Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physocmitrella oraz protoplastów mezofilu Arabidopsis1.
Artykuł metodologiczny
Efektywna transformacja mchu Physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (PEG)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella patens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physcomitrella oraz protoplastów mezofylu Arabidopsis1. Dzięki zdolności do efektywnej mitotycznej rekombinacji homologicznej, Physcomitrella patens stała się w ostatnich latach ważnym systemem modelowym2. Zdolność ta umożliwia wysoką częstotliwość celowania w geny3-9, co nie występuje w innych roślinach modelowych, takich jak Arabidopsis. Aby w pełni wykorzystać ten system, potrzebna jest skuteczna i łatwa metoda dostarczania DNA do komórek mchu. Najczęstszymi sposobami transformacji tego mchu są bombardowanie cząsteczkami10 oraz pobieranie DNA za pośrednictwem PEG11. Chociaż bombardowanie cząsteczkami może zapewnić wysoką wydajność transformacji12, pistolety genowe nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów, a protokół ten jest trudny do standaryzacji. Z drugiej strony transformacja za pośrednictwem PEG nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzona w każdym laboratorium wyposażonym w sterylną komorę z laminarnym przepływem powietrza. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą i wysoce wydajną metodę transformacji protoplastów mchu. Metoda ta pozwala na uzyskanie ponad 120 transformantów przejściowych na mikrogram DNA, co stanowi poprawę względem najwydajniejszego protokołu opisanego wcześniej13. Ze względu na prostotę, wydajność i powtarzalność, metoda ta może być stosowana zarówno w projektach wymagających dużej liczby transformantów, jak i w rutynowej transformacji.
Protokół
1. Przygotowanie protoplastów
- Dodaj 9 mL 8% mannitolu do szalki Petriego.
- Używając szpatułki, przenieś 7-dniowy mech z 2-3 płytek PPNH4 o średnicy 5 cm do szalki Petriego zawierającej mannitol.
- Dodaj 3 mL 2% Driselase (Sigma D9515-25G) do szalki Petriego.
- Inkubuj szalkę Petriego w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu przez 1 godzinę.
- Przefiltruj zawiesinę protoplastów przez sito o oczkach 10 μm (BD Falcon 352350).
- Wiruj przefiltrowaną zawiesinę przy 250 g przez 5 minut. Usuń supernatant.
- Resuspenduj protoplasty bardzo delikatnie w 500 μL 8% mannitolu.
- Dodaj 9,5 mL 8% mannitolu do probówki kultury. Upewnij się, że protoplasty są w pełni zawieszone.
- Powtórz etapy filtracji i resuspensji (1.6, 1.7 i 1.8) jeszcze dwa razy.
- Pobierz 10 μL roztworu protoplastów i policz protoplasty w komorze countingowej (hemocytometrze).
- Pomnóż liczbę protoplastów w obszarze 16 kwadratów przez 10 0, aby uzyskać liczbę protoplastów na mL (patrz Rysunek 1).
2. Transformacja
- Centryfuguj zawiesinę protoplastów przy 250 g przez 5 minut. Usuń nadsącz.
- Resuspenduj protoplasty w roztworze MMg do stężenia 1,6 miliona protoplastów / mL.
- Inkubuj zawiesinę protoplastów w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Dodaj 60 μL zawiesiny protoplastów do probówki hodowlanej zawierającej 60 μg DNA. Delikatnie zamieszaj probówkę ruchem wirowym.
- Dodaj 70 μL roztworu PEG/Ca do mieszaniny protoplastów i DNA. Delikatnie zamieszaj probówkę ruchem wirowym, aż cała mieszanina stanie się jednorodna.
- Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- W czasie oczekiwania pokryj płytki PRM-B celofanem (krążki o średnicy 80 mm, A.A. Packaging Limited, UK); pozwól celofanowi nawodnić się na powierzchni płytki przez co najmniej 5 min.
- Za pomocą szpatułki usuń pęcherzyki powietrza uwięzione między celofanem a płytką.
- Rozcieńcz mieszaninę 3 mL roztworu W5.
- Centryfuguj mieszaninę przy 250 g przez 5 minut. Usuń nadsącz.
- Resuspenduj protoplasty w 2 mL roztopionego PRM-T (przed dodaniem do protoplastów roztwór ten można utrzymać w stanie ciekłym w temperaturze 42°C). Wysiej 1 mL resuspendowanych protoplastów na każdą płytkę PRM-B pokrytą celofanem. Owiń płytki taśmą Micropore (3M, Health Care). Przechowuj płytki w temperaturze 25°C w komorze wzrostowej.
- Alternatywnie protoplasty można resuspendować w 1 mL ciekłej pożywki do wysiewu i wysiać 0,5 mL na płytkę PRM-B pokrytą celofanem. Pozwala to na szybszą regenerację, jednak liczba regenerujących się roślin jest mniejsza.
- Komora wzrostowa jest ustawiona na cykl 16 godz. światła i 8 godz. ciemności.
- Przenieś celofan na świeżą płytkę selekcyjną 4 dni po transformacji.
3. Reprezentatywne wyniki:
Przykład transformacji przedstawiono na Rysunku 2. DNA wykorzystane w tym przykładzie stanowił superzwinięty plazmid o rozmiarze 7,8 kb zawierający kasetę oporności na hygromycynę. Ilość wysianych protoplastów została zredukowana do 50% na potrzeby dokumentacji fotograficznej. Zdjęcia wykonano dwa tygodnie po przeniesieniu roślin na podłoża selekcyjne. Wydajność transformacji nie zmienia się przy stężeniach DNA do 60 μg. Wyższe stężenia DNA pogarszają wydajność transformacji. Dane wykazały, że metoda ta zapewnia powtarzalne wyniki w szerokim zakresie ilości DNA. Metoda ta pozwala również na skuteczne generowanie stabilnych transformantów, co przedstawiono w Tabeli 1; uzyskano około 4 stabilnych transformantów na mikrogram linearyzowanego DNA, co jest wynikiem znacznie wyższym niż raportowano wcześniej14.
Przetestowaliśmy również wpływ szoku termicznego na wydajność transformacji, przeprowadzając transformację superzwiniętym plazmidem zawierającym gen białka fluorescencyjnego jako marker. Szok termiczny wykonano 10 minut po inkubacji w temperaturze pokojowej (w ramach kroku 2.6), inkubując mieszaninę w kąpieli wodnej o temperaturze 45°C przez 3 minuty. Bezpośrednio po szoku termicznym mieszaninę inkubowano w kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej przez 17 min. Wyniki zapisano 2 godziny po transformacji. Stosunki liczby transformantów uzyskanych z zastosowaniem i bez zastosowania szoku termicznego były bardzo podobne (~25%), jednak zaobserwowaliśmy niekorzystny wpływ szoku termicznego na żywotność protoplastów (dane nie przedstawiono).
Rysunek 1. Widok protoplastów w komorze countingowej. Sekcja niezbędna do liczenia protoplastów jest zaznaczona czerwonym kwadratem. Należy zwrócić uwagę na 16 kwadratów wymaganych do liczenia protoplastów (patrz pkt 1.1); na obrazie widoczna jest liczba 24 protoplastów (240 00 komórek/ml).
Rysunek 2. Zdjęcia 18-dniowych transformantów przejściowych. Protoplasty poddano transformacji wskazaną ilością superzwiniętego plazmidu. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.
| Ilość DNA (μg) | Wydajność (transformanty/μg DNA) |
| 15, superzwinięty plazmid | 120±24 |
| 30, superzwinięty plazmid | 145±54 |
| 60, superzwinięty plazmid | 121±60 |
| 120, superzwinięty plazmid | 71±38 |
| 60, zlinearyzowany plazmid | 4±1 |
Tabela 1. Wydajność transformacji przy różnych ilościach DNA.
Dyskusja
Metoda przedstawiona w niniejszej pracy umożliwia prostą i powtarzalną transformację DNA do protoplastów Physcomitrella patens. Metoda ta została pierwotnie opracowana dla Arabidopsis1, jednak tutaj wykazaliśmy, że sprawdza się ona w przypadku protoplastów Physcomitrella patens, czyli rośliny prostszej i odmiennej. W związku z tym metodę tę można zastosować do innych gatunków roślin po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Możliwe modyfikacje w celu optymalizacji obejmują stężenie protoplastów w MMg, czas inkubacji w MMg oraz w roztworze PEG/Ca. W rutynowych eksperymentach zdecydowaliśmy się na użycie 60 μg DNA, ponieważ liczba transformantów rośnie liniowo wraz ze stężeniem DNA aż do tego poziomu (Tabela 1). Dzięki jednej transformacji z użyciem 60 μg DNA uzyskaliśmy około 7000 transformantów przejściowych lub 200 transformantów stabilnych, co pozwala na dalszy screening i analizę dużej populacji roślin.
Przekształcone protoplasty można rozsiać w płynnej pożywce do platerowania lub PRM-T. Choć wydajność regeneracji jest niższa przy zastosowaniu płynnej pożywki do platerowania, wybieramy tę metodę w przypadku przekształcania protoplastów za pomocą superzwiniętych plazmidów. Jak pokazano w Tabeli 1, transformacje przeprowadzone z użyciem superzwiniętego DNA plazmidowego generują znacznie więcej transformantów, dzięki czemu nadal możemy uzyskać dużą liczbę roślin przy zastosowaniu płynnej pożywki. Ponadto rozsiewanie protoplastów w płynnej pożywce umożliwia szybszą regenerację, co jest istotne w eksperymentach obejmujących fenotypy przejściowe, takich jak doświadczenia z wyciszaniem genów RNAi9,15. Dodatkowo brak agaru powierzchniowego ułatwia izolację roślin do immunobarwienia i RT-PCR9,15.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
L.V. jest wspierany przez NSF (IOS 1002837)
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PPNH4 | 1,84 mM KH2PO42PO4 3,4 mM Ca(NO₃)₂3)2 1 mM MgSO₄4 2,72 mM tartrynianu diamonu 54 μM FeSO₄4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl22.4H2O 0.23 μM CoCl22.6H2O 0.19 μM ZnSO447 h2O 0.22 μM CuSO₄45h2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Do pożywki stałej dodać 0,7% agaru. | ||
| PRM-B | PPNH4 z 6% mannitolem i 0,8% agarem. Dodać 10 ml 1M CaCl22 do 1 l przed wylaniem płyt. | ||
| PRM-T | PPNH4 z 6% mannitolem i 0,6% agarem. Dodać 0,5 ml 1M CaCl22 do 50 ml przed użyciem. | ||
| Krajowe podłoże płynne | PPNH4 z 8,5% mannitolem bez agaru. Dodać 0,5 ml 1M CaCl22 do 50 ml przed użyciem. | ||
| 2% Driselase | Do 200 ml 8% mannitolu dodać 4 g Driselase (Sigma D9515-25G). Mieszać delikatnie przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C.°C i delikatnie mieszaj przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wirować przy 2 500 g przez 10 min, a następnie odrzucić osad. Przefiltrować przez filtr 0,22 μm, a następnie przechowywać w zamrożonych aliquotach po 10 ml. Przed użyciem rozmrozić w kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej. | ||
| MMg | 0,4 M mannitolu 15 mM MgCl22 4 mM MES (pH 5,7) | ||
| PEG/Ca2+ | 4 g PEG4000 3 ml H2O2O 2,5 ml 0,8 M mannitolu 1 ml 1M CaCl22 | ||
| W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl22 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) |
Bibliografia
- Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
- Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
- Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
- Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
- Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
- Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
- Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
- Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
- Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
- Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
- Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
- Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
- Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).
Przedruki i uprawnienia
