Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Podsumowanie

Zastosowanie systemów mikroobjętościowych NanoDrop jako praktycznych i wydajnych alternatyw dla tradycyjnej metodologii oznaczania ilości kwasów nukleinowych opisano poprzez prezentację dwóch protokołów mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych.

Streszczenie

Nieustannie opracowywane są testy biomolekularne wykorzystujące coraz mniejsze ilości materiału, co często wyklucza stosowanie konwencjonalnych instrumentów opartych na kuwetach do oznaczania ilości kwasów nukleinowych na rzecz tych, które umożliwiają pomiary mikroobjętościowe.

System zatrzymywania próbek mikroobjętościowych NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop Products) działa dzięki połączeniu technologii światłowodowej i naturalnych właściwości napięcia powierzchniowego, co pozwala na przechwytywanie i zatrzymywanie niewielkich ilości próbki niezależnie od tradycyjnych urządzeń zawierających, takich jak kuwety czy kapilary. Co więcej, system wykorzystuje krótsze drogi optyczne, co umożliwia pomiar szerokiego zakresu stężeń kwasów nukleinowych, w zasadzie eliminując konieczność przeprowadzania rozcieńczeń. Zmniejszenie objętości próbki wymaganej do analizy spektroskopowej ułatwia również wprowadzenie dodatkowych etapów kontroli jakości w wielu procesach biologii molekularnej, zwiększając wydajność i ostatecznie prowadząc do większej pewności co do wyników analiz końcowych.

Wraz z ostatnimi postępami eksperymentalnymi pojawiła się również potrzeba prowadzenia wysokoczułej analizy fluorescencyjnej dla ograniczonej masy próbki. Dzięki zastosowaniu tej samej technologii zatrzymywania próbek w mikrobioobjętościach, pomiary fluorescencji można przeprowadzać przy użyciu 2 μL materiału, co pozwala na znaczne zmniejszenie wymagań objętościowych dla testów fluorescencyjnych. Takie mikroreakcje o objętości 10 μL lub mniejszej są obecnie możliwe dzięki zastosowaniu specjalistycznego fluorospektrometru do mikroobjętości.

Zaprezentowane zostaną dwa protokoły mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych, wykorzystujące zintegrowane systemy zatrzymywania próbek jako praktyczne alternatywy dla tradycyjnych protokołów opartych na kuwetach. Po pierwsze, opisano bezpośrednią metodę pomiaru absorbancji A260 z użyciem spektrofotometru mikroobjętościowego. Następnie przedstawiono metodę fluorescencyjną, która umożliwia prowadzenie reakcji fluorescencyjnych w zredukowanej objętości przy użyciu fluorospektrometru mikroobjętościowego. Te nowoczesne techniki pozwalają na ocenę stężeń kwasów nukleinowych w zakresie od 1 pg/ μL do 15 000 ng/ μL przy minimalnym zużyciu próbki.

Protokół

1. Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000c

1. W celu rozpoczęcia należy oczyścić górną i dolną powierzchnię optyczną systemu utrzymującego próbkę w spektrofotometrze mikroobjętościowym, pipetując od 2 do 3 μL czystej wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną.
2. Zamknij ramię dźwigni, upewniając się, że górny piedestał styka się z wodą dejonizowaną. Podnieś ramię dźwigni i przetrzyj obie powierzchnie optyczne czystą, suchą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną.
3. Uruchom oprogramowanie NanoDrop i wybierz aplikację Nucleic Acid. Używając skalibrowanego pipetora do małych objętości, wykonaj pomiar tła (blank), nanosząc 1 μL buforu na dolną powierzchnię optyczną. Obniż ramię dźwigni i wybierz opcję „Blank” (Karta pustego pomiaru) w aplikacji Nucleic Acid (Kwasów nukleinowych).
4. Po zakończeniu pomiaru tła należy oczyścić obie powierzchnie optyczne za pomocą czystej, suchej i beztroskiej chusteczki laboratoryjnej.
5. Wybierz odpowiednią stałą dla próbki, która ma zostać zmierzona.
   

   Typ próbki	Wybierz opcję	Stała używana do obliczania stężenia
   dwuniciowe DNA	DNA-50	50
   ssDNA	DNA-33	33
   RNA	RNA-40	40
   Oligonukleotyd	Niestandardowy	15-150

   Tabela 1. Typowe zakresy stężeń kwasów nukleinowych dla bezpośrednich pomiarów absorbancji przy 280 nm z użyciem mikrowolumenowego spektrofotometru NanoDrop, tradycyjnego spektrofotometru z kuwetą przy zastosowaniu mikrokuwety TrayCell oraz mikrowolumenowego fluorospektrometru NanoDrop w połączeniu z testem PicoGreen.
6. Odmiěř 1 μL próbki kwasu nukwinowego na dolny postument optyczny i zamknąć ramię dźwigni. Ponieważ pomiar jest niezależny od objętości, próbka musi jedynie wypełnić przerwę między dwiema powierzchniami optycznymi, aby pomiar mógł zostać wykonany.
7. Wybierz opcję „Measure” (Pomiar) w oprogramowaniu aplikacji. Program automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiarze próbki sprawdź uzyskane widmo.
8. Oprogramowanie automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiarze próbki należy przeanalizować obraz widma w celu oceny jakości próbki.
9. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie miała bardzo charakterystyczny profil.
   
   Rysunek 1. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie charakteryzować się bardzo charakterystycznym profilem.
10. Typowe źródła zanieczyszczeń związanych z konkretnymi technikami izolacji kwasów nukleinowych obejmują ekstrakcję fenolem/Trizolem oraz ekstrakcję kolumnową. W przypadku ekstrakcji fenolem/Trizolem zanieczyszczenie pozostałościami odczynników może być wskazane przez nieprawidłowe widma w zakresie od 220 do 240 nm, a także przez przesunięcia w obszarze od 260 do 280 nm. Z kolei pozostałości guanidyny z ekstrakcji kolumnowej mogą przyczyniać się do powstania piku w pobliżu 230 nm oraz przesunięcia minimum z 230 nm do około 240 nm.
    
    Rysunek 2. Przesunięcia maksimów i minimów w próbkach B i C w porównaniu z próbką A obrazują, w jaki sposób zanieczyszczenia mogą wpływać na widma próbek kwasów nukleinowych.
11. Aby dokładnie ocenić jakość próbki, stosunki 260/280 lub 260/230 należy analizować w połączeniu z ogólną jakością widma. Czyste kwasy nukleinowe dają zazwyczaj stosunek 260/280 wynoszący odpowiednio ok. 1,8 dla DNA i ok. 2,0 dla RNA. Stosunek ten jest zależny od pH oraz siły jonowej buforu wykorzystanego do pomiarów próbki i próby blank. Roztwory kwasowe zaniżają stosunek o 0,2–0,3, natomiast roztwory zasadowe zawyżają go o 0,2–0,3. Istotne odchylenia w stosunkach czystości mogą wskazywać na obecność białek, fenolu lub innych zanieczyszczeń, które silnie absorbują światło przy 280 nm lub w pobliżu tej długości fali. Stosunek czystości 260/230 jest drugim miernikiem czystości DNA, a wartości dla „czystych” kwasów nukleinowych mieszczą się zazwyczaj w zakresie 1,8–2,2. Stosunki czystości znacznie niższe od wartości oczekiwanych mogą wskazywać na konieczność dalszej optymalizacji zastosowanej techniki izolacji.
12. Spektrofotometry NanoDrop mogą być również wykorzystywane do oznaczania ilości białek przy użyciu bezpośredniego pomiaru absorbancji lub kolorymetrycznych testów białkowych. Aby zapewnić prawidłowe formowanie się kolumny oraz powtarzalność, 2-μl zalecane jest stosowanie próbek białek. Należy zapoznać się z następującym filmem JoVE: Microvolume Protein Concentration Determination Using the NanoDrop Spectrophotometer **Analiza obrazów z mikroskopii konfokalnej** **Streszczenie** Mikroskopia konfokalna jest potężnym narzędziem do obrazowania próbek biologicznych, ponieważ pozwala na uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazów w trzech wymiarach poprzez eliminację światła spoza płaszczyzny ogniskowania. Jednakże samo wykonanie obrazowania to tylko pierwszy etap; kluczowym elementem jest późniejsza analiza danych w celu wyciągnięcia naukowych wniosków. W tym filmie przedstawiono podstawowe zasady i techniki analizy obrazów z mikroskopii konfokalnej przy użyciu oprogramowania ImageJ. Omówiono procesy takie jak kalibracja, ustawianie progu (thresholding), analiza obszarów i intensywności fluorescencji oraz techniki kolokalizacji, które pozwalają na precyzyjną kwantyfikację danych biologicznych z obrazów mikroskopowych. **Słowa kluczowe** mikroskopia konfokalna, obrazowanie, ImageJ, analiza obrazu, kolokalizacja, fluorescencja, kwantyfikacja, przetwarzanie obrazów, mikroskopia laserowa, biologia komórki

2. Wysokoczułe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu fluorospektrometru NanoDrop 3300

1. W celu zademonstrowania wysokoczułego ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu NanoDrop 3300 stosuje się zestaw do fluorescencji PicoGreen. Na początek należy doprowadzić standardy z zestawu oraz wszystkie próbki kwasów nukleinowych do temperatury pokojowej. Próbki fluorescencyjne są światłoczułe i powinny być przechowywane w probówkach bursztynowych lub owiniętych folią aluminiową.
2. Należy przygotować odpowiednią ilość buforu 1x TE dla wszystkich mierzonych standardów i próbek, a także dla niezbędnego roztworu roboczego PicoGreen. Bufor 1x TE przygotowuje się poprzez rozcieńczenie dostarczonego buforu 20x TE wodą wolną od nukleaz zgodnie z protokołem producenta. Objętości reakcji mogą wynosić od 200 μL do nawet 10 μL. W niniejszym przykładzie przygotowane zostaną reakcje o objętości 10 μL.
3. W probówkach lub fiolkach wolnych od nukleaz należy przygotować seryjne rozcieńczenia standardów dsDNA o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe pożądane stężenie. Przenieść 5 μL każdego z rozcieńczonych standardów dsDNA do oddzielnej, oznakowanej probówki bursztynowej lub pokrytej folią, wolnej od nukleaz.
4. Do odpowiednio oznakowanych probówek bursztynowych lub pokrytych folią, wolnych od nukleaz, należy odmierzyć po 5 μL każdej badanej próbki dsDNA.
5. Przygotować roztwór roboczy PicoGreen zgodnie z protokołem producenta. Do każdej probówki zawierającej standard lub badaną próbkę przenieść taką samą objętość roztworu roboczego PicoGreen (w tym przykładzie 5 μL).
6. W celu przygotowania kontroli negatywnej, która służy jako roztwór referencyjny, należy połączyć równe objętości buforu 1x TE i roztworu roboczego PicoGreen.
7. Zawartość każdej probówki z reakcją należy dokładnie wymieszać poprzez delikatne pipetowanie i inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wszystkie standardy i próbki powinny zostać doprowadzone do tej samej temperatury przed pomiarem, ponieważ sygnał fluorescencji zależy od temperatury.
8. Aby przygotować instrument i przeprowadzić pomiary, należy najpierw oczyścić dolną i górną powierzchnię systemu utrzymywania próbki. Nanieść 2 do 3 μL wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną, zamknąć, a następnie otworzyć ramię dźwigni i osuszyć górny oraz dolny postument czystą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną. Przed kontynuacją należy upewnić się, że powierzchnie są wolne od włókien, ponieważ mogą one wykazywać fluorescencję w obecności źródła wzbudzenia i zakłócać pomiar.
9. Otworzyć oprogramowanie urządzenia, wybrać aplikację „Nucleic Acids” i zaznaczyć opcję „PicoGreen-dsDNA”.
10. Aby wyzerować instrument, nanieść 2 μL buforu 1x TE na dolny postument, zamknąć ramię i wybrać pole „Blank” w oprogramowaniu urządzenia. Po zakończeniu zerowania należy osuszyć roztwór zerujący z obu powierzchni systemu utrzymywania próbki.
11. Wymieszać roztwór referencyjny poprzez delikatne pipetowanie. Używając końcówek o niskiej retencji, nanieść 2 μL na dolny postument i zamknąć ramię.
12. W typie pomiaru wybrać „Reference” i zaznaczyć pożądane jednostki. Kliknąć „Measure”, aby rozpocząć cykl pomiarowy.
13. Po zakończeniu cyklu pomiarowego otworzyć ramię i dokładnie osuszyć powierzchnie systemu utrzymywania próbki. Zmierzyć do pięciu powtórzeń roztworu referencyjnego, używając nowej porcji dla każdego powtórzenia.
14. Powtórzyć proces dla pozostałych standardów w celu zbudowania krzywej wzorcowej. Można zastosować do siedmiu standardów. Oprogramowanie jest zaprojektowane tak, aby przechowywać do pięciu powtórzeń dla każdego standardu. Wyniki powtórzeń standardów są uśredniane w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, na podstawie której automatycznie wyznacza się stężenia próbek.
15. Po utworzeniu krzywej wzorcowej wybrać zakładkę „Samples”, wprowadzić odpowiednie informacje o identyfikatorach próbek i zmierzyć każdą nieznaną próbkę.

Dyskusja

Przedstawione tutaj protokoły ilościowe opierają się na najpowszechniej akceptowanych systemach mikroobjętościowych. Systemy te stanowią praktyczną alternatywę dla tradycyjnych metod oznaczania ilości kwasów nukleinowych, które wymagają większych objętości próbek i zastosowania aparatury zawierającej próbkę.

Technologia mikrowolumenowa NanoDrop wykorzystuje system zatrzymywania próbki, który opiera się na właściwościach napięcia powierzchniowego mierzonej próbki w celu utworzenia kolumny cieczy. Niezbędne jest, aby próbka miała kontakt z górną i dolną optyczną powierzchnią pomiarową w celu prawidłowego uformowania kolumny. Jeśli w dowolnym momencie wyniki pomiarów wydają się niedokładne lub niepowtarzalne, najprawdopodobniej jest to wynik niejednorodności próbki lub przerwania kolumny cieczy.

Detergenty i alkohol izopropylowy nie są zalecanymi środkami czyszczącymi, ponieważ mogą one doprowadzić do utraty kondycjonowania powierzchni pomiarowych piedestału. Brak kondycjonowania piedestału występuje, gdy właściwości hydrofobowe jego powierzchni zostaną naruszone, co skutkuje spłaszczeniem kropli próbki. Niekondycjonowane piedestały mogą prowadzić do przerwania kolumny cieczy podczas pomiaru.

Rycina 3. Powierzchnia niepoddana kondycjonowaniu charakteryzuje się spłaszczeniem kropli wody.

Nieodtłuszczone powierzchnie podstawki można odnowić, używając preparatu NanoDrop Pedestal Reconditioning Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Cienką warstwę preparatu do odnawiania nanosi się na górną i dolną powierzchnię podstawki, pozostawia do wyschnięcia przez ok. 30 seconds, a następnie ściera za pomocą czystej, suchej i niepozostawiającej włókien chusteczki laboratoryjnej. Prawidłowo odnowiony stan charakteryzuje się tym, że kropla wody przyjmuje formę kuli po naniesieniu na dolną powierzchnię podstawki.

Rycina 4. Powierzchnia poddana regeneracji charakteryzuje się skupianiem się kropli wody.

Systemy do ilościowego oznaczania mikrometrie znacząco ograniczają zużycie próbek i drastycznie zwiększają zakres stężeń w porównaniu z bardziej tradycyjnymi systemami kwantyfikacji. Chociaż pomiary mikrometryczne często stawały się technologią umożliwiającą analizę w sytuacjach z ograniczoną masą komórkową, takich jak biopsje igłowe i mikrodysekcja sterowana laserem, wydajność i łatwość obsługi tej metodologii sprawiły, że stała się ona powszechnie akceptowaną alternatywą dla tradycyjnych metod ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, nawet w przypadku dostępności dużej ilości materiału.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-2000C
NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Zobacz materiał ND-3300