Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Podsumowanie

Zastosowanie systemów mikroobjętościowych NanoDrop jako praktycznych i wydajnych alternatyw dla tradycyjnej metodologii oznaczania ilości kwasów nukleinowych opisano poprzez prezentację dwóch protokołów mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych.

Streszczenie

Nieustannie opracowywane są testy biomolekularne wykorzystujące coraz mniejsze ilości materiału, co często wyklucza stosowanie konwencjonalnych instrumentów opartych na kuwetach do oznaczania ilości kwasów nukleinowych na rzecz tych, które umożliwiają pomiary mikroobjętościowe.

System zatrzymywania próbek mikroobjętościowych NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop Products) działa dzięki połączeniu technologii światłowodowej i naturalnych właściwości napięcia powierzchniowego, co pozwala na przechwytywanie i zatrzymywanie niewielkich ilości próbki niezależnie od tradycyjnych urządzeń zawierających, takich jak kuwety czy kapilary. Co więcej, system wykorzystuje krótsze drogi optyczne, co umożliwia pomiar szerokiego zakresu stężeń kwasów nukleinowych, w zasadzie eliminując konieczność przeprowadzania rozcieńczeń. Zmniejszenie objętości próbki wymaganej do analizy spektroskopowej ułatwia również wprowadzenie dodatkowych etapów kontroli jakości w wielu procesach biologii molekularnej, zwiększając wydajność i ostatecznie prowadząc do większej pewności co do wyników analiz końcowych.

Wraz z ostatnimi postępami eksperymentalnymi pojawiła się również potrzeba prowadzenia wysokoczułej analizy fluorescencyjnej dla ograniczonej masy próbki. Dzięki zastosowaniu tej samej technologii zatrzymywania próbek w mikrobioobjętościach, pomiary fluorescencji można przeprowadzać przy użyciu 2 μL materiału, co pozwala na znaczne zmniejszenie wymagań objętościowych dla testów fluorescencyjnych. Takie mikroreakcje o objętości 10 μL lub mniejszej są obecnie możliwe dzięki zastosowaniu specjalistycznego fluorospektrometru do mikroobjętości.

Zaprezentowane zostaną dwa protokoły mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych, wykorzystujące zintegrowane systemy zatrzymywania próbek jako praktyczne alternatywy dla tradycyjnych protokołów opartych na kuwetach. Po pierwsze, opisano bezpośrednią metodę pomiaru absorbancji A260 z użyciem spektrofotometru mikroobjętościowego. Następnie przedstawiono metodę fluorescencyjną, która umożliwia prowadzenie reakcji fluorescencyjnych w zredukowanej objętości przy użyciu fluorospektrometru mikroobjętościowego. Te nowoczesne techniki pozwalają na ocenę stężeń kwasów nukleinowych w zakresie od 1 pg/ μL do 15 000 ng/ μL przy minimalnym zużyciu próbki.

Protokół

1. Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000c

1. W celu rozpoczęcia należy oczyścić górną i dolną powierzchnię optyczną systemu utrzymywania próbki spektrofotometru mikrobobjętościowego, naniosząc pipetą od 2 do 3 μL czystej wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną.
2. Opuść ramię dźwigni, upewniając się, że górna podstawa styka się z wodą dejonizowaną. Podnieś ramię dźwigni i przetrzyj obie powierzchnie optyczne czystą, suchą i niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną.
3. Otwórz oprogramowanie NanoDrop i wybierz aplikację Nucleic Acid. Używając skalibrowanego pipetora do małych objętości, wykonaj pomiar tła (blank), nanieosząc 1 μL buforu na dolną powierzchnię optyczną. Opuść ramię dźwigni i wybierz opcję „Blank” w aplikacji Nucleic Acid.
4. Po zakończeniu pomiaru próbki ślepej należy oczyścić obie powierzchnie optyczne za pomocą czystej, suchej i niepozostawiającej włókien chusteczki laboratoryjnej.
5. Wybierz odpowiednią stałą dla próbki przeznaczonej do pomiaru.
   

   Typ próbki	Wybierz opcję	Stała używana do obliczania stężenia
   dwuniciowy DNA	DNA-50	50
   ssDNA	DNA-33	33
   RNA	RNA-40	40
   Oligonukleotyd	Niestandardowy	15-150

   Tabela 1. Typowe zakresy stężeń kwasów nukleinowych dla bezpośrednich pomiarów absorbancji przy A280 z wykorzystaniem mikroobjętościowego spektrofotometru NanoDrop, tradycyjnego spektrofotometru z kuwetą przy użyciu mikrokuwety TrayCell oraz mikroobjętościowego fluorospektrometru NanoDrop w połączeniu z testem PicoGreen.
6. Nanieś 1 μL próbki kwasów nukleinowych na dolny piedestał optyczny i zamknij ramię dźwigni. Ponieważ pomiar jest niezależny od objętości, próbka musi jedynie wypełnić przestrzeń między dwiema powierzchniami optycznymi, aby pomiar mógł zostać wykonany.
7. W oprogramowaniu aplikacji wybierz opcję „Measure”. Program automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz wskaźniki czystości. Po pomiarze próbki przeanalizuj uzyskane widmo.
8. Oprogramowanie automatycznie obliczy stężenie kwasów nukleinowych oraz współczynniki czystości. Po pomiarze próbki należy przeanalizować obraz widma, aby ocenić jakość próbki.
9. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie charakteryzować się bardzo specyficznym profilem.
   
   Rysunek 1. Typowa próbka kwasów nukleinowych będzie miała bardzo charakterystyczny profil.
10. Typowe źródła zanieczyszczeń związanych z konkretnymi technikami izolacji kwasów nukleinowych obejmują ekstrakcję fenolem/Trizolem oraz ekstrakcję kolumnową. W przypadku ekstrakcji fenolem/Trizolem zanieczyszczenie pozostałościami odczynników może objawiać się nietypowymi widmami w zakresie od 220 do 240 nm, a także przesunięciami w obszarze od 260 do 280 nm. Z kolei pozostałości guanidyny z ekstrakcji kolumnowej mogą przyczyniać się do powstania piku w pobliżu 230 nm oraz przesunięcia minimum widma z 230 nm do około 240 nm.
    
    Rycina 2. Przesunięcia maksimów i minimów próbek B i C w porównaniu z próbką A ilustrują, w jaki sposób zanieczyszczenia mogą wpływać na widma próbek kwasów nukleinowych.
11. Aby dokładnie ocenić jakość próbki, stosunki 260/280 lub 260/230 należy analizować w połączeniu z ogólną jakością widma. Czyste kwasy nukleinowe zazwyczaj dają stosunek 260/280 wynoszący odpowiednio około 1,8 dla DNA i około 2,0 dla RNA. Stosunek ten jest zależny od pH i siły jonowej buforu użytego do pomiarów próbki oraz pomiaru tła (blanku). Roztwory kwasowe zaniżą wartość tego stosunku o 0,2–0,3, podczas gdy roztwór zasadowy zawyży go o 0,2–0,3. Istotne odchylenia w stosunkach czystości mogą wskazywać na obecność białek, fenolu lub innych zanieczyszczeń, które wykazują silną absorbancję przy 280 nm lub w jej bliskim sąsiedztwie. Stosunek czystości 260/230 stanowi drugi wskaźnik czystości DNA, przy czym wartości dla „czystego” kwasu nukleinowego mieszczą się zazwyczaj w zakresie 1,8–2,2. Stosunki czystości znacznie niższe od wartości oczekiwanych mogą wskazywać na konieczność dalszej optymalizacji zastosowanej techniki izolacji.
12. Spektrofotometry NanoDrop mogą być również wykorzystywane do oznaczania ilości białek za pomocą bezpośredniego pomiaru absorbancji lub kolorymetrycznych metod oznaczania białek. Aby zapewnić prawidłowe uformowanie słupa cieczy oraz powtarzalność wyników, w przypadku próbek białek zaleca się stosowanie objętości 2 μl. Należy odnieść się do następującego filmu JoVE: Wyznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach przy użyciu spektrofotometru NanoDrop **Wykorzystanie mikroskopii konfokalnej do obrazowania i analizy komórek w 3D** **Streszczenie** Mikroskopia konfokalna pozwala na uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości z głębokich warstw próbek biologicznych poprzez eliminację światła spoza płaszczyzny ogniskowania. Technika ta umożliwia tworzenie tzw. przekrojów optycznych, które można następnie złożyć w trójwymiarowe rekonstrukcje komórek i tkanek. W niniejszym filmie zaprezentowano podstawowe zasady działania mikroskopu konfokalnego, przygotowanie próbek oraz proces akwizycji i analizy obrazu w 3D. **Słowa kluczowe** mikroskopia konfokalna, obrazowanie 3D, rekonstrukcja objętościowa, przekrój optyczny, fluorescencja, analiza obrazu **Metody** **Przygotowanie próbki** 1. Wyhoduj komórki na szkiełkach podstawowych odpowiednich do obrazowania konfokalnego. 2. Ustal odpowiednią gęstość komórek, aby uniknąć nadmiernego nakładania się na siebie poszczególnych obiektów w obrazie 3D. 3. Przeprowadź utrwalanie komórek przy użyciu 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 4. Przepłucz próbki trzykrotnie buforem PBS. 5. Przeprowadź permeabilizację za pomocą 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut. 6. Zablokuj niespecyficzne wiązania, stosując 3% surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 7. Inkubuj próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi w 4°C przez całą noc. 8. Po przemyciu buforem PBS, inkubuj próbki z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforami przez 1 godzinę w ciemności. 9. Zamontuj próbki za pomocą medium do montażu zapobiegającego blaknięciu sygnału fluorescencji. **Akwizycja obrazu konfokalnego** 1. Umieść próbkę na stole mikroskopu i ustaw odpowiednie powiększenie obiektywu. 2. Zidentyfikuj obszar zainteresowania (ROI) przy użyciu niskiego powiększenia, a następnie przełącz na obiektyw o większej aperturze numerycznej w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości. 3. Skonfiguruj parametry laserów dla każdego użytego fluoroforu, dbając o to, aby uniknąć nasycenia sygnału (przepalenia pikseli). 4. Ustaw rozmiar skanu (np. 512 x 512 pikseli) oraz średnią liczbę skanów w celu redukcji szumu. 5. Zdefiniuj zakres skanowania w osi Z (Z-stack), określając punkt startowy, punkt końcowy oraz grubość przekroju optycznego (Z-step). 6. Dobierz interwał Z zgodnie z kryterium Nyquista, aby zapewnić optymalną rozdzielczość w osi pionowej. 7. Rozpocznij akwizycję serii obrazów w osi Z. **Analiza i rekonstrukcja 3D** 1. Zaimportuj plik Z-stack do oprogramowania do analizy obrazu. 2. Przeprowadź korekcję przesunięcia osi Z (chromatic aberration correction), jeśli jest to konieczne. 3. Zastosuj funkcję maksymalnej projekcji intensywności (Maximum Intensity Projection, MIP), aby uzyskać dwuwymiarowy obraz reprezentujący najsilniejsze sygnały z całego stosu. 4. Wykorzystaj narzędzia do renderowania objętościowego w celu stworzenia trójwymiarowej wizualizacji struktury komórkowej. 5. Przeprowadź analizę kolokalizacji, aby określić stopień współwystępowania dwóch różnych markerów w tej samej przestrzeni subkomórkowej. 6. Zmierz objętość lub intensywność sygnału w wybranych regionach 3D za pomocą narzędzi do segmentacji.

2. Wysokoczułe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych w mikroobjętościach z użyciem fluorospektrometru NanoDrop 3300

1. W celu zademonstrowania wysokoczułego oznaczania ilości kwasów nukleinowych w mikroobjętościach przy użyciu NanoDrop 3300 stosuje się zestaw fluorescencyjny PicoGreen. W pierwszej kolejności należy doprowadzić standardy z zestawu oraz wszystkie próbki kwasów nukleinowych do temperatury pokojowej. Próbki fluorescencyjne są wrażliwe na światło i powinny być przechowywane w probówkach bursztynowych lub owiniętych folią aluminiową.
2. Należy przygotować wystarczającą ilość buforu 1x TE dla wszystkich standardów i próbek przeznaczonych do pomiaru, a także dla niezbędnego roztworu roboczego PicoGreen. Bufor 1x TE przygotowuje się poprzez rozcieńczenie dostarczonego buforu 20x TE wodą wolną od nukleaz zgodnie z protokołem producenta. Objętości reakcji mogą wynosić od 200 μL do nawet 10 μL. W niniejszym przykładzie przygotowane zostaną reakcje o objętości 10 μL.
3. Należy przygotować seryjne rozcieńczenia standardów dsDNA o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe pożądane stężenie, korzystając z fiolek lub probówek wolnych od nukleaz. Przenieść 5 μL każdego z rozcieńczonych standardów dsDNA do oddzielnej, oznakowanej, bursztynowej lub pokrytej folią probówki wolnej od nukleaz.
4. Odmiarkować 5 μL każdej badanej próbki dsDNA do odpowiednio oznakowanych, bursztynowych lub pokrytych folią probówek wolnych od nukleaz.
5. Przygotować roztwór roboczy PicoGreen zgodnie z protokołem producenta. Przenieść taką samą objętość roztworu roboczego PicoGreen do każdej probówki zawierającej standard lub badaną próbkę (w tym przykładzie 5 μL).
6. W celu przygotowania kontroli negatywnej, która służy jako roztwór referencyjny, połączyć równe objętości buforu 1x TE i roztworu roboczego PicoGreen.
7. Zawartość każdej probówki reakcyjnej należy dokładnie wymieszać poprzez delikatne pipetowanie, a następnie inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wszystkie standardy i próbki powinny zostać doprowadzone do tej samej temperatury przed pomiarem, ponieważ sygnał fluorescencji zależy od temperatury.
8. Aby przygotować instrument i przeprowadzić pomiary, należy najpierw oczyścić dolną i górną powierzchnię systemu utrzymującego próbkę. Nanieść pipetą 2 do 3 μL wody dejonizowanej na dolną powierzchnię optyczną, zamknąć, a następnie otworzyć ramię dźwigni i osuszyć górny oraz dolny postument czystą, niepozostawiającą włókien chusteczką laboratoryjną. Przed kontynuacją należy upewnić się, że powierzchnie są wolne od włókien, ponieważ mogą one wykazywać fluorescencję w obecności źródła wzbudzenia i zakłócać pomiar.
9. Otworzyć oprogramowanie instrumentu, wybrać aplikację „Nucleic Acids”, a następnie opcję „PicoGreen-dsDNA”.
10. Aby przeprowadzić zerowanie instrumentu, nanieść 2 μL buforu 1x TE na dolny postument, zamknąć ramię i wybrać funkcję „Blank” w polu oprogramowania instrumentu. Po zakończeniu zerowania należy osuszyć roztwór zerujący z obu powierzchni systemu utrzymującego próbkę.
11. Wymieszać roztwór referencyjny poprzez delikatne pipetowanie. Używając końcówek o niskiej retencji, nanieść 2 μL roztworu na dolny postument i zamknąć ramię.
12. W typie pomiaru wybrać „Reference” i wskazać pożądane jednostki. Kliknąć „Measure”, aby rozpocząć cykl pomiarowy.
13. Po zakończeniu cyklu pomiarowego należy otworzyć ramię i dokładnie osuszyć powierzchnie systemu utrzymującego próbkę. Wykonać pomiar do pięciu powtórzeń roztworu referencyjnego, używając nowej porcji dla każdego powtórzenia.
14. Powtórzyć ten proces dla pozostałych standardów w celu zbudowania krzywej wzorcowej. Można użyć do siedmiu standardów. Oprogramowanie jest zaprojektowane tak, aby przechowywać do pięciu powtórzeń dla każdego standardu. Wartości powtórzeń standardów są uśredniane w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, na podstawie której automatycznie wyznaczane są stężenia próbek.
15. Po utworzeniu krzywej wzorcowej należy wybrać zakładkę „Samples”, wprowadzić odpowiednie informacje o identyfikatorach próbek i zmierzyć każdą nieznaną próbkę.

Dyskusja

Przedstawione tutaj protokoły ilościowe opierają się na najszerzej akceptowanych systemach mikroobjętościowych. Systemy te stanowią praktyczną alternatywę dla tradycyjnych metod oznaczania ilości kwasów nukleinowych, które wymagają większych objętości próbek oraz zastosowania urządzeń do ich pomieszczenia.

Technologia mikroobjętościowa NanoDrop wykorzystuje system zatrzymywania próbki, który opiera się na właściwościach napięcia powierzchniowego mierzonej próbki w celu utworzenia słupa cieczy. Aby zapewnić prawidłowe uformowanie słupa, niezbędny jest kontakt próbki z górną i dolną powierzchnią pomiarową optyki. Jeśli wyniki pomiarów wydadzą się niedokładne lub niepowtarzalne, najprawdopodobniej jest to wynik heterogeniczności próbki lub przerwania słupa cieczy.

Nie zaleca się stosowania detergentów i alkoholu izopropylowego jako środków czyszczących, ponieważ mogą one doprowadzić do utraty kondycjonowania powierzchni pomiarowych podstawki. Brak kondycjonowania podstawki występuje, gdy właściwości hydrofobowe jej powierzchni zostaną naruszone, co skutkuje spłaszczeniem kropli próbki. Nieukondycjonowane podstawki mogą prowadzić do przerwania kolumny cieczy podczas pomiaru.

Rysunek 3. Powierzchnia niekondycjonowana charakteryzuje się spłaszczeniem kropli wody.

Nieuzależnione powierzchnie podstawki można regenerować za pomocą związku do regeneracji podstawki NanoDrop (NanoDrop Pedestal Reconditioning Compound PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Cienką warstwę związku regenerującego nanosi się na górną i dolną powierzchnię podstawki, pozostawia do wyschnięcia przez ok. 30 seconds, a następnie ściera czystą, suchą, beztroską chusteczką laboratoryjną. Prawidłowo zregenerowany stan charakteryzuje się tym, że kropla wody tworzy wypukły kształt po naniesieniu na dolną powierzchnię podstawki.

Rysunek 4. Powierzchnia poddana regeneracji charakteryzuje się formowaniem się kropli wody w postaci kuleczek.

Systemy ilościowego oznaczania mikropojemności znacznie ograniczają zużycie próbek i drastycznie zwiększają zakres stężeń w porównaniu do tradycyjnych systemów kwantyfikacji. Chociaż oznaczanie mikropojemności stało się często technologią umożliwiającą analizy w sytuacjach z ograniczoną masą komórek, takich jak biopsje igłowe i mikrodysekcja sterowana laserem, wydajność i łatwość obsługi tej metodologii sprawiły, że stała się ona powszechnie akceptowaną alternatywą dla tradycyjnych metod ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, nawet w przypadku dostępności dużej ilości materiału biologicznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-2000C
NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Zobacz materiał ND-3300