Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia

Summary

Ten protokół opisuje metodę pomiaru strumieni wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda wykorzystuje kołowo permutowany ratiometryczny czujnik wapnia oparty na YFP (ratiometric pericam-mt) selektywnie wyrażany w mitochondriach.

Abstract

Dynamiczne zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia w odpowiedzi na różne bodźce regulują wiele procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie i apoptoza¹. Podczas apoptozy akumulacja wapnia w mitochondriach sprzyja uwalnianiu czynników proapoptotycznych z mitochondriów do cytozolu². Dlatego interesujący jest bezpośredni pomiar mitochondrialnego wapnia w żywych komórkach in situ podczas apoptozy. Udowodniono, że obrazowanie fluorescencyjne w wysokiej rozdzielczości komórek obciążonych syntetycznymi barwnikami wskaźnikowymi wapnia o podwójnym wzbudzeniu ratiometrycznym i nieratiometrycznym jest niezawodnym i wszechstronnym narzędziem do badania różnych aspektów wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej. Pomiar cytozolowych strumieni wapnia przy użyciu tych technik jest stosunkowo prosty. Jednak pomiar wewnątrzmitochondrialnego poziomu wapnia w nienaruszonych komórkach przy użyciu syntetycznych wskaźników wapnia, takich jak rhod-2 i rhod-FF, jest trudniejszy. Syntetyczne wskaźniki ukierunkowane na mitochondria osłabiają reakcje na powtarzający się wzrost mitochondrialnego wapnia i zaburzają morfologię mitochondriów³. Ponadto syntetyczne wskaźniki mają tendencję do wyciekania z mitochondriów w ciągu kilku godzin, co sprawia, że nie nadają się do długotrwałych eksperymentów. W związku z tym genetycznie kodowane wskaźniki wapnia oparte na białku zielonej fluorescencji (GFP)⁴ lub aequorynie⁵ skierowanym do mitochondriów znacznie ułatwiły pomiar dynamiki mitochondriów wapnia. W tym miejscu opisujemy prostą metodę pomiaru strumieni wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na różne bodźce. Metoda opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej "ratiometric-pericam", która jest selektywnie ukierunkowana na mitochondria. Ratiometryczny perykam jest wskaźnikiem wapnia opartym na fuzji cyklicznie permutowanego białka żółtej fluorescencji i kalmoduliny⁴. Wiązanie wapnia z ratiometrycznym perykamem powoduje przesunięcie jego piku wzbudzenia z 415 nm do 494 nm, podczas gdy widmo emisyjne, które osiąga szczyt około 515 nm, pozostaje niezmienione. Ratiometryczny perykam wiąże pojedynczy jon wapnia o stałej dysocjacji in vitro wynoszącej ~1,7 μM⁴. Te właściwości ratiometrycznego perikamu pozwalają na ilościowe określenie szybkich i długoterminowych zmian w mitochondrialnym stężeniu wapnia. Ponadto opisano adaptację tej metodyki do standardowego szerokokątnego mikroskopu obrazowania wapnia z powszechnie dostępnymi zestawami filtrów. Korzystając z dwóch odrębnych agonistów, agonisty purynergicznego ATP i staurosporyny indukującej apoptozę, wykazujemy, że ta metoda jest odpowiednia do monitorowania zmian stężenia wapnia w mitochondriach z rozdzielczością czasową od kilku sekund do godzin. Ponadto wykazaliśmy również, że ratiometryczny perikam jest również przydatny do pomiaru rozszczepienia/fragmentacji mitochondriów podczas apoptozy. W związku z tym perykam ratiometryczny szczególnie dobrze nadaje się do ciągłego, długoterminowego pomiaru dynamiki mitochondrialnej wapnia podczas apoptozy.

Protocol

1. Transfekcja Pericam-mt i przygotowanie komórek.

1. Płytki z komórek HeLa w noc poprzedzającą transfekcję na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na standardowej 6-dołkowej płytce hodowlanej.
2. Przygotuj kompleksy DNA/Lipofectamine 2000 zgodnie z zaleceniami producenta (Invitrogen). Używamy 4 μg ratiometrycznego wektora ekspresyjnego pericam-mt i 10 μl Lipofectamine 2000 rozcieńczonej w 0,5 ml Opti-MEM dla każdej studzienki. Komórki powinny być zlewające się w ~70% przed transfekcją.
3. Zastąp pożywkę hodowlaną HeLa (zmodyfikowana pożywka Dulbecco, 10% FBS, penicylina/streptomycyna) w każdym dołku 1,5 ml tej samej pożywki bez antybiotyków.
4. Dodaj kompleksy DNA/lipofekcaminy do każdej studzienki, która ma być transfekowana. Delikatnie wymieszać z kołysaniem i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37^oC, 5 % CO₂ .
5. Zastąp pożywki wolne od antybiotyków pożywkami hodowlanymi antybiotykami. Pozwól komórkom na ekspresję ratiometryczną perikamka przez 1-2 dni przed obrazowaniem.

2. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu

1. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami HeLa w odpowiedniej komorze obrazowania z roztworem do obrazowania: 107mM NaCl, 7,2mM KCl, 1,2mM MgCl₂, 1mM CaCl 2,11,5mM glukozy, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 20mM HEPES 7,2. W naszym laboratorium korzystamy z komory komórkowej Attofluor firmy Invitrogen. Zamontuj komorę obrazowania w odwróconym stoliku mikroskopowym.
2. Znajdź obszar zainteresowania zawierający jedną lub więcej komórek wyrażających ratiometryczną perykam, używając obiektywu immersyjnego z olejkiem 40x (lub więcej). Odkryliśmy, że perykam ratiometryczny jest mniej odporny na fotowybielanie przy 380 nm, dlatego używamy tej długości fali do identyfikacji odpowiednich komórek. Do zdjęć wykonanych na rysunku 1 użyto obiektywu Nikon Superfluor 40X z aperturą numeryczną 1,3. Odpowiednie byłyby również obiektywy o większym powiększeniu (60-100x). Zastosowano filtry wzbudzenia Chroma Technology D380/30x (380 +/- 30 nm) i D495/10 (495 +/- 5 nm), beamsplitter to 505DCXR (505nm longpass), a filtr emisyjny to HQ535/50m (535 +/- 25nm).
   Nasz mikroskop używany do pozyskiwania obrazów na rysunku 1 składa się z odwróconego mikroskopu TE2000 firmy Nikon wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD Roper Scientific Coolsnap HQ, koło filtrowe i zmieniacz szybkich filtrów Ludl MAC6000 oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy danych MetaFluor. Protokół ten można dostosować do każdego standardowego mikroskopu szerokokątnego z odpowiednimi filtrami i oprogramowaniem zdolnym do przechwytywania i przetwarzania obrazów ratiometrycznych.
3. Skonfiguruj oprogramowanie do podwójnego wzbudzenia za pomocą filtrów 495 i 380 nm. Wiązanie wapnia z ratiometrycznym perikamem zwiększa absorbancję przy 495 nm, dlatego stosunek powinien być ustawiony na 495 nm/380 nm.
   Ratiometryczny pericam ma pik wzbudzenia bez wapnia przy 415 nm⁴. W tym protokole sugerujemy stosowanie filtra 380 nm tylko dlatego, że jest on wszechobecny w większości laboratoriów obrazowania wapnia. Jeśli dostępny jest filtr o długości fali 410 nm, preferowany jest filtr o długości fali 380 nm.
4. Rejestruj obrazy sekwencyjnie, naprzemiennie wzbudzając przy 495 i 380 nm. Uzyskaj obrazy wyjściowego poziomu wapnia przez co najmniej 30 s przed zastosowaniem agonisty za pomocą aparatu perfuzyjnego. Oznaczyć czas dodawania dla każdego agonisty. Czasy ekspozycji i interwały akwizycji powinny być zoptymalizowane, aby zapobiec fotowybielaniu, a jednocześnie zapewnić wystarczającą rozdzielczość czasową. Na przykład, w przypadku półszybkiej dynamiki wapnia monitorowanej w odpowiedzi na stymulację agonistyczną, obrazy były rejestrowane co dwie sekundy na rycinach 1B i C. Możliwe są również znacznie szybsze tempo pozyskiwania⁶. Obrazowanie długoterminowe po podaniu staurosporyny uzyskano w dłuższym odstępie czasu (30 s) między pobraniami (ryc. 1 D i E).

3. Przetwarzanie i analiza obrazu

1. Po zakończeniu eksperymentu uzyskane obrazy można analizować w trybie offline. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI), w których chcesz monitorować zmiany poziomu wapnia. Użyj ROI wybranego w pustym obszarze pola, aby w razie potrzeby odjąć tło. Należy zauważyć, że mitochondria są dość ruchliwe i dynamiczne, a ekstrapolacja zdarzeń w pojedynczym mitochondrium przez dłuższy czas nie zawsze jest możliwa. Tak więc, biorąc pod uwagę wysoką ruchliwość tej organelli w niektórych typach komórek, wybór ROI powinien być uważnie monitorowany. Ponadto, jak wykazano na rycinie 1, mitochondria reagują niejednorodnie na różne bodźce. Dlatego ważne jest, aby analizować dane w trybie offline i monitorować rozmieszczenie RO1 klatka po klatce. Szczegółowy opis pomiaru mitochondrialnego wapnia w mitochondriach o wysokiej ruchliwości został opisany w innym miejscu⁷.
2. Uzyskane pomiary wskaźników z ROI można zaimportować do Excela lub podobnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Dane można przedstawić jako ślad reprezentujący zmiany poziomu wapnia w mitochondriach w pojedynczej komórce lub pojedynczym mitochondrium lub uśrednione sygnały fluorescencyjne z kilku ROI. Wykorzystaliśmy również tę technikę do pomiaru średniego poziomu wapnia w mitochondriach w populacji limfocytów poddawanych apoptozie indukowanej przez ligand^{Fas 8}.

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. (A) Subkomórkowa lokalizacja ratiometryczno-pericam-mt. Ten pierwszy obraz pokazuje żywą komórkę HeLa wyrażającą ratiometric-pericam-mt. Drugi obraz przedstawia barwienie fluorescencyjne barwnikiem selektywnym mitochondrycznie MitoTracker Red CMXRos. Żółta fluorescencja na scalonym obrazie wykazuje kolokalizację fluorescencji ratiometric-pericam-mt i MitoTracker. (B) Seria obrazów o pseudoproporcjach kolorów (495:380 nm) 4 komórek HeLa wykazujących ekspresję mt-ratiometrycznej perykamki traktowanej 10 mM ATP. (C) Kwantyfikacja zmian poziomu wapnia w mitochondriach w regionie zainteresowania (ROI) wskazanym w (B) traktowanym 10 mM ATP. (D) Seria obrazów o pseudoproporcjach kolorów (495:380 nm) komórki HeLa z ekspresją mt-ratiometryczną perykamu traktowaną staurosporyną 0,5 μM. Widoczna jest niejednorodność odpowiedzi wapniowej w poszczególnych mitochondriach, a także znaczna fragmentacja mitochondriów o 60 minut. Niektóre mitochondria mają oscylacyjny wzrost wapnia (biała strzałka), podczas gdy inne nie wykazują znaczących zmian poziomu wapnia (żółty grot strzałki). (E) Kwantyfikacja wzrostu globalnego poziomu wapnia w mitochondriach w pojedynczej komórce HeLa po indukcji apoptozy za pomocą 0,5 μM staurosporyny.

Discussion

Tutaj przedstawiamy bardzo prostą metodę pomiaru mitochondrialnego wapnia za pomocą wskaźnika proporcjometrycznego pericam ukierunkowanego na mitochondria. Jak pokazano na rysunku 1A, przy użyciu standardowej optyki szerokokątnej bez dekonwolucji możliwe jest łatwe oglądanie pojedynczych mitochondriów w komórkach HeLa z akceptowalnym stosunkiem sygnału do szumu. Dzieje się tak, ponieważ komórki HeLa, podobnie jak większość komórek w hodowli, znacznie się spłaszczają, gdy przylegają, eliminując potrzebę mikroskopii konfokalnej lub innego specjalistycznego sprzętu. Podobne wyniki uzyskaliśmy w komórkach Jurkata przylegających do szkiełek nakrywkowych pokrytych polilizyną⁸. W przeciwieństwie do metodologii wykorzystujących barwniki, możliwe jest również nieinwazyjne monitorowanie poziomu wapnia w mitochondriach przez wiele godzin przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak wskaźnikowy perikam (ryc. 1E). Jest to szczególnie ważne podczas analizy mitochondrialnego wapnia podczas śmierci komórki. Ponadto możliwa jest również wizualizacja rozszczepienia/fragmentacji mitochondriów podczas procesu apoptozy. Jak pokazano na rysunkach 1D i E, leczenie staurosporyną powoduje powolny wzrost wapnia w wybranych subpopulacjach mitochondriów, który osiąga szczyt po 20 minutach. Poziom wapnia ponownie spada wraz z fragmentacją mitochondriów, a następnie ponownie wzrasta 2 godziny po zabiegu. Jest to zgodne z wolnymi falami cytozolowego wapnia wywołanymi przez leczenie staurosporyną, mierzonymi przy użyciu Fura-2⁹. W ten sposób można uzyskać ważne informacje kinetyczne, co nie jest możliwe przy użyciu metod wykorzystujących pomiary statyczne. Chociaż na rysunku 1 przedstawiliśmy proporcje, a nie stężenia wapnia, możliwe jest skalibrowanie czujnika in situ w celu obliczenia bezwzględnego poziomu wapnia^{4, 10}. Jednym z ważnych zastrzeżeń do rozważenia jest to, że perykam ratiometryczny jest wrażliwy na pH^{4, 10}. Ponieważ zarówno poziom pH cytozolowego, jak i mitochondrialnego może się dramatycznie zmienić podczas apoptozy¹¹, jest to ważna kwestia. Miareczkowanie pH w izolowanych mitochondriach wykazujących ekspresję perykamu pokazuje, że zwiększenie [H⁺] zwiększa emisję perykamu po wzbudzeniu przy 495 nm, przy niewielkim wpływie na emisję stymulowaną przez wzbudzenie przy 410 nm, właściwość, która została wykorzystana do jednoczesnego pomiaru zarówno mitochondrialnego wapnia, jak i pH¹². Tak więc selektywne monitorowanie emisji ze wzbudzeniem 410 nm zapewnia środki do nieratiometrycznego monitorowania mitochondrialnego wapnia przy zmniejszonej trosce o pH. Wreszcie, przedstawiony tutaj protokół wymaga jedynie dostępu do standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego z powszechnie dostępnymi filtrami, dzięki czemu technika ta jest dostępna dla większości laboratoriów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odwrócony fluorescencyjny mikroskop do obrazowania wapnia o szerokim polu	widzenia Nikon Instruments	MEA53310	Każdy odwrócony mikroskop szerokokątny wyposażony w filtry wzbudzenia 380 nm/495 nm oraz odpowiedni filtr długoprzepustowy i emisyjny można łatwo dostosować do korzystania z tego protokołu.
Oprogramowanie do obrazowania	Urządzenia molekularne	Metafluor
Komora komórkowa Attofluor	Invitrogen	A-7816	Wystarczy dowolna komora obrazowania do mikroskopu odwróconego, która umożliwia perfuzję.
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Większość odczynników/protokołów transfekcji byłaby odpowiednia dla tych badań
MitoTracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512