Wydajna transformacja mchu Physcomitrella patens za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG)

Podsumowanie

Opisana jest prosta i skuteczna metoda przekształcania protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protoplastów Physocmitrella protonemal i transformacji protoplastów mezofilu Arabidopsis ¹.

Streszczenie

Opisana jest prosta i skuteczna metoda przekształcania protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protoplastów Physocmitrella protonemal i transformacji protoplastów mezofilu Arabidopsis ¹. Ze względu na swoją zdolność do ulegania wydajnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, Physcomitrella patens stała się ważnym systemem modelowym w ostatnich latach². Ta zdolność pozwala na wysoką częstotliwość genów docelowych^3-9, co nie jest obserwowane u innych roślin modelowych, takich jak Arabidopsis. Aby w pełni wykorzystać możliwości tego systemu, potrzebujemy skutecznej i łatwej metody dostarczania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami przekształcania tego mchu są bombardowanie cząstkami¹⁰ i wychwyt DNA za pośrednictwem PEG¹¹. Chociaż bombardowanie cząstkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji¹², pistolety genowe nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów, a protokół jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony, transformacja za pośrednictwem PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium ze sterylnym kapturem. Tutaj pokazujemy prostą i bardzo wydajną metodę przekształcania protoplastów mchu. Metoda ta może wygenerować ponad 120 przejściowych transformantów na mikrogram DNA, co stanowi poprawę w stosunku do najbardziej wydajnego protokołu opisanego wcześniej¹³. Ze względu na swoją prostotę, wydajność i powtarzalność, metoda ta może być stosowana w projektach wymagających dużej liczby transformatorów, a także do rutynowych transformacji.

Protokół

1. Wytwarzanie protoplastów

1. Dodaj 9 ml 8% mannitolu do szalki Petriego.
2. Za pomocą szpatułki umieść 7-dniowy mech z 2-3 płytek PPNH4 po 5- na szalce Petriego zawierającej mannitol.
3. Dodaj 3 ml 2% driselazy (Sigma D9515-25G) do szalki Petriego.
4. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę.
5. Przefiltrować zawiesinę protoplastów przez siatkę 100 μm (BD Falcon 352350).
6. Wirować przefiltrowaną zawiesinę o masie 250 g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
7. Ponownie zawiesić protoplasty bardzo delikatnie za pomocą 500 μl 8% mannitolu.
8. Dodaj 9,5 ml 8% mannitolu do probówki hodowlanej. Upewnij się, że protoplasty są całkowicie zawieszone.
9. Powtórzyć kroki filtracji i ponownego zawieszania (1.6, 1.7 i 1.8) jeszcze dwa razy.
10. Pobrać 10 μl roztworu protoplastu i policzyć protoplasty w hemocytometrze.
11. Pomnóż liczbę protoplastów w obszarze 16 kwadratów przez 10 000, aby uzyskać liczbę protoplastów na ml (patrz rysunek 1).

2. Transformacja

1. Wirować zawiesinę protoplastów o masie 250 g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
2. Ponownie zawiesić protoplasty w roztworze MMg w stężeniu 1,6 miliona protoplastów / ml.
3. Inkubować zawiesinę protoplastów w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
4. Dodać 600 μl zawiesiny protoplastów do probówki hodowlanej zawierającej 60 μg DNA. Delikatnie zakręć rurką.
5. Dodać 700 μl roztworu PEG/Ca do mieszaniny protoplast/DNA. Delikatnie obracaj rurką, aż cała mieszanina będzie jednorodna.
6. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
7. W tym okresie oczekiwania przykryj płytki PRM-B celofanem (koła o średnicy 80 mm, A.A. Packaging Limited, Wielka Brytania); pozwól celofanowi nawodnić się na powierzchni płytki przez co najmniej 5 minut.
8. Za pomocą szpatułki usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między celofanem a płytką.
9. Rozcieńczyć mieszaninę 3 ml roztworu W5.
10. Wiruj mieszaninę z prędkością 250 g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
11. Ponownie zawiesić protoplasty w stopionych 2 ml PRM-T (przed dodaniem go do protoplastów roztwór ten można utrzymywać w stanie ciekłym w temperaturze 42°C). Płytka 1 ml ponownie zawieszonych protoplastów na płytce PRM-B pokrytej celofanem. Owiń płytki preparatem Micropore (3M, Health Care). Utrzymuj płytki w temperaturze 25°C w komorze wzrostowej.
12. Alternatywnie, protoplasty można ponownie zawiesić w 1 ml płynnego podłoża galwanicznego i posiać 0,5 ml na płytce PRM-B pokrytej celofanem. Pozwala to na szybszą regenerację, ale liczba regenerujących się roślin jest mniejsza.
13. Komora wzrostowa jest ustawiona na 16-godzinny cykl światła i 8-godzinny cykl ciemny
.
14. Przenieś celofan na świeżą płytkę selekcyjną 4 dni po przemianie.

3. Reprezentatywne wyniki:

Przykład transformacji jest pokazany na rysunku 2. DNA użyte w tym przykładzie było superskręconym plazmidem o wielkości 7,8 kb zawierającym kasetę odporną na higromycynę. Ilość platerowanych protoplastów została zmniejszona do 50% w fotografii. Zdjęcia zostały wykonane dwa tygodnie po przeniesieniu roślin na płyty selekcyjne. Na wydajność przemiany nie ma wpływu stężenie DNA do 60 μg. Wyższe stężenia DNA są szkodliwe dla efektywności przemiany. Dane wykazały, że metoda ta zapewnia spójne wyniki w szerokim zakresie ilości DNA. Metoda ta może również skutecznie generować stabilne transformanty, jak pokazano w tabeli 1; możemy uzyskać około 4 stabilnych transformantów na mikrogram zlinearyzowanego DNA, co jest znacznie wyższe niż to, co zgłaszano wcześniej¹⁴.

Również przetestowaliśmy wpływ szoku cieplnego na efektywność transformacji, przekształcając superskręcony plazmid z genem białka fluorescencyjnego jako markerem. Szok cieplny przeprowadzono 10 minut po inkubacji w temperaturze pokojowej (w ramach kroku 2.6) poprzez inkubację mieszaniny w łaźni wodnej o temperaturze 45°C przez 3 minuty. Mieszaninę inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej bezpośrednio po szoku cieplnym przez 17 minut. Wyniki zarejestrowano 22 godziny po transformacji. Proporcje transformantów otrzymanych z szokiem cieplnym i bez szoku cieplnego były bardzo podobne (~25%), ale zaobserwowaliśmy niekorzystny wpływ szoku cieplnego na żywotność protoplastów (danych nie pokazano).

Rysunek 1. Widok protoplastów w hemocytometrze. Sekcja potrzebna do zliczania protoplastów jest oznaczona czerwonym kwadratem. Zwróć uwagę na 16 kwadratów wymaganych do zliczenia protoplastów (patrz 1.11); obraz pokazuje liczbę 24 protoplastów (240 000 komórek / ml).

Rysunek 2. Zdjęcia 18-dniowych transformatorów przejściowych. Protoplasty poddano transformacji ze wskazaną ilością superskręconego plazmidu. A: 15μg; B: 30μg; Klasa C: 60μg; D: 120μg.

Ilość DNA (μg) Wydajność (tranformanty/μg DNA) 15, superskręcony plazmid Numer katalogowy 120±24 30, superskręcony plazmid Numer katalogowy: 145±54 60, superskręcony plazmid Numer katalogowy 121±60 120, superskręcony plazmid 71±38 60, zlinearyzowany plazmid 4±1

Tabela 1. Wydajność przemian przy różnych ilościach DNA.

Dyskusja

Przedstawiona metoda umożliwia prostą i spójną transformację DNA w protoplasty Physcomitrella patens . Ta metoda została pierwotnie opracowana dla Arabidopsis¹, ale tutaj wykazaliśmy, że dobrze radzi sobie z protoplastami Physcomitrella patens, prostszą i inną rośliną. Dlatego tę metodę można zastosować do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami. Możliwe modyfikacje w celu optymalizacji obejmują stężenie protoplastów w MMg, czas inkubacji w MMg i roztwór PEG/Ca. Zdecydowaliśmy się na użycie 60 μg DNA w naszych rutynowych eksperymentach, ponieważ liczba transformantów rośnie liniowo wraz ze stężeniem DNA do tego momentu (Tabela 1). Udało nam się uzyskać około 7000 transformantów przejściowych lub 200 stabilnych transformantów na pojedynczej transformacji DNA o wielkości 60 μg, co pozwala na dalsze badania przesiewowe i analizy dużej populacji roślin.

Przekształcone protoplasty można rozprowadzać za pomocą płynnego podłoża galwanicznego lub PRM-T. Chociaż wydajność regeneracji jest niższa, gdy stosuje się ciekłe podłoże galwaniczne, wybieramy tę metodę, gdy protoplasty zostały przekształcone za pomocą superskręconych plazmidów. Jak pokazano w tabeli 1, transformacje wykonane za pomocą superskręconego plazmidowego DNA generują znacznie więcej transformantów, a zatem nadal możemy uzyskać dużą liczbę roślin z płynnym podłożem galwanicznym. Co więcej, rozprowadzanie protoplastów za pomocą płynnego podłoża galwanicznego pozwala na szybszą regenerację, co jest ważne w eksperymentach dotyczących przejściowych fenotypów, takich jak eksperymenty z powalaniem RNAi^9,15. Ponadto brak górnego agaru pozwala na łatwą izolację roślin w celu barwienia immunologicznego i RT-PCR^9,15.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PPNH4			1,84 mM KH2PO4 3,4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2,72 mM Winian diamonu 54 μ M FeSO4.7H2O 9.93 μ M H3BO3 1.97 μ M MnCl2.4H2O 0.23 μ M CoCl2.6H2O 0,19 μ M ZnSO4. 7H2O 0,22 μ M CuSO4. 5H2O 0,10 μ M Na2MoO4.2H2O 0.168 μ M KI Dodać 0,7% agaru do podłoża stałego.
PRM-B			PPNH4 z 6% mannitolem i 0,8% agarem. Dodaj 10 ml 1M CaCl2 do 1 l przed rozlaniem płytek.
PRM-T			PPNH4 z 6% mannitolem i 0,6% agarem. Dodaj 0,5 ml 1M CaCl2 do 50 ml przed użyciem.
Płynne podłoże			galwaniczne PPNH4 z 8,5% mannitolem bez agaru. Dodaj 0,5 ml 1M CaCl2 do 50 ml przed użyciem.
2% Ryzalaza			Dodaj 4 g Drriselazy (Sigma D9515-25G) do 200 ml 8% mannitolu. Mieszać delikatnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej, inkubować 30 min. w 4° C i delikatnie mieszać przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wirować 2 500 g przez 10 minut, wyrzucić granulkę. Filtruj za pomocą 0,22 #x03BC; m i przechowywać zamrożone w postaci 10 ml porcji. Przed użyciem rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.
MMg			0,4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5,7)
PEG/Ca			4 g PEG4000 3 mL H2O 2,5 ml 0,8 M mannitol 1 ml 1M CaCl2
W5			154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7)