W niniejszym artykule opisano procedurę chirurgiczną oraz wskazówki dotyczące obsługi związane z implantacją ultrasciennej macierzy mikroelektrod na bazie poliimidu (PBM-array) na czaszkę myszy w celu rejestracji wysokiej gęstości encefalografii (EEG) w modelu mysim.
Artykuł metodologiczny
Rejestracja EEG o wysokiej gęstości u swobodnie poruszających się myszy z wykorzystaniem mikroelektrod na bazie poliamidu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektroencefalogram (EEG) wskazuje uśrednioną aktywność elektryczną populacji neuronalnych na poziomie wielkoskalowym. Jest on powszechnie wykorzystywany w neuronauce poznawczej jako nieinwazyjne narzędzie do monitorowania mózgu, a w neurologii jako narzędzie diagnostyczne w przypadku epilepsji i zaburzeń snu. Jednakże mechanizm leżący u podstaw generowania rytmów EEG pozostaje wciąż nieznany. Niedawno wprowadzona macierz mikroelektrod polimidowych (PBM-array) do wysokorozdzielczego EEG myszy1 jest jedną z prób odpowiedzi na pytania neurofizjologiczne dotyczące sygnałów EEG, opierającą się na bogatych zasobach genetycznych modelu mysiego służących do analizy złożonego procesu generowania EEG. Zastosowanie nanostrukturalnej macierzy PBM-array do czaszki myszy stanowi wydajne narzędzie do gromadzenia danych o wielkoskalowej aktywności mózgu myszy transgenicznych i umożliwia identyfikację neuronalnych korelatów określonych rytmów EEG w powiązaniu z zachowaniem. Jednakże jej ultra-cienka grubość i rozwidlona struktura powodują trudności w obchodzeniu się z macierzą PBM-array oraz jej implantacji. W przedstawionym filmie krok po kroku opisano etapy przygotowania i operacji implantacji macierzy PBM-array w czaszce myszy. Podano również wskazówki dotyczące manipulacji i chirurgii, które pomogą badaczom w pomyślnej implantacji.
Protokół
1. Podsumowanie
Myszy hybrydowe C57BL/6J - 129S4/SvJae (w wieku 12~15 tygodni) są znieczulane koktajlem ketaminy (120 mg/kg i.p.) i ksylazyny (6 mg/kg, i.p.). Przed operacją wykonuje się ucisk ogona lub palca, aby sprawdzić głębokość znieczulenia. Mysz jest unieruchomiona w aparacie stereotaktycznym (David Kopf Instruments, Model 902, Calif, USA). Skóra głowy jest nacinana w linii środkowej na długości około 25 mm, aby odsłonić czaszkę, przy zastosowaniu lidokainy w celu zmniejszenia bólu. Wszelkie zanieczyszczenia na czaszce są usuwane za pomocą nasączonych solą fizjologiczną patyczków bawełnianych, aby zwiększyć przyleganie elektrody do czaszki. Punkty bregma i lambda są zaznaczane i ustawiane w tej samej płaszczyźnie poziomej. Matryca mikroelektrod oparta na poliimidzie (PBM-array) jest pozycjonowana tak, aby jej pionowa linia środkowa pokrywała się z linią środkową czaszki. Punkt bregma powinien znajdować się na środku 5th warstwy przedniej PBM-array. Dwie lub trzy mikosruby są umieszczane w wolnej przestrzeni na krawędzi czaszki, aby pomóc w zabezpieczeniu pozycji elektrody za pomocą cementu stomatologicznego. Aby podeprzeć złącze PBM-array, umieszczamy wspornik na środku głowy i pokrywamy go cementem stomatologicznym. Po utwardzeniu nacięta skóra jest zszywana, a na rekonwalescencję przeznacza się co najmniej 5 dni. Podczas rekonwalescencji myszy są utrzymywane w oddzielnych klatkach z wolnym dostępem do pokarmu i wody. Po rekonwalescencji wykonuje się zapis EEG. Opieka nad zwierzętami, procedury chirurgiczne i rejestracyjne były zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt, zgodnie z ustawą 1992 koreańskich przepisów dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi oraz powiązanymi wytycznymi. Matryce PBM-array w niniejszym piśmie zostały wykonane zgodnie z opisem Choi. et. al.1 W celu użycia tej samej matrycy PBM-array przedstawionej w filmie należy skontaktować się z autorami.
2. Procedura
- Przygotować wysterylizowane narzędzia chirurgiczne oraz aparat stereotaktyczny.
- Zanestezjować mysz środkiem znieczulającym (np. ketaminą/ksylazyną w dawkach odpowiednio 120 i 60 mg/kg i.p.). Przed operacją należy przeprowadzić test uszczypnięcia ogona lub palca, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
- Zamocować mysz w aparacie stereotaktycznym, umieszczając pręty uszne w kanałach słuchowych myszy i dokręcając je. Oczy można pokryć biozgodnym żelem (np. wazeliną), aby zapobiec ich wysychaniu pod wpływem światła operacyjnego. Po zwilżeniu głowy myszy 70% etanolem, ogolić futro z głowy.
- Naciąć skórę głowy na długości około 25 mm za pomocą skalpela. Zaleca się podanie niewielkiej ilości 2% chlorowodorku lidokainy pod skórę. Odciągnąć skórę za pomocą mikroklem (Fine Science Tools (USA), Inc., 18052-03, Calif, USA), aby utrzymać nacięcie szeroko otwarte.
- Przetrzeć wszelkie pozostałości tkankowe na czaszce za pomocą watników nasączonych solą fizjologiczną, aby zwiększyć przyczepność macierzy PBM do czaszki. Skuteczne jest również użycie nadtlenku do usunięcia resztek opon mózgowych.
- Zlokalizować punkty bregma i lambda na czaszce i zaznaczyć je markerem na bazie oleju. Umieścić macierz PBM tak, aby jej pionowa linia środkowa pokrywała się z linią środkową czaszki, jak pokazano na Rysunku 1. Za pomocą jednej kropli wody z kranu ustawić punkt bregma na środku 5th warstwy przedniej części macierzy PBM. Ostrożnie przetrzeć elektrodę foliową od strony przyśrodkowej do bocznej, aby zapewnić lepszą adhezję. Aby elektroda foliowa mocniej przylegała do czaszki, powinna być na niej całkowicie sucha. Elektroda foliowa pozostaje przymocowana do czaszki dzięki siłom van der Waalsa. Przy ponownym pozycjonowaniu elektrody konieczna jest kolejna kropla wody z kranu, aby zapobiec rozerwaniu elektrody.
Rysunek 1. (Lewo) Macierz PBM na czaszce myszy. Oś przednio-tylna macierzy PBM pokrywa się z linią między punktami bregma (BP) i lambda (LP). (Prawo) Przewidywane położenia elektrod na powierzchni mózgu myszy. Anatomia myszy została wysegmentowana z bazy cyfrowego atlasu MRI 3D mózgu dorosłej myszy C57BL/6J stworzonej w Brookhaven national lab, a lokalizacje elektrod zaznaczono zgodnie z pomiarami stereotaktycznymi. Na prawym rysunku zaznaczono elektrody masy (G) i referencyjne (Ref). - Zaznaczyć co najmniej trzy pozycje na odsłoniętym obszarze czaszki, a następnie wywiercić w tych miejscach otwory za pomocą wiertła stomatologicznego w celu umieszczenia wspierających mikowkrętów. Mikowkręty te pełnią rolę podpór i mechanicznie stabilizują cement stomatologiczny na czaszce. Podczas wiercenia należy zachować szczególną ostrożność. Ponieważ czaszka myszy składa się z cienkich warstw, podczas wiercenia może łatwo dojść do krwotoku. W przypadku wystąpienia krwawienia należy przerwać wiercenie i wprowadzić do otworu niewielką ilość proszku hemostatycznego.
- Nanieść akrylowy cement stomatologiczny (Vertex-Dental, Vertex Self-Curing, Holandia), aby pokryć macierz PBM, wkręty mocujące i resztę czaszki. Cement stomatologiczny należy przygotować do konsystencji kleistej i lepkej.
- Przymocować sztywny pręt jako wspornik na środku głowy za pomocą mocnego kleju (na przykład Loctite, Henkel Loctite Corp, Dublin, Irlandia). Nakleić dwustronną taśmę klejącą na tylnej stronie płaszczyzny złącza. Ustawić złącze macierzy PBM tak, aby połączyło się z końcówką wspornika. Odległość pionowa między czaszką a złączem powinna wynosić ponad 5 mm. Przykleić płaszczyznę złącza do końcówki pręta za pomocą mocnego kleju dla lepszej adhezji.
- Upewnić się, że cement stomatologiczny jest całkowicie utwardzony. Następnie nanieść akrylowy cement stomatologiczny na czaszkę i tylną stronę płaszczyzny złącza, aby trwale przymocować złącze do czaszki.
- Usunąć mikroklem. Zaszyć naciętą skórę za pomocą wysterylizowanej nici chirurgicznej. Wyjąć mysz z aparatu. Można nanieść dodatkową warstwę akrylowego cementu stomatologicznego, aby osłonić odsłoniętą czaszkę. Nałożyć antybiotyk (maść fucydyna, Dong Wha Pharmacy, Korea Południowa) wokół cementu i zaszytej skóry.
- Umieścić mysz w wysterylizowanej klatce do czasu powrotu do pierwotnej masy ciała (około 5 do 7 dni). Zaleca się, aby nie wprowadzać do klatki innych osobników.
- Po rekonwalescencji połączyć mysz za pomocą lekkiego złącza na płytce drukowanej (PCB) z headboxem wielokanałowego systemu wzmacniacza EEG (Synamps2, Karolina Północna, USA) w jej własnej klatce. Przewody połączeniowe należy traktować ostrożnie, aby nie uległy splątaniu.
- Po 1 godzinie habituacji przeprowadzić rejestrację EEG. W tym eksperymencie użyto oprogramowania akwizycyjnego Scan 4.4 (Karolina Północna, USA). Typowy zestaw przebiegów czasowych EEG myszy przedstawiono na Rysunku 2. Zaleca się rejestrację wideo w celu powiązania wyników z zachowaniem myszy.
- Uzyskany sygnał można analizować za pomocą programu MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) w celu stworzenia topograficznej mapy mózgu. Przykładowe topografie mapy mocy EEG mózgu myszy przedstawiono na Rysunku 3.
3. Reprezentatywne wyniki
Jeśli powyższe procedury chirurgiczne zostaną przeprowadzone prawidłowo, rejestracja EEG myszy z 40 kanałami zostanie pomyślnie wykonana bez wystąpienia kanałów uszkodzonych. Poniższe rysunki przedstawiają reprezentatywne surowe zapisy EEG oraz mapy topograficzne.
Rysunek 2. Przykładowy zapis EEG podczas napadu nieobecności wywołanego wstrzyknięciem γ-butyrolaktonu (GBL, 50mg/kg, i.p.). Czerwony pasek wskazuje kompleksy iglica-fala i wyładowania (SWDs) podczas napadu nieobecności. Oś pozioma i pionowa wskazują odpowiednio czas i napięcie. Numeracja odpowiada montażowi kanałów zdefiniowanemu na Rysunku 1 (po prawej).
Rysunek 3. Mapy topograficzne przedstawiają rozkład mocy w zakresie 2-6 Hz. Wartość na pasku kolorów reprezentuje skalę kolorystyczną mapy mocy. Podczas wyładowań typu iglica-fala (SWDs) wywołanych przez γ-butyrolakton (GBL, 50mg/kg, i.p.), moc w rozległych korowych obszarach czołowo-ciemieniowych znacząco wzrasta w porównaniu z mocą przed wstrzyknięciem GBL (Baseline).
Dyskusja
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedury chirurgiczne i rejestracyjne służące do pozyskiwania wysokiej gęstości EEG u swobodnie poruszających się myszy. Metoda ta umożliwia uzyskanie funkcjonalnych map mózgu z modelu mysiego w celu zbadania mechanizmów molekularnych spontanicznej aktywności rytmicznej1,2 lub aktywności mózgu związanej z konkretnymi zdarzeniami.
Pozyskanie sygnałów ze wszystkich kanałów w macierzy PBM jest warunkiem koniecznym do uzyskania mapowania całego mózgu, jednak zapewnienie stabilnego kontaktu dla każdego kanału stanowi duże wyzwanie. Aby utrzymać stały kontakt kanałów z czaszką, za istotne uznano następujące procedury. Przede wszystkim wszelkie pozostałości tkanek na czaszce mogą oddzielić elektrodę od kości. Dlatego bardzo ważne jest usunięcie wszystkich resztek tkankowych za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych i osuszenie powierzchni czaszki. Po drugie, zdolność macierzy PBM do przylegania do powierzchni czaszki wynika z oddziaływań van der Waalsa. Sugeruje się nałożenie kropli wody z kranu na czaszkę w celu utworzenia warstwy wodnej przed aplikacją macierzy PBM na czaszkę. Po trzecie, kluczowe jest zachowanie odpowiedniej lepkości cementu dentystycznego. Jeśli będzie on zbyt rzadki, pod macierzą PBM może wytworzyć się warstwa izolacyjna. Jeśli będzie zbyt gęsty, cement dentystyczny łatwo oderwie się od czaszki pod wpływem własnego ciężaru. Na koniec, w czaszce należy osadzić co najmniej trzy wspierające mikowkręty, aby cement dentystyczny ściśle przylegał do kości. Mikowkręty wspierające stabilizują cement dentystyczny i mocują głowicę (headstage), co jest niezbędne w badaniach długoterminowych.
Zastosowanie macierzy PBM będzie ograniczone do badań przewlekłych z udziałem dorosłych myszy ze względu na jej rozmiar i wagę. W oparciu o nasze doświadczenie, do badań nadają się myszy o masie ciała powyżej 25 g. W ramach dalszych zastosowań, przez wolną przestrzeń między ramionami macierzy PBM można wprowadzić dodatkowe elektrody do rejestracji lub stymulacji.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wspierane przez grant KIST (2E21510), program National Honor Scientist Ministerstwa Edukacji oraz Program Badań nad Oryginalnymi Technologiami w Zakresie Nauk o Mózgu realizowany przez Narodową Fundację Badawczą Korei finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (2010-0018944).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| γ-butyrolakton | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
Bibliografia
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
Przedruki i uprawnienia
