SINE B2 w chimerach myszy-piskląt. Ekspresja jest ograniczona do ektodermy składającej się z przeszczepu.
Rysunek 2. Barwienie trichromowe wskazuje na duplikację szkieletu górnej szczęki w (A) chimerze piskląt przepiórczych i (B) chimerach piskląt myszy.
Rysunek 3. Ektoderma reguluje ekspresję genów w mezenchymie. (A) Normalna ekspresja Bmp7 w mezenchymie zarodka pisklęcia (radioaktywna hybrydyzacja in situ z sygnałem dodatnim pseudozabarwionym na czerwono w Adobe Photoshop). (B) Ekspresja Bmp7 jest indukowana w mezenchymie przylegającej do przeszczepu (strzałka) w zarodkach chimerycznych.