W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dostępność embrionów ptaków pomogła embriologom eksperymentalnym zrozumieć losy komórek podczas rozwoju oraz rolę oddziaływań tkankowych regulujących wzorowanie i morfogenezę kręgowców (np. 1, 2, 3, 4). W niniejszej pracy przedstawiamy metodę, która wykorzystuje tę dostępność do badania właściwości sygnalizacyjnych i wzorujących tkanek ektodermalnych podczas rozwoju twarzy. W tych eksperymentach tworzymy chimery przepiórczo-kurze 5 lub mysio-kurze 6 poprzez przeszczepianie powierzchniowego ektodermy głownej pokrywającej górną szczękę z przepiórki lub myszy do tego samego obszaru lub obszaru ektopowego embrionów kurcząt. Wykorzystanie przepiórki jako tkanki donora do przeszczepów u kurcząt zostało opracowane, aby wykorzystać marker jąderkowaty obecny w komórkach przepiórki, a nie kurcząt, co pozwala badaczom odróżnić tkanki gospodarza od tkanek donora 7. Podobnie, w genomie myszy występuje element powtarzalny, który jest wyrażany powszechnie, co umożliwia nam odróżnienie tkanek gospodarza od tkanek donora w chimerach mysio-kurzych 8. Zastosowanie ektodermy mysiej jako tkanki donora znacznie poszerzy naszą wiedzę na temat tych oddziaływań tkankowych, ponieważ pozwoli nam to przetestować właściwości sygnalizacyjne ektodermy pochodzącej z różnych embrionów mutantów.
Protokół
1. Przygotowanie tkanki dawcy
- Przygotować pożywki hodowlane, zaostrzyć szpilki szklane oraz igły wolframowe.
- Pobrać embrion ze skorupki i przemyć w lodowatym PBS.
- Za pomocą strzykawki 10 mL i igły o rozmiarze 18 G usunąć 1,0 mL albuminy z zaostrzonego końca skorupki jaja.
- Wykonać mały otwór w górnej części skorupki za pomocą czubka nożyczek, a następnie wyciąć okrągły otwór, aby odsłonić embrion.
- Odciąć głowę i umieścić w DMEM (bez surowicy, w temperaturze pokojowej).
- Wypreparować wypustek czołonośny z embrionu (lub z innego miejsca dawcy, np. z wypustka szczękowego lub żuchwowego).
- Trawić w roztworze dispazy 2,4U/mL w PBS na lodzie przez 20 min.
- Przykryć tkanki pożywką DMEM z 1% BSA, aby zatrzymać proces trawienia.
- Użyć zaostrzonej igły wolframowej do oddzielenia ektodermy, mezenchymy i neuroektodermy.
- Przechowywać tkankę przeszczepową w DMEM 1% BSA na lodzie do momentu przygotowania biorcy do transplantacji.
2. Przygotowanie gospodarza
- Odsłonięcie zarodka
- Za pomocą strzykawki 10 mL i igły 18 G usunąć 1,0 mL albuminy z zaostrzonego końca skorupki jaja.
- Za pomocą ostrza nożyczek wykonać mały otwór w górnej części skorupki. Przykryć otwór kawałkiem taśmy, a następnie wyciąć okrągły otwór, aby odsłonić zarodek.
- Używając dwóch par pęset, chwycić owodni i ostrożnie ją przerwać, aby wykonać otwór.
- Obrócić głowę, przykładając pęsetę do prawego oka i wywierając nacisk. Trzymając głowę nieruchomo, usunąć za pomocą igły wolframowej ektodermę gospodarza, aby przygotować miejsce na przeszczep.
- Przenieść przeszczep do gospodarza za pomocą pipety szklanej.
- Ułożyć przeszczep w miejscu usuniętej ektodermy. W każdym rogu przeszczepionej tkanki umieścić szpilkę szklaną, aby przymocować przeszczep na miejscu. Aby wykonać szpilki szklane, rozciągnąć rurkę mikrokapilarną do cienkiego punktu nad płomieniem palnika alkoholowego.
- Szczelnie zakleić otwór taśmą i przenieść zarodek z powrotem do inkubatora na czas odpowiedni do przeprowadzenia analizy.
- patrz również: 9
3. Reprezentatywne wyniki:
Aby ocenić chimery, należy zebrać zarodki i poddać je obróbce w celu analizy rozkładu tkanek gospodarza i dawcy. Do wykrywania komórek przepiórki stosuje się immunohistochemię z użyciem przeciwciała QcPN (opisanego w: 3), a do wykrywania komórek mysich wykorzystuje się hybrydyzację in situ na skrawkach parafinowych 6. Komórki dawcy powinny ograniczać się do nabłonka i nie powinno być dowodów na obecność mezenchymalnych tkanek dawcy (Rycina 1). Obecność izolowanych komórek dawcy w mezenchymie wskazuje na zanieczyszczenie komórkami grzebienia neuronalnego, co zafałszuje każdą interpretację morfologiczną ze względu na wpływ tych komórek na wiele aspektów rozwoju twarzy (np. 10). Po upewnieniu się, że technika przeszczepiania jest wolna od zanieczyszczeń mezenchymalnych, do oceny chimer można zastosować dalsze miary wyników morfologicznych lub molekularnych. W naszym przypadku wykryliśmy obecność ektopowych chrząstek i kości, które odpowiadały duplikacjom górnej szczęki indukowanym przez przeszczepione tkanki (Rycina 2), oraz zmiany molekularne w tkankach mezenchymalnych w odpowiedzi na przeszczepiony ektoderm (Rycina 3)5,6.
Rysunek 1. Ocena chimeryzmu (A) Barwienie przeciwciałami anty-QcPN jest wykorzystywane do wykrywania komórek przepiórki w chimerach przepiórka-kurczak. W mezenchymie nie stwierdzono barwienia. (B) Hybrydyzacja in situ jest wykorzystywana do wykrywania ekspresji transkryptów SINE B2 w chimerach mysz-kurczak. Ekspresja jest ograniczona do ektodermy tworzącej przeszczep.
Rysunek 2. Barwienie trichromowe wykazuje duplikację szkieletu górnej szczęki w (A) chimerze przepiórka-kurczak oraz (B) chimerach mysz-kurczak.
Rycina 3. Ektoderma reguluje ekspresję genów w mezenchymie. (A) Normalna ekspresja Bmp7 w mezenchymie zarodka kurczaka (radioaktywna hybrydyzacja in situ z sygnałem dodatnim zaznaczonym pseudokolorem czerwonym w programie Adobe Photoshop). (B) Ekspresja Bmp7 zostaje indukowana w mezenchymie sąsiadującym z przeszczepem (strzałka) w embrionach chimerycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowanie tej metody transplantacji pozwoliło nam ustalić, że ektoderm zawiera informacje sygnałowe regulujące polarność grzbietowo-brzuszną oraz wydłużenie proksymalno-dystalne górnej szczęki. Podobieństwo wyników przy użyciu ektodermy przepiórki lub myszy oraz konserwacja sygnałów molekularnych w tej tkance u wielu gatunków 6,11 wskazuje, że jest to wysoce konserwatywne centrum sygnałowe u kręgowców. Co więcej, inni badacze wykorzystali podobne techniki do przetestowania właściwości sygnałowych różnych ob...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantów R01-DE018234 oraz R01-DE019638.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Tektronix, Inc. | TEKZR114 | |
| DMEM | University of California - San Francisco | CCFDA003 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dyspaza | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Szalka Petri 35x10 mm | Falcon BD | 1008 | |
| Pinceta Dumont nr 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Igłotrzymacz | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Igła wolframowa | Fine Science Tools | 26000 | |
| Rurka mikrokapilarna | Drummond Scientific | 3-000-225-G | |
| Pipety Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Uchwyt do ostrza | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Ostrze do golenia | Fine Science Tools | 10050-00 |
Bibliografia
- Noden, D. M. The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).
- Bronner-Fraser, M., Stern, C. Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration. Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).
- Schneider, R. A. Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).
- Couly, G. Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development. 129, 1061-1061 (2002).
- Evans, D. J., Noden, D. M. Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells. Dev Dyn. , (2006).
- Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130, 1749-1749 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Dev Biol. 325, 200-200 (2009).
- Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).
- Bollag, R. J. Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras. Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development. 132, 1499-1499 (2005).
- Odent, S. Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly. Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).
- Szabo-Rogers, H. L. Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit. Development. 136, 219-219 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
