Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Streszczenie

Dynamiczne zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w odpowiedzi na różne bodźce regulują wiele procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie i apoptoza¹. Podczas apoptozy akumulacja wapnia w mitochondriach promuje uwalnianie czynników proapoptotycznych z mitochondriów do cytosolu². W związku z tym interesujące jest bezpośrednie pomiar stężenia wapnia mitochondrialnego w żywych komórkach in situ podczas apoptozy. Wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne komórek obciążonych podwójnie wzbudzanymi ratiometrycznymi i nieratiometrycznymi syntetycznymi barwnikami wskaźnikowymi wapnia okazało się niezawodnym i wszechstronnym narzędziem do badania różnych aspektów wewnątrzkomórkowego sygnalizowania wapniowego. Pomiar strumieni wapnia cytozolowego za pomocą tych technik jest stosunkowo prosty. Jednak pomiar poziomu wapnia wewnątrz mitochondriów w nienaruszonych komórkach przy użyciu syntetycznych wskaźników wapnia, takich jak rhod-2 i rhod-FF, jest bardziej wymagający. Syntetyczne wskaźniki ukierunkowane na mitochondria wykazują osłabioną odpowiedź na powtarzające się wzrosty stężenia wapnia mitochondrialnego i zaburzają morfologię mitochondriów³. Ponadto syntetyczne wskaźniki mają tendencję do wyciekania z mitochondriów w ciągu kilku godzin, co czyni je nieprzydatnymi do długoterminowych eksperymentów. W związku z tym genetycznie kodowane wskaźniki wapnia oparte na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP)⁴ lub ekworynie⁵, ukierunkowane na mitochondria, znacznie ułatwiły pomiar dynamiki wapnia mitochondrialnego. W niniejszej pracy opisujemy prostą metodę pomiaru w czasie rzeczywistym strumieni wapnia mitochondrialnego w odpowiedzi na różne bodźce. Metoda ta opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem „ratiometrycznego pericamu”, który jest selektywnie ukierunkowany na mitochondria. Ratiometryczny pericam to wskaźnik wapnia oparty na fuzji cyklicznie permutowanego żółtego białka fluorescencyjnego i kalmoduliny⁴. Wiązanie wapnia przez ratiometryczny pericam powoduje przesunięcie jego piku wzbudzenia z 415 nm na 494 nm, podczas gdy widmo emisji, z pikiem około 515 nm, pozostaje niezmienione. Ratiometryczny pericam wiąże pojedynczy jon wapnia ze stałą dysocjacji in vitro wynoszącą ~1,7 μM⁴. Właściwości ratiometrycznego pericamu umożliwiają ilościowe określenie szybkich i długoterminowych zmian w stężeniu wapnia mitochondrialnego. Ponadto opisujemy adaptację tej metodologii do standardowego mikroskopu do obrazowania wapnia w szerokim polu z powszechnie dostępnymi zestawami filtrów. Używając dwóch różnych agonistów, agonisty purynergicznego ATP oraz leku indukującego apoptozę, staurosporyny, wykazujemy, że metoda ta jest odpowiednia do monitorowania zmian stężenia wapnia mitochondrialnego z rozdzielczością czasową od sekund do godzin. Co więcej, wykazujemy również, że ratiometryczny pericam jest użyteczny w pomiarze podziału/fragmentacji mitochondriów podczas apoptozy. Zatem ratiometryczny pericam jest szczególnie odpowiedni do ciągłego, długoterminowego pomiaru dynamiki wapnia mitochondrialnego podczas apoptozy.

Protokół

1. Transfekcja Pericam-mt i przygotowanie komórek.

1. Wieczorem przed transfekcją wysiej komórki HeLa na sterylne szkiełka nakrywki umieszczone w standardowej 6-dołkowej płytce hodowlanej.
2. Przygotuj kompleksy DNA/Lipofectamine 2000 zgodnie z zaleceniami producenta (Invitrogen). Do każdej dołki stosujemy 4 μg wektora ekspresyjnego ratiometric-pericam-mt oraz 10 μL Lipofectamine 2000 rozcieńczonego w 0,5 mL Opti-MEM. Przed transfekcją komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie ok. 70%.
3. W każdej dołce zastąp pożywkę hodowlany komórek HeLa (pożywka Dulbecco's modified eagles medium, 10% FBS, penicylina/streptomycyna) 1,5 mL tej samej pożywki, ale bez antybiotyków.
4. Dodaj kompleksy DNA/Lipofectamine do każdej dołki przeznaczonej do transfekcji. Delikatnie wymieszaj poprzez kołysanie i inkubuj przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37^oC i 5 % CO₂.
5. Zastąp pożywkę bez antybiotyków pożywką hodowlaną z dodatkiem antybiotyków. Pozostaw komórki na 1-2 dni w celu ekspresji ratiometric pericam przed wykonaniem obrazowania.

2. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazów

1. Umieść szkiełko podstawowe z komórkami HeLa w odpowiedniej komorze obrazującej z roztworem obrazującym: 107mM NaCl, 7.2mM KCl, 1.2mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 11.5mM glukozy, 0.1% albuminy surowicy bydlęcej oraz 20mM HEPES 7.2. W naszym laboratorium stosujemy komorę do komórek Attofluor firmy Invitrogen. Zamontuj komorę obrazującą na stoliku mikroskopu odwróconego.
2. Znajdź obszar zainteresowania zawierający jedną lub więcej komórek ekspresyjących ratiometryczny pericam, używając obiektywu imersyjnego olejowego 40x (lub większego). Stwierdziliśmy, że ratiometryczny pericam jest mniej odporny na fotoblaknięcie przy 380 nm, dlatego używamy tej długości fali do identyfikacji odpowiednich komórek. Do obrazów przedstawionych na Rysunku 1 użyto obiektywu Nikon Superfluor 40X z aperturą numeryczną 1.3. Odpowiednie byłyby również obiektywy o większym powiększeniu (60-100x). Wykorzystane filtry wzbudzenia to filtry Chroma Technology D380/30x (380 +/- 30 nm) oraz D495/10 (495 +/- 5 nm), dzielnik wiązki to 505DCXR (filtr długoprzepustowy 505nm), a filtr emisyjny to HQ535/50m (535 +/- 25nm).
   Mikroskop użyty do pozyskania obrazów na Rysunku 1 składa się z mikroskopu odwróconego Nikon TE2000 wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD Roper Scientific Coolsnap HQ, szybkie koło i zmieniacz filtrów Ludl MAC6000 oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy danych MetaFluor. Protokół ten można dostosować do każdego standardowego mikroskopu szerokopolowego z odpowiednimi filtrami i oprogramowaniem umożliwiającym przechwytywanie i przetwarzanie obrazów ratiometrycznych.
3. Skonfiguruj oprogramowanie do podwójnego wzbudzenia przy użyciu filtrów 495 i 380 nm. Wiązanie wapnia przez ratiometryczny pericam zwiększa absorbancję przy 495 nm, zatem stosunek powinien zostać ustawiony jako 495 nm/380 nm.
   Ratiometryczny pericam posiada szczyt wzbudzenia w warunkach bezwapniowych przy 415 nm⁴. W tym protokole sugerujemy użycie filtra 380 nm wyłącznie dlatego, że jest on powszechny w większości laboratoriów obrazowania wapnia. Jeśli dostępny jest filtr 410 nm, jest on preferowany nad filtrem 380 nm.
4. Pozyskuj obrazy sekwencyjnie, stosując naprzemienne wzbudzanie przy 495 i 380 nm. Rejestruj obrazy bazowego poziomu wapnia przez co najmniej 30 s przed podaniem agonisty via aparat perfuzyjny. Oznacz czas dodania każdego agonisty. Czasy ekspozycji i odstępy między akwizycjami powinny zostać zoptymalizowane, aby zapobiec fotoblaknięciu, zapewniając jednocześnie wystarczającą rozdzielczość czasową. Na przykład w przypadku półszybkiej dynamiki wapnia monitorowanej w odpowiedzi na stymulację agonistą, obrazy na Rysunkach 1B i C były pozyskiwane co dwie sekundy. Możliwe są również znacznie szybsze tempo akwizycji⁶. Długoterminowe obrazowanie po podaniu staurosporyny było rejestrowane z dłuższym odstępem (30s) między akwizycjami (Rysunki 1 D i E).

3. Przetwarzanie i analiza obrazów

1. Po zakończeniu eksperymentu uzyskane obrazy można analizować w trybie offline. Należy zdefiniować obszary zainteresowania (ROI), w których chcemy monitorować zmiany poziomu wapnia. W razie potrzeby można użyć ROI wybranego w pustym obszarze pola widzenia w celu odjęcia tła. Należy zauważyć, że mitochondria są dość ruchliwe i dynamiczne, a ekstrapolacja zdarzeń w pojedynczej mitochondriom przez dłuższe okresy nie zawsze jest możliwa. Dlatego, biorąc pod uwagę wysoką ruchliwość tego organellum w niektórych typach komórek, wybór ROI powinien być starannie monitorowany. Co więcej, jak pokazano na Rysunku 1, mitochondria reagują niejednorodnie na różne bodźce. Dlatego ważne jest, aby analizować dane w trybie offline i monitorować rozmieszczenie ROI klatka po klatce. Szczegółowy opis pomiaru wapnia mitochondrialnego w silnie ruchliwych mitochondriach został przedstawiony w innym opracowaniu⁷.
2. Uzyskane pomiary stosunku z obszarów ROI można zaimportować do programu Excel lub podobnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Dane można przedstawić jako przebieg obrazujący zmiany poziomu wapnia mitochondrialnego w pojedynczej komórce lub pojedynczej mitochondriom, lub jako uśrednione sygnały fluorescencji z kilku ROI. Technikę tę zastosowaliśmy również do pomiaru średnich poziomów wapnia mitochondrialnego w populacji limfocytów poddawanych apoptozie indukowanej ligandem Fas⁸.

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. (A) Lokalizacja subkomórkowa ratiometric-pericam-mt. Pierwszy obraz przedstawia żywą komórkę HeLa wykazującą ekspresję ratiometric-pericam-mt. Drugi obraz przedstawia barwienie fluorescencyjne z użyciem barwnika selektywnego wobec mitochondriów MitoTracker Red CMXRos. Żółta fluorescencja na obrazie scalonym wykazuje kolokalizację fluorescencji ratiometric-pericam-mt oraz MitoTracker. (B) Seria obrazów w pseudokolorach przedstawiająca stosunek (495:380 nm) w 4 komórkach HeLa wykazujących ekspresję mt-ratiometric pericam po potraktowaniu 10 mM ATP. (C) Ilościowe określenie zmian poziomu wapnia w mitochondriach w obszarze zainteresowania (ROI) wskazanym w (B) po potraktowaniu 10 mM ATP. (D) Seria obrazów w pseudokolorach przedstawiająca stosunek (495:380 nm) w komórce HeLa wykazującej ekspresję mt-ratiometric pericam po potraktowaniu 0,5 μM staurosporyny. Widoczna jest heterogeniczność odpowiedzi wapniowej w poszczególnych mitochondriach, a także znaczna fragmentacja mitochondriów w ciągu 60 minut. Niektóre mitochondria wykazują oscylacyjne wzrosty poziomu wapnia (biała grot strzałki), podczas gdy inne nie wykazują istotnych zmian poziomu wapnia (żółta grot strzałki).(E) Ilościowe określenie wzrostów globalnego poziomu wapnia w mitochondriach w pojedynczej komórce HeLa po indukcji apoptozy 0,5 μM staurosporyną.

Dyskusja

Przedstawiamy bardzo prostą metodę pomiaru wapnia mitochondrialnego przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika pericam ukierunkowanego na mitochondria. Jak pokazano na rysunku 1A, przy użyciu standardowej optyki szerokopolowej bez dekonwolucji możliwe jest łatwe zobrazowanie poszczególnych mitochondriów w komórkach HeLa z akceptowalnym stosunkiem sygnału do szumu. Wynika to z faktu, że komórki HeLa, podobnie jak większość komórek w hodowli, znacznie spłaszczają się po przytwierdzeniu, co eliminuje potrzebę stosowania mikroskopii konfokalnej lub innego specjalistycznego sprzętu. Podobne wyniki zaobserwowaliśmy w komórkach Jurkat przytwierdzonych do szkiełek podstawkowych pokrytych poli-lizyną⁸. W przeciwieństwie do metodologii wykorzystujących barwniki, możliwe jest również nieinwazyjne monitorowanie poziomów wapnia mitochondrialnego przez wiele godzin przy użyciu genetycznie zakodowanych wskaźników wapnia, takich jak ratiometryczny pericam (rysunek 1E). Jest to szczególnie istotne podczas analizy wapnia mitochondrialnego w trakcie śmierci komórki. Co więcej, możliwe jest również wizualizowanie podziału/fragmentacji mitochondriów podczas procesu apoptozy. Jak pokazano na rysunkach 1D i E, traktowanie staurosporyną powoduje powolny wzrost poziomu wapnia w wybranych subpopulacjach mitochondriów, który osiąga szczyt po 20 minutach. Poziomy wapnia ponownie spadają równolegle z fragmentacją mitochondriów, po czym ponownie rosną 2 godziny po traktowaniu. Jest to zgodne z powolnymi falami wapnia cytozolowego indukowanymi przez staurosporynę, zmierzonymi przy użyciu Fura-2⁹. Dzięki temu można uzyskać istotne informacje kinetyczne, co nie jest możliwe przy zastosowaniu metod opartych na pomiarach statycznych. Chociaż na rysunku 1 przedstawiliśmy stosunki, a nie stężenia wapnia, możliwe jest skalibrowanie sensora in situ w celu obliczenia bezwzględnych poziomów wapnia^{4, 10}. Ważnym zastrzeżeniem jest to, że ratiometryczny pericam jest wrażliwy na pH^{4, 10}. Ponieważ zarówno poziom pH w cytozolu, jak i w mitochondriach może gwałtownie zmienić się podczas apoptozy¹¹, jest to istotna kwestia. Miareczkowanie pH w izolowanych mitochondriach wykazujących ekspresję pericamu wykazuje, że zwiększenie [H⁺] zwiększa emisję pericamu przy wzbudzeniu przy 495 nm, wywierając niewielki wpływ na emisję stymulowaną wzbudzeniem przy 410 nm; właściwość ta została wykorzystana do jednoczesnego pomiaru wapnia mitochondrialnego i pH¹². Zatem selektywne monitorowanie emisji przy wzbudzeniu 410 nm umożliwia nieratiometryczne monitorowanie wapnia mitochondrialnego przy zmniejszeniu wpływu pH. Wreszcie, przedstawiony tutaj protokół wymaga jedynie dostępu do standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego z powszechnie dostępnymi filtrami, co czyni tę technikę dostępną dla większości laboratoriów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odwrócony szerokopolowy fluorescencyjny mikroskop do obrazowania wapnia	Nikon Instruments	MEA53310	Do zastosowania w tym protokole można łatwo zaadaptować każdy odwrócony mikroskop szerokopolowy wyposażony w filtry wzbudzenia 380 nm/495 nm oraz odpowiednie filtry długoprzepustowe i emisyjne.
Oprogramowanie do obrazowania	Molecular Devices	Metafluor
Komora komórkowa Attofluor	Invitrogen	A-7816	Wystarczy każda komora do obrazowania w mikroskopie odwróconym, która umożliwia perfuzję.
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	W tych badaniach odpowiednie byłyby większość odczynników/protokołów do transfekcji.
MitoTracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512