Artykuł metodologiczny

Zapisy EEG o dużej gęstości swobodnie poruszających się myszy przy użyciu mikroelektrody na bazie poliimidu

DOI:

10.3791/2562

⸱

11 stycznia 2011

 ,  ,  ,  , 
1Center for Neural Science , Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2Department of Neuroscience, University of Science and Technology, 3Fab Service Department, Korea Advanced Nano Fab Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisaliśmy procedurę chirurgiczną i wskazówki dotyczące wszczepienia ultracienkiej matrycy mikroelektrod na bazie poliimidu (PBM-array) na czaszce myszy w celu uzyskania encefalografii o dużej gęstości (EEG) w modelu mysim.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroencefalogram (EEG) wskazuje uśrednioną aktywność elektryczną populacji neuronów na dużą skalę. Jest szeroko stosowany jako nieinwazyjne narzędzie do monitorowania mózgu w neuronauce poznawczej, a także jako narzędzie diagnostyczne dla padaczki i zaburzeń snu w neurologii. Jednak mechanizm leżący u podstaw generowania rytmu EEG jest nadal pod zasłoną. Niedawno wprowadzona mikroelektroda na bazie poliimidu (macierz PBM) do wysokiej rozdzielczości mysiego EEG1 jest jednym z badań mających na celu udzielenie odpowiedzi na pytania neurofizjologiczne dotyczące sygnałów EEG w oparciu o bogaty zasób genetyczny, który zawiera model mysi do analizy złożonego procesu generowania EEG. To zastosowanie nanofabrykowanej macierzy PBM do czaszki myszy jest skutecznym narzędziem do zbierania aktywności mózgu na dużą skalę myszy transgenicznych i umożliwia identyfikację neuronalnych korelatów z pewnymi rytmami EEG w połączeniu z zachowaniem. Jednak jego ultracienka grubość i rozwidlona struktura powodują problemy w obsłudze i implantacji macierzy PBM. W prezentowanym filmie opisano krok po kroku etapy przygotowania i zabiegu wszczepienia matrycy PBM w czaszkę myszy. Dostępne są również wskazówki dotyczące obsługi i operacji, które pomogą naukowcom odnieść sukces w implantacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Podsumowanie

C57BL/6J - 129S4/SvJae hybrydowe myszy (12~15 tygodni) są znieczulane koktajlem ketaminy (120 mg/kg i.p.) i ksylazyny (6 mg/kg, i.p.). Szczypanie ogona lub palców u nóg poprzedza operację w celu sprawdzenia głębokości znieczulenia. Mysz jest ustalana za pomocą aparatu stereotaktycznego (David Kopf Instruments, Model 902, Kalifornia, USA). Skóra głowy jest nacinana na linii środkowej około 25 mm, aby odsłonić czaszkę pod leczeniem lidokainą w celu zmniejszenia bólu. Wszelkie zanieczyszczenia na czaszce są wycierane bawełnianymi końcówkami nasączonymi solą fizjologiczną, aby zwiększyć przyczepność elektrody do czaszki. Punkty bregma i lambda są oznaczone i ustawione w tej samej płaszczyźnie poziomej. Układ mikroelektrod na bazie poliimidu (macierz PBM) jest umieszczony w taki sposób, aby jego pionowa linia środkowa stykała się z linią środkową czaszki. Punkt bregma powinien znajdować się w środku 5warstwy przedniej części macierzy PBM. Dwie lub trzy mikrośruby są używane w przestrzeni zerowej na krawędzi czaszki, aby pomóc zabezpieczyć pozycję elektrody za pomocą cementu dentystycznego. Aby podeprzeć łącznik PBM-array, umieszczamy rozpórkę na środku głowicy i pokrywamy ją cementem dentystycznym. Po utwardzeniu naciętą skórę zszywa się i daje się co najmniej 5 dni na rekonwalescencję. Podczas rekonwalescencji myszy są trzymane w indywidualnych klatkach ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Po rekonwalescencji wykonywany jest zapis EEG. Procedury opieki nad zwierzętami, chirurgiczne i rejestrowania były zgodne z wytycznymi dla Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania, zgodnie z ustawą z 1992 r. o przepisach dotyczących opieki nad zwierzętami w Korea Lab i powiązanymi wytycznymi. Tablice PBM w tym manuskrypcie zostały sfabrykowane tak, jak opisał to Choi. Et. al.1 Prosimy o kontakt z autorami w celu użycia tej samej tablicy PBM w filmie.

2. Procedura

  1. Przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne i aparaturę stereotaktyczną.
  2. Znieczulić mysz środkiem znieczulającym (np. ketamina/ksylazyna w dawce 120 i 60 mg/kg i.p., odpowiednio). Szczypanie ogona lub palców u nóg poprzedza operację w celu sprawdzenia głębokości znieczulenia.
  3. Zamontuj mysz na aparacie stereotaktycznym, umieszczając paski douszne w przewodzie słuchowym myszy i dokręcając je na miejscu. Oczy można pokryć biokompatybilną galaretką (np. wazeliną), aby zapobiec wysuszeniu oczu przez światło zabiegowe. Po nawilżeniu głowy myszy 70% etanolem, zgol sierść z jej głowy.
  4. Naciąć głowę na około 25 mm skórą głowy. Zaleca się nałożenie niewielkiej ilości 2% chlorowodorku lidokainy pod skórę głowy. Ściśnij skórę za pomocą mikroklamer (Fine Science Tools (USA), Inc., 18052-03, Kalifornia, USA), aby nacięcie było szeroko otwarte.
  5. Wytrzyj wszelkie pozostałe resztki tkanki na czaszce wacikami nasączonymi solą fizjologiczną, aby zwiększyć przyleganie matrycy PBM do czaszki. Skuteczne jest również użycie nadtlenku do usunięcia pozostałości membrany.
  6. Znajdź punkty bregma i lambda na czaszce i zaznacz je markerem na bazie oleju. Umieść tablicę PBM tak, aby jej pionowa linia środkowa stykała się z linią środkową czaszki, jak pokazano na rysunku 1. Umieść bregmę na środku 5warstwy przedniej części macierzy PBM z jedną kroplą wody z kranu. Ostrożnie przetrzyj elektrodę foliową od przyśrodkowej do bocznej, aby uzyskać lepsze przyleganie. Aby elektroda filmowa mocniej przylegała do czaszki, elektroda filmowa powinna być całkowicie sucha na czaszce. Elektroda filmowa pozostaje do zamocowania na czaszce za pomocą siły van der Waalsa. Podczas zmiany położenia elektrody potrzebna jest kolejna kropla wody z kranu, aby zapobiec rozerwaniu elektrody.
    figure-protocol-1
    Rysunek 1. (Po lewej) Tablica PBM na czaszce myszy. Oś przednio-tylna macierzy PBM pokrywa się z linią między bregmą (BP) a punktami lambda (LP). (Po prawej) Przypuszczalna elektroda znajduje się na powierzchni mózgu myszy. Anatomia myszy jest segmentowana z bazy danych cyfrowego atlasu 3-D MRI mózgu dorosłej myszy C57BL/6J wyprodukowanego w Brookhaven National Lab, a lokalizacje elektrod są oznaczone zgodnie z pomiarem stereotaktycznym. Elektrody masowe (G) i referencyjne (Ref) są oznaczone na prawym rysunku.
  7. Zaznacz co najmniej trzy pozycje na otwartej przestrzeni czaszki, a następnie wykonaj otwory w tych miejscach za pomocą wiertła dentystycznego do pozycjonowania podtrzymujących mikrośrub. Te mikrośruby pełnią rolę kłonicy i mechanicznie podtrzymują cement dentystyczny na czaszce. Podczas wiercenia należy zachować szczególną ostrożność. Ponieważ czaszka myszy składa się z cienkich warstw, podczas wiercenia może łatwo dojść do krwotoku. Gdy dojdzie do krwawienia, przerwij wiercenie i nałóż niewielką ilość proszku hemostatycznego do otworu.
  8. Nałóż dentystyczny cement akrylowy (Vertex-Dental, Vertex Self-Curing, Holandia), aby pokryć matrycę PBM, kotwiące i resztę czaszki. Przygotuj cement dentystyczny w stanie lepkim i lepkim.
  9. Umieść sztywny kij jako rozpórkę na środku głowy za pomocą mocnego kleju (na przykład Loctite, Henkel Loctite Corp, Dublin, Irlandia). Umieść dwustronną taśmę klejącą z tyłu płaszczyzny łącznika. Manipuluj położeniem złącza matrycy PBM, aby połączyć się z końcówką rozpórki. Odległość pionowa między czaszką a łącznikiem powinna być większa niż 5 mm. Przyklej płaszczyznę łącznika i końcówkę kija za pomocą mocnego kleju, aby uzyskać lepszą przyczepność.
  10. Upewnij się, że cement dentystyczny jest całkowicie utwardzony. Następnie nałóż dentystyczny cement akrylowy na czaszkę i tylną stronę płaszczyzny łącznika, aby przymocować łącznik do czaszki.
  11. Usuń mikro zaciski. Zszyj naciętą skórę wysterylizowanym włóknem szwowym. Wyjmij mysz z urządzenia. Możesz nałożyć dodatkowy dentystyczny cement akrylowy, aby osłonić odsłoniętą czaszkę. Nałóż antybiotyk (maść fucidin, Dong Wha Pharmacy, Korea Południowa) na cement i zszytą skórę.
  12. Umieść mysz w wysterylizowanej klatce, aż odzyska swoją pierwotną masę ciała (około 5 do 7 dni). Zaleca się, aby nie wprowadzać żadnych elementów klatkowych.
  13. Po odzyskaniu podłącz mysz za pomocą lekkiego złącza płytki drukowanej (PCB) do wlewu wielokanałowego systemu wzmacniacza EEG (Synamps2, Karolina Północna, USA) we własnej klatce. Przewody łączące należy traktować ostrożnie, aby się nie zaplątały.
  14. Po 1 godzinie od przyzwyczajenia należy wykonać zapis EEG. Skanowanie 4.4. W tym eksperymencie wykorzystano oprogramowanie do akwizycji (Karolina Północna, USA). Typowy zestaw śladów czasowych EEG myszy pokazano na rysunku 2. Zaleca się zarejestrowanie filmu w celu powiązania zachowania myszy.
  15. Uzyskany sygnał może być analizowany przez MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) w celu stworzenia topograficznej mapy mózgu. Przykładowe topografie mapy mocy EEG mózgu myszy przedstawiono na rysunku 3.

3. Reprezentatywne wyniki

Jeśli powyższe zabiegi chirurgiczne zostaną przeprowadzone prawidłowo, 40-kanałowy zapis EEG myszy zostanie pomyślnie przeprowadzony bez uszkodzonych kanałów. Poniższe rysunki przedstawiają reprezentatywne surowe ślady EEG i mapy topograficzne.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Ślad próbki EEG, w którym występuje napad braku wywołany wstrzyknięciem γ-butyrolaktonu (GBL, 50 mg/kg, i.p.). Czerwony pasek wskazuje falę skokową i wyładowania (SWD) podczas napadu nieobecności. Osie pozioma i pionowa wskazują odpowiednio czas i napięcie. Numer jest zgodny z montażem kanału zdefiniowanym na rysunku. 1 (po prawej).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Mapy topograficzne wskazują rozkład mocy 2-6 Hz. Wartość na pasku kolorów reprezentuje skalę kolorów mapy Power Map. Podczas fal skokowych i wyładowań (SWD) indukowanych przez γ-butyrolakton (GBL, 50 mg/kg, i.p.) moc w dużych obszarach kory czołowo-ciemieniowej znacznie wzrasta w porównaniu z mocą przed wstrzyknięciem GBL (wartość wyjściowa).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy zabiegi chirurgiczne i rejestracyjne w celu uzyskania EEG o dużej gęstości u swobodnie poruszających się myszy. Metoda ta umożliwia nam uzyskanie funkcjonalnych map mózgu z modelu mysiego w celu zbadania mechanizmów molekularnych spontanicznychrytmicznych 1,2 lub aktywności mózgu związanych ze zdarzeniami.

Akwizycja wszystkich kanałów w macierzy PBM jest warunkiem koniecznym do uzyskania mapowania całego mózgu, jednak nawiązanie bezpiecznego kontaktu dla każdego kanału jest bardzo trudne. Aby utrzymać stały kontakt kanału z czaszką, ważne są następujące procedury. Po pierwsze, wszelkie szczątki tkanki na czaszce mogą oddzielić elektrodę od czaszki. Dlatego bardzo ważne jest, aby usunąć wszystkie resztki tkanek za pomocą wysterylizowanych wacików i wysuszyć powierzchnię czaszki. Po drugie, zdolność matrycy PBM, która może przyklejać się do powierzchni czaszki, to siła van der Waalsa. Sugeruje się nałożenie kropli wody z kranu na czaszkę, aby zbudować warstwę wody przed nałożeniem matrycy PBM na czaszkę. Po trzecie, bardzo ważna jest odpowiednia lepkość cementu dentystycznego. Jeśli jest zbyt rzadki, może utworzyć warstwę izolacyjną pod matrycą PBM. Jeśli jest zbyt gęsty, cement dentystyczny łatwo rozpadnie się od czaszki pod wpływem własnego ciężaru. Na koniec należy wszczepić co najmniej trzy mikrośruby podtrzymujące, aby cement dentystyczny był ściśle związany z czaszką. Mikrośruby podtrzymujące podtrzymują cement dentystyczny i zabezpieczają scenę główną, co jest niezbędne do długotrwałych badań.

Zastosowanie macierzy PBM będzie ograniczone do przewlekłych badań na dorosłych myszach ze względu na jej rozmiar i wagę. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy cięższe niż 25 g są odpowiednie do użycia. W ramach dalszych zastosowań, poprzez przestrzeń zerową między gałęziami w naszej matrycy PBM, można wprowadzić elektrody wtórne do celów rejestracji lub stymulacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez KIST Grant (2E21510), program National Honor Scientist Ministerstwa Edukacji, oraz Original Technology Research Program for Brain Science przez National Research Foundation of Korea finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (2010-0018944).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
γ butyrolaktonSigma-AldrichH7629-500G

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
  2. Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polyimide MicroelectrodeMouse EEG RecordingStereotaxic SurgeryEEG Data AnalysisBrain Activity MonitoringNeural Correlates IdentificationTransgenic Mouse ModelOffline EEG AnalysisEEG Rhythm Generation

Powiązane artykuły