Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Podsumowanie

Opisano metodę niezawodnego przeszczepiania ludzkich komórek złośliwego guza pochewki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do wykazania prawidłowego przyjęcia przeszczepów nowotworowych oraz kryteria losowego przydziału zwierząt do grup badawczych.

Streszczenie

Chociaż badania przesiewowe in vitro są niezbędne do wstępnej identyfikacji potencjalnych czynników terapeutycznych, rygorystyczna ocena zdolności leku do hamowania wzrostu guza musi zostać przeprowadzona na odpowiednim modelu zwierzęcym. Rodzaj modelu zwierzęcego, który najlepiej nadaje się do tego celu, jest przedmiotem intensywnych dyskusji. Niektóre dowody wskazują, że badania przedkliniczne sprawdzające działanie leków na guzy powstające u myszy transgenicznych lepiej przewidują wyniki kliniczne¹, dlatego potencjalne czynniki terapeutyczne są często testowane w tych modelach. Niestety, modele transgeniczne nie są dostępne dla wielu typów nowotworów. Ponadto modele transgeniczne często wykazują inne ograniczenia, takie jak wątpliwości co do tego, jak dobrze mysi guz odzwierciedla jego ludzki odpowiednik, niepełna penetracja fenotypu nowotworowego oraz brak możliwości przewidzenia, kiedy rozwinie się guz.

W konsekwencji wielu badaczy w badaniach przedklinicznych wykorzystuje modele ksenoprzeszczepów (ludzkie komórki nowotworowe przeszczepione niedoborowym immunologicznie myszom), jeśli nie są dostępne odpowiednie transgeniczne modele nowotworów. Nawet w przypadku dostępności modeli transgenicznych, często łączy się je z modelami ksenoprzeszczepów, ponieważ te drugie umożliwiają szybkie określenie zakresów terapeutycznych. Ponadto takie podejście pozwala na porównanie skuteczności preparatu w nowotworach transgenicznych i w rzeczywistych ludzkich komórkach nowotworowych. Historycznie ksenoprzeszczepy często wykonywano poprzez podskórne wstrzykiwanie komórek nowotworowych (ksenoprzeszczepy ektopowe). Technika ta jest szybka, powtarzalna, stosunkowo tania i pozwala na ciągłe ilościowe określanie wzrostu guza w okresie terapeutycznym². Jednak przestrzeń podskórna nie jest naturalnym mikrośrodowiskiem dla większości nowotworów, dlatego wyniki uzyskane za pomocą ksenoprzeszczepów ektopowych mogą być mylące ze względu na czynniki takie jak brak organowo specyficznej ekspresji genów tkanki gospodarza i nowotworu. Zdecydowanie zalecano zatem, aby badania nad przeszczepami ektopowymi zastąpić lub uzupełnić badaniami, w których ludzkie komórki nowotworowe są przeszczepiane do tkanki pochodzenia (ksenoprzeszczepy ortotopowe)². Niestety wdrożenie tej rekomendacji jest często utrudnione przez fakt, że metodologie ksenoprzeszczepów ortotopowych nie zostały jeszcze opracowane dla wielu typów nowotworów.

Złośliwe guzy pochewek nerwów obwodowych (MPNST) to wysoce agresywne mięsaki, które występują sporadycznie lub w związku z neurofibromatozą typu 1³, a najczęściej rozwijają się w nerwie kulszowym⁴. W niniejszej pracy opisujemy technicznie prostą metodę, w której ludzkie komórki MPNST znakowane lucyferazą świetlikową są ortotopowo przeszczepiane do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również nasze podejście do oceny sukcesu procedury przeszczepiania u poszczególnych zwierząt oraz późniejszej bezstronnej randomizacji do grup badawczych.

Protokół

1. Wstępne przygotowanie myszy niedoborowych nie-nude (nie jest to konieczne dla szczepów nude):

1. Wszystkie procedury zostały uprzednio przejrzane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) UAB i przeprowadzone przez odpowiednio przeszkolony personel. W tych eksperymentach z sukcesem wykorzystaliśmy trzy linie myszy z niedoborem odporności: a) myszy SCID Foxchase outbred (myszy CB17/lcr-Prkdc^scid/lcrCrl); b) myszy NIH III (myszy NIHS-Lyst^bgFoxn1^nuBrk^xid); oraz c) myszy NOD-SCIDγ (myszy NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ). W naszych badaniach wzrost ksenograftów ortotopowych jest praktycznie identyczny u myszy NIH III oraz NOD-SCIDγ, z których obie posiadają mutacje wpływające na funkcję limfocytów T, limfocytów B i komórek NK; w niniejszym protokole liczba dni wymaganych do wzrostu przeszczepu, czas rozpoczęcia terapii oraz terminy obrazowania po przeszczepieniu są wartościami określonymi empirycznie z wykorzystaniem myszy NOD-SCIDγ. Wzrost przeszczepu u myszy SCID Foxchase outbred, które mają defekty funkcji limfocytów T i B, zazwyczaj trwa dłużej.
2. Aby ułatwić przeszczepianie u dużej liczby myszy z niedoborem odporności (pozbawionych cechy „nude”), usuwamy owłosienie z miejsca operacyjnego w popołudnie przed zabiegiem. Myszy są znieczulane w komorze indukcyjnej izofluranem podłączonej do waporyzatora z systemem odprowadzania gazów wylotowych. W celu utrzymania temperatury ciała zwierzęta są przez cały ten proces trzymane na podkładce grzewczej. Do usunięcia włosów z części środkowej grzbietu aż do kolana tylnej kończyny po stronie, w której ma zostać wykonany przeszczep, używa się trymera. Pozostałe włosy są starannie usuwane z tego miejsca w ciągu ok. 5 minut za pomocą chemicznego preparatu do depilacji (np. Nair, w szczególności produktu z aloe vera dla skóry wrażliwej). Zaleca się usunięcie preparatu depilacyjnego, ponieważ może on prowadzić do podrażnienia skóry, oczu i innych powierzchni ciała, na które mógłby się rozprzestrzenić. W tych eksperymentach nie wykonujemy przeszczepów w obu nerwach kulszowych, ponieważ może to doprowadzić do obustronnego upośledzenia funkcji kończyn tylnych, co skutkowałoby utratą myszy z grup badawczych.
3. Myszyom pozwala się na pełną rekonwalescencję na podkładce grzewczej w klatce izolacyjnej bez ściółki; zapewnia to, że myszy nie zostaną zranione przez inne, bardziej rozbudzone zwierzęta, oraz zapobiega przypadkowemu wdychaniu ściółki. Gdy myszy odzyskają pełną sprawność ruchową i nie wykazują oznak otumanienia, mogą zostać ponownie umieszczone w klatce z innymi myszami.

2. Przygotowanie komórek MPNST do wstrzyknięcia w dniu przeszczepiania

1. W niniejszym protokole konkretne liczby przeszczepionych komórek oraz czasy wymagane do wzrostu guza po przeszczepieniu zostały określone empirycznie dla komórek ST8-14, powszechnie stosowanej linii MPNST pochodzącej z guza związanego z NF1⁵. Komórki wykorzystywane do przeszczepiania zostały transdukowane wektorem lentiwirusowym zawierającym kasetę CMV-lucyferaza-IRES-puromycyna, a klony stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy świetlikowej zidentyfikowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego⁶. Przeprowadziliśmy również eksperymenty z przeszczepianiem komórek MPNST stabilnie transfekowanych plazmidami wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlikowej pod kontrolą wczesnego promotora CMV. Nie zalecamy tej metody, ponieważ stwierdziliśmy, że wektory plazmidowe te są podatne na wygasanie ekspresji po przeszczepieniu.
2. Komórki ST8-14 hoduje się w minimalnym podłożu podstawowym Dulbecco uzupełnionym o 10% płodowej surowicy cielęcej, 10 μg/mL streptomycyny i 10 IU/mL penicyliny (DMEM10); w celu utrzymania selekcji wektora lentiwirusowego dodaje się również 5 μg/ml puromycyny. Utrzymujemy te komórki w naszym laboratorium przez 50 pasaży i nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian w tempie wzrostu komórek w żadnym z tych pasaży. 9 x 10⁵ komórek ST8-14 wysiewa się do kolby T175 i hoduje przez 3 dni, aż do momentu, gdy kolba osiągnie około 80% konfluencji. Do przeszczepienia 35 myszy wymagana jest jedna kolba T175 z 80% konfluencją; przy tej gęstości średnia wydajność dla komórek ST8-14 wynosi 7,3 x 10⁶ komórek na kolbę T175. Krytycznie ważne jest, aby nie dopuścić do pełnej konfluencji komórek przed ich zbiorami do przeszczepienia. Stwierdziliśmy, że przeszczepianie komórek zebranych z konfluencyjnych kolb prowadzi do częstszych niepowodzeń przeszczepu i często wydłuża przebieg wzrostu przeszczepu in vivo.
3. Komórki ST8-14 płucze się raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa o temperaturze pokojowej. Komórki usuwa się z kolby, stosując roztwór do dysocjacji komórek Cell Stripper przez 30 sekund do 1 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie do komórek dodaje się pięć mililitrów DMEM10 (Uwaga: podłoże to nie zawiera puromycyny) na każdy mililitr zużytego roztworu Cell Stripper.
4. Komórki zlicza się za pomocą hemocytometru. Każdej myszy wstrzykuje się 5 x 10³ komórek ST8-14 zawieszonych w 3 μL. Ilość komórek wystarczającą do przeszczepienia całej grupy, z uwzględnieniem błędu pipetowania (np. dla 35 myszy zazwyczaj przenosimy liczbę komórek wystarczającą dla 40 myszy), przenosi się do sterylnej probówki 1,5 mL. Komórki wiruje się przy 300 obr./min przez 5 minut. Nadłożu ostrożnie usuwa się, a pellet komórkowy resuspenduje w DMEM10 (Uwaga: podłoże to nie zawiera puromycyny) do końcowego stężenia 5 x 10³ komórek na 3 μL. Komórki należy przechowywać w lodzie.

3. Protokół szczepienia

1. Myszami poddaje się znieczulenie w komorze indukcyjnej parowarzelnika izofluranu, aż do momentu, gdy przestaną wycofywać tylną kończynę w odpowiedzi na bodziec uciskowy palca. Myszy kładzie się na boku i wstrzykuje im podskórnie 0,05 mg/kg hydrochlorku buprenorfiny. Następnie znieczulenie utrzymuje się poprzez ciągłe podawanie izofluranu za pomocą stożka nosowego. Należy pamiętać, że do demonstracji tej procedury w filmie wykorzystano mysz uśpioną; w związku z tym dreny doprowadzające izofluran nie są widoczne na nagraniu.
2. Aby utrzymać temperaturę ciała, zwierzęta podczas całego procesu szczepienia umieszcza się na macie grzewczej. W celu zapobiegania wysychaniu rogówki do każdego oka podaje się małą kroplę maści okulistycznej (maść weterynaryjna Puralube). Ponieważ każda mysz musi być jednoznacznie zidentyfikowana w trakcie badania, do prawego ucha każdej myszy przypina się kolczyk z unikalnym numerem identyfikacyjnym.
3. Umieść zwierzę na brzuchu, rozszerzając tylne kończyny. Przykryj mysz sterylną draperią, odsłaniając okno chirurgiczne (bok), w którym zostanie wykonane szczepienie. Sterylna draperia powinna umożliwiać widoczność głowy, aby upewnić się, że nos nadal znajduje się wewnątrz stożka oraz aby umożliwić monitorowanie oddychania i koloru zwierzęcia. Na pole operacyjne nanieś betadynę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, zaczynając od środka boku i stopniowo kierując się spiralnie na zewnątrz, ku krawędziom okna chirurgicznego. Następnie w ten sam sposób nanosi się na pole operacyjne 70% etanol. Kolejne aplikacje betadyny i etanolu powtarza się jeszcze dwukrotnie.
4. Wyjmij komórki z lodu i delikatnie zamieszaj w wirówce lub potrząśnij probówką, aby resuspenderować osiadłe komórki. Za pomocą pipety pobierz 3,2 μL zawiesiny komórkowej i nanieś ją na kawałek Parafilmu. Pobranie większej ilości niż jest wymagane i umieszczenie zawiesiny na Parafilmie pozwala upewnić się, że w zawiesinie nie ma pęcherzyków powietrza i że dysponujemy pełną objętością 3 μL do iniekcji. Pobierz jak największą ilość zawiesiny komórkowej do strzykawki Hamiltona o objętości 10 μL wyposażonej w igłę 3G. Usunij pęcherzyki powietrza ze strzykawki i usuń nadmiar zawiesiny komórkowej, aby uzyskać dokładnie 3 μL. Przechowuj komórki i strzykawkę z komórkami na lodzie do momentu użycia; aby zapewnić sterylność igły, nie dopuszczaj do jej kontaktu z lodem lub pojemnikiem. Na wierzchu lodu można położyć kawałek folii spożywczej, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi strzykawki z lodem.
5. Używając trzonka skalpela nr 4 z ostrzem nr 2, wykonaj nacięcie skóry boku tuż poniżej i równolegle do kości udowej; upewnij się, że nacięcie nie wykracza poza granice pola chirurgicznie oczyszczonego. Rozszerz nacięcie skóry za pomocą zacisku chirurgicznego lub ręcznie, aby odsłonić leżący pod nią mięsień. Widoczna będzie płaszczyzna powięziowa biegnąca wzdłuż nogi; pod nią, pomiędzy dwoma mięśniami połączonymi powięzią, znajduje się nerw kulszowy. Używając ostrych nożyczek, wykonaj tępe rozwarstwienie powięzi, aby odsłonić nerw kulszowy, który powinien być widoczny jako biała struktura liniowa o grubości zbliżonej do grubej nici.
6. Używając ostrych zakrzywionych pęset, ostrożnie odseparuj tkanki pod nerwem, uwalniając go z leżącego poniżej mięśnia; czynność ta uniesie i odizoluje nerw. Pozostaw pęsetę pod nerwem, aby utrzymać tę pozycję. Ostrożnie wprowadź igłę strzykawki Hamiltona do nerwu, starając się utrzymać kąt wstrzyknięcia jak najbardziej równolegle do nerwu, aby igła nie przebiła go na wylot. Igłę należy wprowadzać w stronę końca nerwu dystalnego względem kręgosłupa – ustalono, że wstrzykiwanie komórek nowotworowych do nerwu w kierunku rdzenia kręgowego powoduje rozmieszczenie szczepionych komórek w bliższym sąsiedztwie rdzenia. W takim przypadku komórki nowotworowe często naciekają rdzeń kręgowy, co prowadzi do przedwczesnej utraty zwierzęcia z grupy badawczej z powodu upośledzenia funkcji rdzenia.
7. Po prawidłowym ustawieniu igły w nerwie, rozluźnij napięcie wywołane przez pęsetę i powoli wstrzyknij komórki ze strzykawki do nerwu w czasie 45-60 sekund. Niezbędne jest, aby robić to powoli, ponieważ gwałtowne wypchnięcie zawartości strzykawki spowoduje „cofnięcie” komórek nowotworowych wokół miejsca wstrzyknięcia i ich utratę. Po pomyślnym wstrzyknięciu wszystkich komórek powoli wycofaj igłę, aby zminimalizować utratę wstrzykniętego materiału.
8. Usuń pęsetę i ostrożnie umieść nerw z powrotem w pierwotnym położeniu pod mięśniem. Zamknij nacięcie chirurgiczne za pomocą kleju chirurgicznego Vetbond. Przytrzymaj brzegi nacięcia pęsetą przez około 20 sekund, aby klej mógł wyschnąć.
9. Myszy wyjmuje się ze stożka nosowego z izofluranem i umieszcza pojedynczo w klatce bez ściółki w celu rekonwalescencji. Klatka ta powinna znajdować się na macie grzewczej, aż zwierzę w pełni dojdzie do siebie. Część klatki rekonwalescencyjnej nie powinna znajdować się na macie grzewczej, co umożliwia zwierzęciu oddalenie się od źródła ciepła, jeśli zrobi mu się zbyt gorąco. Po szczepieniu zwierzęta należy regularnie oceniać pod kątem gryzienia w miejscu zabiegu, kulawizny lub anoreksji; objawy te mogą wskazywać na to, że zwierzę nadal odczuwa ból i należy podać odpowiednie leki przeciwbólowe. Po zdobyciu doświadczenia w tej procedurze ustalono, że w ciągu jednego dnia można bez problemu zaszczepić 30-40 myszy.

4. Ocena powodzenia przeszczepu i randomizacja do grup badawczych

1. Obrazowanie bioluminescencyjne jest stosowane do oceny powodzenia procedury przeszczepienia. Wykorzystujemy system IVIS-10 (pierwotnie firmy Xenogen, obecnie znanej jako Calipers Inc.) do wykrywania emisji światła z ekspresowanej w guzie lucyferazy świetlikowej, która powstaje w wyniku reakcji chemicznej lucyferazy z jej substratem, D-lucyferyną. Analizy tych obrazów pozwalają określić, czy konkretne myszy z przeszczepem nadają się do włączenia do kohort badań terapeutycznych. W eksperymentach wstępnych ilościowo określiliśmy wykrywalne sygnały bioluminescencji, uśmierciliśmy myszy z przeszczepem, pobraliśmy guzy i skorelowaliśmy ich masę z sygnałami bioluminescencji z analiz obszarów zainteresowania (ROI) przy użyciu oprogramowania Living Image Software producenta. Badania te wykazały liniową korelację między masą przeszczepionych guzów a emisją światła bioluminescencyjnego, co wskazuje, że obrazowanie bioluminescencyjne jest odpowiednią metodą zastępczą do oceny wzrostu ksenoprzeszczepów w trakcie badań przedklinicznych. Zazwyczaj obrazujemy 5 myszy jednocześnie. Dodatkowe szczegóły dotyczące obrazowania bioluminescencyjnego zostały opublikowane wcześniej⁷.
2. W celu oceny powodzenia przeszczepienia obrazowanie bioluminescencyjne wykonuje się 1 i 3 dni po zabiegu. Obrazy są gromadzone od myszy ustawionych w tej samej pozycji 10 min po domięśniowym wstrzyknięciu 2,5 mg D-lucyferyny. Podczas obrazowania myszy znajdują się pod narkozą izofluranową, a ich temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37°C za pomocą maty grzewczej znajdującej się w urządzeniu obrazującym Xenogen. Czas akwizycji obrazu mieści się w zakresie od 2 s do 10 min; oprogramowanie do akwizycji danych zapewnia, że żadne piksele nie ulegają nasyceniu podczas gromadzenia obrazów. Emisję światła z obszarów guzów (względna liczba fotonów/s) mierzy się za pomocą autorskiego oprogramowania firmy Xenogen. Intensywność emisji światła jest przedstawiona za pomocą pseudokolorowej skali bioluminescencji, która jest nałożona na czarno-białe fotografie myszy wykonane w tym samym czasie.
3. Aby kwalifikować się do włączenia do kohorty badania przedklinicznego, myszy muszą wykazywać wykrywalny sygnał bioluminescencji zarówno 1, jak i 3 dni po przeszczepieniu, a intensywność sygnału bioluminescencji musi wzrosnąć między 1. a 3. dniem. Zwierzęta z sygnałem zmniejszonym lub statycznym są wykluczane. Ponadto sygnały wykryte u myszy przeszczepionych w tym samym dniu powinny mieścić się w zakresie jednego rzędu wielkości względem siebie; myszy z sygnałami bioluminescencji niższymi lub wyższymi o rząd wielkości niż te wykryte u zwierząt przeszczepionych w tym samym dniu są również wykluczane.
4. Po zidentyfikowaniu myszy spełniających te kryteria, muszą one zostać zrandomizowane do grup terapeutycznych. Aby to osiągnąć, sygnały lucyferazy wykryte u myszy z przeszczepem 3 dni po zabiegu są najpierw szeregowane od najwyższej do najniższej intensywności. Następnie myszy są randomizowane do grup poprzez przypisywanie ich w kolejności intensywności do grup terapeutycznych, odwrócenie tej kolejności, a następnie powtórzenie procesu, aż wszystkie myszy zostaną przypisane do grup. Na przykład, jeśli istnieją 4 grupy terapeutyczne (np. placebo i trzy stężenia badanego leku), myszy są przypisywane do grup w kolejności 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1 itd. Przed rozpoczęciem leczenia sygnały bioluminescencji wykryte u każdego członka przypisanej grupy są uśredniane, aby upewnić się, że średnie sygnały początkowe we wszystkich grupach są jak najbliższe. Podawanie kandydującego środka terapeutycznego rozpoczyna się w 3. dniu.
5. Aby ocenić wpływ środka terapeutycznego na wzrost przeszczepu w trakcie leczenia, obrazowanie bioluminescencyjne wykonuje się raz w tygodniu po rozpoczęciu terapii (dni 10, 17, 24, 30 po przeszczepieniu). W przypadku immunodeficyjnych myszy niebezwłosych krytycznie ważne jest, aby przed każdą sesją obrazowania ponownie usunąć nowo odrastającą sierść za pomocą preparatu Nair. Wynika to z faktu, że włosy blokują sygnały bioluminescencyjne, a kolor okrywy determinuje stopień utraty sygnału. Na przykład biała sierść, występująca u myszy Swiss Webster, powoduje 18% redukcję intensywności sygnału bioluminescencyjnego⁸, podczas gdy czarna sierść może zmniejszyć sygnały nawet 10-krotnie⁹. Należy również zauważyć, że nie można założyć, iż we wszystkich grupach terapeutycznych wystąpi jednolity odrost sierści i że "znormuje" to redukcje sygnału między grupami. Wynika to z faktu, że sam środek terapeutyczny może wpływać na wzrost włosów. Odnotowaliśmy na przykład, że leczenie tamoksyfenem hamuje odrost włosów, co minimalizuje postrzegany efekt tego środka na wzrost guza w porównaniu z myszami leczonymi placebo.
6. W przypadku komórek MPNST linii ST8-14 myszy mogą być utrzymywane przez 30 dni po przeszczepieniu. W tym czasie guzy zazwyczaj osiągają maksymalny rozmiar dopuszczalny przez instytucjonalne komisje ds. opieki i użytkowania zwierząt, co wymaga uśmiercenia zwierząt. Po ostatniej sesji obrazowania myszy są uśmiercane, a pobierane są próbki niezbędne do dalszej analizy wyników leczenia (np. krew do oznaczenia poziomu krążącego środka terapeutycznego, tkanka guza do oznaczenia masy, badania histologiczne, wyznaczenie indeksów znakowania Ki67 i TUNEL oraz ocena parametrów biochemicznych). Dokładny zestaw pobieranych próbek zależy od założeń projektu eksperymentalnego.
7. Myszy z guzami powinny być monitorowane codziennie i uśmiercane, jeśli zachorują (brak normalnej pielęgnacji i zachowań unikania), nie są w stanie jeść lub pić, lub jeśli guz stanie się zbyt duży, by nie utrudniać normalnego poruszania się ciała. Obciążenie guzem nie może przekroczyć 10% normalnej masy ciała zwierzęcia. Masę guza jako procent masy ciała oblicza się poprzez porównanie masy zwierząt z guzami do masy zwierząt kontrolnych o tym samym wieku i płci. Kacheksja nie może stać się klinicznie istotna. Utrata masy ciała u zwierząt z guzami nie powinna przekroczyć 20% normalnej masy ciała.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 ilustruje typowy progresywny wzrost bioluminescencji obserwowany od 1 do 18 dnia po przeszczepieniu w prawidłowo ustanowionym ksenoprzeszczepie ortotopowym u myszy nagi (NIH III) (A-C). Ilościowa analiza sygnałów bioluminescencji obserwowanych od 1 do 24 dnia po przeszczepieniu wykazuje, że choć sygnały te progresywnie rosną, wzrost guza wyraźnie przyspiesza w późniejszych etapach okresu badania (Rysunek 1D). Aby rzetelnie wykazać, że w myszach z przeszczepem nastąpił wzrost guza, rutynowo pobieramy nerw kulszowy, a jeśli okaże się, że guz przerwał epineurium i nacieka sąsiednie tkanki, pobieramy również otaczające tkanki miękkie i mięśnie szkieletowe. Biorąc pod uwagę agresywny wzrost MPNST, nie jest zaskakujące, że często stwierdzamy, iż przeszczepione komórki nowotworowe przebiły naturalne bariery nerwu i naciekły sąsiednie tkanki (Rysunek 1E). Często obserwujemy również, że przeszczepione komórki MPNST agresywnie migrują do nerwu proksymalnie i dystalnie w stosunku do miejsca przeszczepu.

Rysunek 1. Obrazowanie bioluminescencyjne myszy NIH III z ortotopowym przeszczepem komórek MPNST znakowanych lucyferazą 1 dzień po przeszczepieniu (A). Należy zauważyć, że sygnały wykryte w obszarze zainteresowania (ROI) u różnych myszy różnią się od siebie w zakresie jednego rzędu wielkości. Ponowne obrazowanie w 10. (B) i 18. (C) dniu po przeszczepieniu wykazuje, że sygnały bioluminescencyjne w miejscu przeszczepu u poszczególnych myszy progresywnie rosną. (D) Wykres ilustrujący progresywny wzrost względnej liczby zliczeń fotonów na sekundę wykrytych nad miejscem przeszczepu w dniach 1–24 po przeszczepieniu. (E) Fotomikrograf miejsca przeszczepu u tej myszy, wykazujący wzrost guza i ogniskową inwazję do sąsiedniego mięśnia szkieletowego.

Dyskusja

Szczegółowa metoda ortotopowego ksenoprzeszczepu przedstawiona w niniejszym opracowaniu została opracowana przez nas z wykorzystaniem komórek MPNST linii ST88-14, która jest szeroko stosowana w badaniach nad tymi guzami pochewek nerwów obwodowych związanych z NF1. Metodologia ta jest jednak łatwo dostosowywalna do badań przedklinicznych z wykorzystaniem innych linii komórkowych MPNST. Na przykład, z sukcesem podobnym do tego, który zaobserwowaliśmy w przypadku komórek ST88-14, przeprowadziliśmy ortotopowe ksenoprzeszczepy z wykorzystaniem komórek STS-26T¹⁰, linii pochodzącej ze sporadycznie występującego MPNST, oraz komórek T265-2c¹¹, pochodzących z MPNST związanego z NF1.

Należy jednak zaznaczyć, że dokładne warunki opisane tutaj dla ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek ST88-14 nie mogą zostać bezpośrednio zastosowane do przeszczepiania innych linii MPNST. Zamiast tego, kluczowe parametry metodologii muszą zostać określone empirycznie dla każdej linii komórkowej. Parametry te obejmują liczbę początkowo przeszczepianych komórek MPNST, czas przewidziany na rozwój przeszczepu oraz, w mniejszym stopniu, objętość, w której wstrzykiwane są komórki nowotworowe. Aby ustalić te parametry dla nowej linii, przeszczepiamy grupy myszy (5 myszy na grupę), stosując od 10³ do 5 x 10⁶ komórek nowotworowych, sprawdzając dwa stężenia komórek dla każdego rzędu wielkości (tj. 10³ komórek, 5 x 10³ komórek, 10⁴ komórek, 5 x 10⁴ komórek itd.). Większe liczby komórek nowotworowych (>10⁶) muszą być wstrzykiwane w większej objętości; ustaliliśmy, że można wstrzyknąć do 5 mL bez utraty komórek z przeszczepionego nerwu. Stwierdziliśmy również, że nie można wstrzyknąć więcej niż 5 x 10⁶ komórek nowotworowych w objętości 5 mL, ponieważ gęstsze zawiesiny stają się coraz bardziej podatne na siły ścinania, które zabijają komórki nowotworowe. Obserwujemy te myszy do momentu, gdy co najmniej trzy zwierzęta w każdej grupie będą miały wyczuwalne guzy, po czym uśmiercamy tę grupę i badamy nerw histologicznie w celu potwierdzenia wzrostu przeszczepu. Oczywiście czas wymagany do osiągnięcia tego etapu będzie się różnić w zależności od liczby wstrzykniętych komórek; generalnie dążymy do uzyskania takiego stężenia komórek, które osiągnie maksymalny dopuszczalny wzrost guza w ciągu 30-60 dni. Szybszy wzrost może utrudnić osiągnięcie skutecznych stężeń terapeutycznych przed zakończeniem eksperymentu i/lub uniemożliwić zebranie wystarczającej liczby punktów danych z obrazowania bioluminescencyjnego w trakcie trwania doświadczeń. Przebieg czasowy dłuższy niż 60 dni sprawia, że dostosowywanie parametrów eksperymentalnych staje się uciążliwe i niepotrzebnie przedłuża czas trwania planowanych eksperymentów.

Na koniec odnotujemy, że zastosowaliśmy tę metodologię ortotopowego ksenoprzeszczepu z wykorzystaniem komórek ST88-14 przeszczepionych myszom NIH III w celu wykazania skuteczności terapeutycznej tamoksifenu⁶. Szczegółowy opis metod rutynowo stosowanych do oceny wpływu potencjalnych substancji terapeutycznych na ksenoprzeszczepy ortotopowe znajduje się w tej publikacji. Wykazano również, że komórki neurofibromatu mogą zostać z powodzeniem przeszczepione do nerwu obwodowego¹², co sugeruje, że po wprowadzeniu modyfikacji procedury opisane w niniejszym protokole mogą być wykorzystane do przeprowadzenia badań przedklinicznych z potencjalnymi substancjami terapeutycznymi skierowanymi przeciwko neurofibromatom.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy SCID linii Foxchase (outbred)	Charles River Laboratories	#236
Myszy NIH III	Taconic	#NIHBNX
Myszy NOD-SCIDγ	Jackson Laboratory	#005557
Odczynniki do odrywania komórek (Cell Stripper)	Fisher Scientific	25-056-cl
Klej chirurgiczny Vetbond	3M	1469SB
Strzykawka Hamiltona	Hamilton Co	#80030	objętość 10 μL
Igły do strzykawki Hamiltona	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0,5 cala, PT4 (wykonane na zamówienie)
Kolczyki do uszu	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Maść oftalmiczna	Dechra	NDC 17033-211-38