Życie większości ryb opiera się na pływaniu. Niniejszy protokół opisuje techniki rejestrowania różnych sposobów pływania dostępnych dla pojedynczych osobników oraz ławic ryb, a także zawiera mierniki związane z fizjologią i zachowaniem podczas pływania.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Testy wydajności pływania ryb stanowią integralną część badań nad energetyką mięśni, mechaniką pływania, wymianą gazową, fizjologią serca, chorobami, zanieczyszczeniami, hipoksją i temperaturą. Niniejsza praca opisuje elastyczny protokół oceny wydajności pływania ryb z wykorzystaniem sprzętu umożliwiającego kontrolę prędkości wody. Protokół obejmuje od jednego do kilku stopniowych zwiększeń prędkości przepływu, które mają doprowadzić ryby do zmęczenia. Prędkości poszczególnych stopni oraz ich czas trwania mogą być dostosowane w celu uchwycenia zdolności pływackich o różnym znaczeniu fizjologicznym i ekologicznym. Najczęściej wielkość stopnia jest ustalana w celu wyznaczenia krytycznej prędkości pływania (Ucrit), która ma na celu określenie maksymalnej zdolności do pływania długotrwałego. Tradycyjnie test ten składał się z około dziesięciu stopni, z których każdy trwał 20 min. Jednak coraz częściej wykorzystuje się stopnie o krótszym czasie trwania (np. 1 min), aby ocenić zdolność do przyspieszenia lub wydajność pływania zrywnego. Niezależnie od wielkości stopnia, testy pływania można powtarzać w czasie, aby ocenić zmienność osobniczą i zdolność do regeneracji. Przed, w trakcie i po testach pływania często uwzględnia się punkty końcowe związane z pływaniem, takie jak pomiary tempa metabolizmu, wykorzystania płetw, częstotliwości wentylacji, a także wskaźniki behawioralne, np. odległość między rybami w ławicy. Biorąc pod uwagę różnorodność gatunków ryb, liczbę nieprzebadanych pytań badawczych oraz znaczenie wielu gatunków dla globalnej ekologii i gospodarki, badania nad wydajnością pływania ryb pozostaną popularne i nieocenione w dającej się przewidzieć przyszłości.
Protokół
1. Odłów i aklimatyzacja
- Za pomocą sieci bezwęzłowej odłowić pojedyncze ryby z pojemnika zbiorczego. Należy zminimalizować czas odłowu, unikać chwytania wielu ryb jednocześnie oraz nie trzymać ryb w sieci dłużej niż przez kilka sekund, ponieważ czynniki te mogą zwiększać stres. Stres może wpływać na wydajność pływania.
- Umieścić ryby w zbiorniku transferowym z anestetykiem lub bezpośrednio w respirometrze tunelowym („tunel pływacki”). W przypadku konieczności znieczulenia ryb można zastosować metansulfonian tricainy (MS222) lub olejek goździkowy. Dopuszczalne stężenia zależą od wielu czynników, w tym od wrażliwości gatunkowej i temperatury, ale zazwyczaj mieszczą się w zakresie 10-100 mg/L dla każdego z tych anestetyków1,2. Stężenie anestetyku powinno indukować III stopień znieczulenia (tj. brak reakcji na bodźce zewnętrzne) i umożliwiać szybką regenerację (tj. w ciągu kilku sekund). Podczas stosowania MS222 w wodzie słodkiej należy użyć wodorowęglanu sodu w równych częściach (masowych) jako buforu. Bez buforu MS222 znacznie obniży pH, a niskie pH może uszkodzić tkankę skrzeli. Buforowanie nie jest konieczne w wodzie morskiej, ponieważ posiada ona wystarczającą pojemność buforową.
- Znieczulone ryby można poddać oznaczeniu płci, pomiarowi masy i długości oraz pobieżnemu badaniu zewnętrznemu stanu zdrowia. Długość można mierzyć jako długość całkowitą (TL), długość widliczną (FL) lub długość ciała (BL). Te różne miary stosuje się zazwyczaj zgodnie ze standardową praktyką, morfologią gatunku (np. brak płetwy widlastej) lub stanem ryby (np. zniszczona płetwa ogonowa).
- Zarówno ryby znieczulone, jak i nieznieczulone, należy wprowadzić do tunelu pływackiego tak szybko, jak to możliwe i do płynącej wody, co ułatwi regenerację. Szybkość przepływu ustawia się zazwyczaj tak, aby ryba mogła spoczywać na dnie, ledwie pływając. Przykładowa prędkość dla dorosłego łososia sockeye wynosi 0.3 BL/s.
- Ryby muszą pozostać w tunelu pływackim w celu aklimatyzacji. Okres aklimatyzacji można ustawić zgodnie z tradycyjnymi ramami czasowymi (np. 12 hr) lub zgodnie z tymi stosowanymi w większości aktualnych badań, które mogą trwać już od 30 min. Aby określić idealny okres aklimatyzacji dla danej ryby, można wykorzystać czas potrzebny na osiągnięcie stabilnego, najlepiej niskiego tempa metabolizmu (szczegóły w następnej sekcji).
2. Pomiar wskaźników metabolicznych
- Zmiany poziomu tlenu w tunelu pływaniowym powinny być rejestrowane przez cały czas trwania testu (lub testów) pływackich. Sondy tlenowe mogą być zamontowane bezpośrednio w tunelu pływaniowym, jednak najpierw należy ustalić, czy przepływ wody nad sondą wpływa na jej działanie. Jeśli sonda jest podatna na prędkości przepływu wody, które mogą wystąpić podczas testu, należy umieścić ją w oddzielnej komorze poza tunelem i doprowadzać do niej wodę z tunelu za pomocą pompy.
- W celu uzupełnienia tlenu i ograniczenia akumulacji produktów przemiany materii, tunel pływaniowy prawdopodobnie będzie wymagał okresowego przepłukiwania. W przypadku większości gatunków nasycenie tlenem nie powinno spaść poniżej 70%, ponieważ może to obniżyć wydajność pływania lub doprowadzić do przejścia na metabolizm beztlenowy. Przepłukiwanie wody w tunelu może również pomóc w ograniczeniu wzrostu temperatury wody; temperatura wody powinna być jednak utrzymywana na stałym poziomie poprzez połączenie tunelu pływaniowego z chłodziarką. Zmiany temperatury wpływają na tempo metabolizmu.
- Zazwyczaj wyznacza się podstawowe i maksymalne tempo metabolizmu, skrótowo określane jako „RMR” i „MMR” (Rysunek 1A). Wartości te mogą być wyrażone jako objętość (Vo2) lub masa (Mo2) tlenu na jednostkę masy w jednostce czasu, np. mg O2 / kg / hr. Różnica między tymi dwiema wartościami pozwala wyznaczyć „zakres aktywności” (scope for activity). Można również wyznaczyć „dług tlenowy” po wysiłku, nazywany „nadmiarowym poborem tlenu po wysiłku” (EPOC), który odpowiada ilości tlenu potrzebnej podczas powrotu do poziomu RMR po zakończeniu ćwiczeń.
- Uwaga: wiele sond tlenowych oraz ich wyniki automatycznie uwzględniają korektę temperatury w pomiarach zmian poziomu tlenu rozpuszczonego. W przypadku sond, które tego nie robią, konieczne jest przeprowadzenie korekty. Ponadto niektóre wartości będą wymagały korekty, jeśli pomiary były prowadzone w warunkach zasolenia.
Pomiar wydajności pływania
W tunelu pływaniowym można ocenić szereg parametrów wydajności pływania. Najczęstszym sposobem charakteryzowania wydajności pływania jest określenie czasu, przez który może być ona utrzymana3. Im mniejsza prędkość, tym dłużej może być utrzymana i odwrotnie. Prędkości są zazwyczaj określane jako „krótkotrwałe” (burst), „przedłużone” (prolonged) lub „stałe” (sustained), co odpowiada odpowiednio czasom trwania liczonym w sekundach, od minut do godzin (maks. 200 min) oraz godzinom i więcej (>200 min). Aby wyznaczyć te prędkości, ryby poddaje się zdefiniowanym przez użytkownika „stopniom” (steps), składającym się z określonej „wysokości” (height), czyli przyrostu prędkości przepływu wody, oraz „długości” (length), czyli czasu trwania stopnia. Maksymalizacja wysokości stopnia i minimalizacja jego długości pozwoli na uchwycenie maksymalnej prędkości krótkotrwałej, natomiast działanie odwrotne pozwoli wyznaczyć maksymalną prędkość stałą. W testach stopniowych tradycyjnym sposobem raportowania maksymalnej osiągniętej prędkości jest przyjęcie prędkości ostatniego w pełni ukończonego stopnia powiększonej o część czasową ostatniego, nieukończonego stopnia (Rysunek 1A).
Ocena wydajności krótkotrwałego pływania przyspieszonego
- Aby ocenić prędkość pływania gwałtownego lub zdolność do sprintu, po aklimatyzacji zwiększ prędkość przepływu do szacowanego maksimum (np. dwukrotność Ucrit; patrz poniżej) i zmotywuj rybę do pływania. Ryba powinna spoczywać w tylnej części chambers w momencie gwałtownego zwiększania prędkości przepływu. Może być konieczne zmotywowanie ryby do pływania. Motywacja może być mechaniczna (np. dotyk) lub elektryczna (np. niewielki ładunek przyłożony do siatki elektrycznej z tyłu tunelu pływackiego).
Chociaż nie jest to specyficzny test zdolności do gwałtownego pływania, ryby można poddać „testowi stałego przyspieszenia” (CAT lub UΔV), składającemu się z kilku krótkich kroków (np. 1 min)4,5. - Zapisz czas trwania pływania. Można również zapisać liczbę poszczególnych zrywów oraz pokonany przez nie dystans6. Prędkość może być podana jako prędkość maksymalna osiągnięta lub obliczona zgodnie z równaniem przedstawionym na Rysunku 1A.
Ocena wydajności pływania długotrwałego i wytrzymałościowego
Najczęściej stosowaną miarą służącą do oceny zdolności do pływania długotrwałego lub wytrzymałościowego jest tzw. „krytyczna wydajność pływania” (Ucrit). Długość kroku dla Ucrit była tradycyjnie ustalana na 20 min, choć stosowano również krótsze czasy, np. 10 min. Ogólną zasadą jest, aby przed wystąpieniem zmęczenia wykonać co najmniej dziesięć kroków, co może skutkować długimi testami, np. >3 h/ryba. Aby skrócić test Ucrit, pierwsze siedem kroków można skrócić do 5 min (test ten nazywa się wówczas „ramp- Ucrit”).
- Po aklimatyzacji i/lub pływaniu próbnym należy zwiększać prędkość przepływu zgodnie z wielkością kroku.
- Aby ustawić odpowiednią wysokość kroku dla Ucrit, prawdopodobnie konieczne będzie oszacowanie Ucrit dla próby ryb przeznaczonych do testów. Można to osiągnąć, korzystając z wartości literaturowych. Alternatywnie, ryby mogą przejść „pływanie próbne” po wprowadzeniu do tunelu. W tym celu należy stosować krótkie, zdefiniowane przez użytkownika kroki, aż do wystąpienia zmęczenia. Ostatnią osiągniętą prędkość należy przyjąć jako wstępną wartość Ucrit. Wielkość kroku (wysokość i długość) należy dostosować dla każdej ryby.
- Aby zbadać zdolność do regeneracji lub określić indywidualne różnice w wydajności, ryby mogą przejść drugi test pływacki po okresie odpoczynku7-9.
- Ryby mogą być również badane w grupach, choć mają one tendencję do zmęczenia w różnym czasie podczas testów, co może utrudniać ich usuwanie z tunelu i uniemożliwiać pomiar poboru tlenu.
- Po wystąpieniu zmęczenia ryby powinny przejść regenerację lub zostać natychmiast usunięte w celu pobrania próbek tkanek.
Podczas testów lub po nich, przy użyciu analizy wideo, można zebrać kilka wskaźników wydajności związanych z pływaniem (Rysunek 1 C,D). - Aby zmierzyć częstotliwość wentylacji i częstotliwość uderzeń ogonem, należy monitorować tempo pompowania operkularnego oraz liczbę uderzeń ogonem w odstępach kilku sekund (Rysunek 1B)10,11.
- Aby zmierzyć amplitudę uderzeń ogonem, można zmierzyć maksymalne wychylenie płetwy ogonowej (Rysunek 1B)12.
- Po zakończeniu testów ryby mogą zostać uśpione, a następnie poddane badaniu pośmiertnemu i pobraniu tkanek w celu określenia hematokrytu (objętości skonsolidowanych erytrocytów), stężeń hormonów stresu, zapasów energii w mięśniach (np. fosfokreatyny, glikogenu), aktywności enzymów (np. dehydrogenazy mleczanowej, acetylocholinoesterazy) lub innych parametrów fizjologicznych.
3. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. A) Przykład testu rampowego Ucrit przeprowadzonego u młodego łososowatego, pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) hodowanego w wylęgarni, o długości ciała (BL) 6,3 cm i masie 3,5 g. Test przeprowadzono w zmodyfikowanym respirometrze typu Bretta o pojemności 12 L (Loligo Systems, Dania; www.loligosystems.com). Rutynowe i maksymalne tempo metabolizmu obliczono jako nachylenie (mg/hr) × objętość (L) / masa ryby (kg), a wyniosły one odpowiednio 198 i 961 mg O2/kg/hr (zakres aktywności = 4,84). Wartości te są zgodne z danymi raportowanymi przez Bretta dla młodego łososia nerki (O. nerka)13. Uwaga: do obliczeń poboru tlenu przyjęto, że objętość wody jest równa objętości respirometru pomniejszonej o objętość ryby. Krzyżyk wskazuje punkt, w którym ryba odmówiła dalszego płynięcia i w którym obliczono Ucrit. B) Wartości częstotliwości uderzeń ogona rejestrowano sześciokrotnie przez 10 s; wartości amplitudy uderzeń ogona rejestrowano trzykrotnie; przedstawione wartości to średnia ± SEM. C) Powiększony widok z boku oraz D) widok z góry ryby płynącej w komorze pływnej. D) Przedstawia rybę śledzoną przez oprogramowanie EthoVision (Noldus, Holandia; www.noldus.com). Skróty: Ucrit = krytyczna prędkość pływania; Uf = prędkość ostatniego w pełni ukończonego kroku, Us = prędkość kroku, tf = czas spędzony na ostatnim kroku, ts = czas kroku.
Dyskusja
W środowisku naturalnym zachowania, takie jak ucieczka przed drapieżnikiem i migracja, zależą od zdolności do pływania z określoną intensywnością przez różny czas. W warunkach laboratoryjnych do oszacowania zdolności ryb do wykonywania wielu zachowań można wykorzystać respirometry tunelowe oraz stopniowe zwiększanie prędkości. Pomiary tempa metabolizmu oraz inne oceny na poziomie tkanek (takie jak produkcja mleczanu) mogą być włączone do testów pływackich, aby pomóc w określeniu mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw różnych trybów pływania.
Konstrukcja tunelu pływaniowego może w dużym stopniu wpływać na wyniki wydolności pływackiej. Do określania wydajności pływania stosuje się kilka typów tuneli, z których większość klasyfikuje się jako typy Bretta13 lub Blazki14. W przypadku obu konstrukcji kluczowe kwestie obejmują „równomierność” przepływu wody (stopień jego liniowości), maksymalną prędkość przepływu oraz długość komory pływackiej. Równomierność jest istotna, ponieważ ryby instynktownie wyszukują obszary o niskim przepływie i w nich pływają, aby zminimalizować wysiłek. Wysoki potencjalny przepływ może być niezbędny do testowania zdolności do pływania gwałtownego lub w przypadku gatunków szybko pływających (np. tuńczyków). Długość komory pływackiej może mieć duże znaczenie, ponieważ w komorach o małej długości, tj. gdy długość ryby > 10 % długości komory, ryby mogą nie być w stanie wykorzystać wszystkich trybów pływania. W szczególności krótkie rury mogą ograniczać zdolność ryb do przejścia ze stałego na niestabilny sposób pływania, tj. do pływania gwałtownego i ślizgowego. W konsekwencji ryby mogą przestać pływać przy niemal tej samej prędkości, niezależnie od długości kroku, a Ucrit może być analogiczne do „prędkości przejścia chodu”15.
Wszystkie tunele pływakowe muszą zostać skalibrowane przy użyciu urządzeń takich jak sondy przepływu lub sprzęt do pomiaru prędkości obrazowej cząstek (PIV). W idealnym przypadku tunele pływakowe powinny charakteryzować się przepływem prostoliniowym, jednak jeśli okaże się, że ryby preferują określony obszar, ich prędkość pływania można dostosować na podstawie lokalnych różnic w przepływie.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autor dziękuje Barbarze Berli za udostępnienie przykładowych danych oraz Canadian Wildlife Federation za łaskawe sfinansowanie badań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| metanosulfonian trikainy (MS222) |  Argent Labs | Opcjonalnie | |
| Olejek goździkowy | Sigma-Aldrich | Opcjonalnie | |
| Respirometr tunelowy do pływania | Loligo Systems | Wymagane | |
| Kamery szybkomierze | Wielu dostawców | opcjonalny | |
| Karta przechwytywania wideo | Wielu dostawców | opcjonalnie | |
| Oprogramowanie do analizy zachowań | Noldus | opcjonalny |
Bibliografia
- Anderson, W. G., McKinley, R. S., Colavecchia, M. The use of clove oil as an anesthetic for rainbow trout and its effects on swimming performance. North Am. J. Fish Manage. 17, 301-307 (1997).
- Cho, G. K., Heath, D. D. Comparison of tricaine methanesulphonate (MS222) and clove oil anaesthesia effects on the physiology of juvenile chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha (Walbaum). Aquacult. Res. 31, 537-546 (2000).
- Beamish, F. W. H. Swimming capacity in Fish Physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press Inc. New York. Vol. 7 101-187 (1978).
- Farrell, A. P. Comparisons of swimming performance in rainbow trout using constant acceleration and critical swimming speed tests. J. Fish Biol. 72, 693-710 (2008).
- Tierney, K. B., Casselman, M., Takeda, S., Farrell, A. P., Kennedy, C. J. The relationship between cholinesterase inhibition and two types of swimming performance in chlorpyrifos-exposed coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Environ. Toxicol. Chem. 26, 998-1004 (2007).
- Martinez, M., Bedard, M., Dutil, J. -D., Guderley, H. Does condition of Atlantic cod (Gadus morhua) have a greater impact upon swimming performance at Ucrit or sprint speeds. J. Exp. Biol. 207, 2979-2990 (2004).
- Marras, S., Claireaux, G., McKenzie, D. J., Nelson, J. A. Individual variation and repeatability in aerobic and anaerobic swimming performance of European sea bass, Dicentrarchus labrax. J. Exp. Biol. 213, 26-32 (2010).
- Kolok, A. S., Plaisance, E. P., Abdelghani, A. Individual variation in the swimming performance of fishes: an overlooked source of variation in toxicity studies. Environ. Toxicol. Chem. 17, 282-285 (1998).
- Tierney, K. B., Farrell, A. P. The relationships between fish health, metabolic rate, swimming performance and recovery in return-run sockeye salmon, Oncorhynchus nerka (Walbaum). J. Fish Dis. 27, 663-671 (2004).
- Webber, J. D. Upstream swimming performance of adult white sturgeon: Effects of partial baffles and a ramp. Trans. Am. Fish. Soc. 136, 402-408 (2007).
- Farrell, A. P., Gamperl, A. K., Birtwell, I. K. Prolonged swimming, recovery and repeat swimming performance of mature sockeye salmon Oncorhynchus nerka exposed to moderate hypoxia and pentachlorophenol. J. Exp. Biol. 201, 2183-2193 (1998).
- Flammang, B. E., Lauder, G. V. Speed-dependent intrinsic caudal fin muscle recruitment during steady swimming in bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. J. Exp. Biol. 211, 587-598 (2008).
- Brett, J. R. The respiratory metabolism and swimming performance of young sockeye. J. Fish. Res. Board Can. 21, 1183-1226 (1964).
- Blažka, P., Volf, M., Čepela, M. A new type of respirometer for the determination of the metabolism of fish in an active state. Physiol. Bohemoslov. 9, 553-558 (1960).
- Peake, S. J., Farrell, A. P. Fatigue is a behavioural response in respirometer confined smallmouth bass. J. Fish Biol. 68, 1742-1755 (2006).
Przedruki i uprawnienia
