Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i obrazowania w trzech wymiarach tkanki mózgowej zatopionej w żywicy przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania próbek biologicznych, takich jak tkanka mózgowa, w trzech wymiarach przy użyciu skupionej wiązki jonów i skaningowego mikroskopu elektronowego (FIB/SEM). Próbki utrwalane są aldehydami, a następnie barwione metalami ciężkimi przy użyciu czwartotlenku osmu i octanu uranylu. Następnie poddawane są odwodnieniu alkoholem oraz infiltracji żywicą, która jest następnie utwardzana. Przy użyciu mikroskopu świetlnego i ultramikrotomu z nożami szklanymi przygotowywany jest niewielki blok zawierający obszar zainteresowania znajdujący się blisko powierzchni. Blok ten umieszcza się w FIB/SEM, a następnie za pomocą wiązki jonów wykonuje się wstępne frezowanie pionowej płaszczyzny wzdłuż jednej strony bloku, w pobliżu tego obszaru. Wykorzystując elektrony wstecznie rozproszone do obrazowania struktur pod powierzchnią, frezowana jest mniejsza płaszczyzna za pomocą cieńszej wiązki jonów, a powierzchnia jest dokładniej analizowana w celu ustalenia dokładnego obszaru płaszczyzny do obrazowania i frezowania. Parametry mikroskopu są następnie ustawione tak, aby płaszczyzna była wielokrotnie frezowana i obrazowana, co pozwala na gromadzenie obrazów seryjnych z całej objętości bloku. Stos obrazów zazwyczaj zawiera izotropowe woksele o wymiarach tak małych jak 4 nm w każdym kierunku. Taka jakość obrazu w dowolnej płaszczyźnie obrazowania umożliwia użytkownikowi analizę ultrastruktury komórek pod dowolnym kątem widzenia w obrębie stosu obrazów.

Protokół

1. Fixacja próbek i zatapianie w żywicy

1. Próbki świeżej tkanki i komórek utrwala się przez co najmniej 2 godziny w 2% paraformaldehydzie i 2,5% glutaraldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Grubość próbki nie powinna przekraczać 0,150 mm, aby umożliwić odpowiednią penetrację utrwalacza; nie należy pozostawiać próbek w utrwalaczu dłużej niż przez 12 godzin.
2. Próbki umieszcza się w szklanych fiolkach scyntylacyjnych o pojemności 20ml i płucze trzy razy, po 5 minut każdorazowo, w 0,1M buforze kakodylanowym.
3. Barwi się próbki 1,5% (w/v) ferrocyjankiem potasu i 1% (w/v) czwutlenkiem osmu w 0,1 M buforze kakodylanowym (0,1 M, pH 7,4) przez 30 minut.
4. Barwi się próbki 1,0% (w/v) czwutlenkiem osmu w 0,1M buforze kakodylanowym przez 30 minut.
5. Płucze się raz w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 3 minuty.
6. Barwi się próbki 1% (w/v) octanem uranylu w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 30 minut.
7. Sekcje płucze się przez 5 minut w wodzie dwukrotnie destylowanej, a następnie odwadnia w szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu, po 2 minuty na każdą zmianę (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%).
8. Zatapia się próbki w rosnących stężeniach żywicy Durcupan zmieszanej z etanolem, po 30 minut na każdą zmianę, zaczynając od 50% Durcupanu w etanolu, a następnie: 70%, 90%, 95% i 100%.
9. Wymienia się medium na świeżą żywicę Durcupan i miesza powoli przez 4 godziny.
10. Sekcje, używając drewnianych wykałaczek, układa się na szklanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych środkiem oddzielającym od formy i umieszcza w piekarniku w temperaturze 65° C na 24 godziny.

2. Przygotowanie próbki do FIB/SEM

11. Oddzielić warstwę żywicy zawierającą próbki z przestrzeni między dwiema szklanymi płytkami mikroskopowymi i dokładnie wypłukać, aby usunąć pozostałości środka rozdzielającego formę.
12. Użyć mikroskopu świetlnego w świetle przechodzącym z obiektywami małego powiększenia lub mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem przechodzącym, aby zidentyfikować obszar zainteresowania w plastrze żywicy.
13. Wyciąć mały kwadrat (3 mm x 3 mm) wokół obszaru zainteresowania za pomocą żyletki i przykleić go do góry pustego bloku żywicy za pomocą kleju akrylowego (Rysunek 1). Odczekać 5 minut do utwardzenia kleju, a następnie przejść do następnego kroku.
14. Zz clampować blok w uchwycie ultramikrotomu i, korzystając z dołączonego mikroskopu stereoskopowego, przyciąć obszar zainteresowania żyletką, aż pozostanie jedynie niewielka piramida materiału.
15. Dalej przycinać blok, używając noża szklanego zamocowanego w ultramikrotomie, tak aby obszar zainteresowania można było precyzyjnie zlokalizować względem wymiarów powierzchni bloku (Rysunek 1). Odciąć jedną krawędź bloku, blisko obszaru zainteresowania, tak aby w próbce wykonano prostopadły stopień (Rysunek 1 i 2). Stopień ten tworzy powierzchnię obrazowania (Rysunek 2).
16. Wyjąć blok z ultramikrotomu i sfotografować obszar zainteresowania w bloku, używając mikroskopu świetlnego w świetle przechodzącym.
17. Odciąć przyciężty blok od pozostałego kikuta żywicy. Należy to zrobić za pomocą piłki jubilerskiej, co zapewni umieszczenie w FIB/SEM jedynie małego bloku. Całkowita wysokość tego bloku nie powinna przekraczać 5 mm.
18. Przykleić blok do aluminiowego kikuta za pomocą pasty węglowej, upewniając się, że strona przeznaczona do obrazowania znajduje się na zewnętrznej krawędzi (Rysunek 1).
19. Po wyschnięciu kleju pokryć blok cienką warstwą złota (> 20 nm; system naparowania próżniowego Cressington).

3. Obrazowanie w FIB/SEM

20. Przy niskim powiększeniu, korzystając z obrazowania elektronami wtórnymi (5 kV, 0,5 nAmp), ustaw blok tak, aby wybrany obszar zainteresowania i bok bloku, który ma być obrazowany, były skierowane w stronę operatora (Rysunek 2 c, d).
21. Ustaw blok tak, aby powierzchnia do obrazowania leżała równolegle do wiązki trawiącej. Oznacza to, że wiązka elektronów będzie skierowana pod kątem 54 ° do tej powierzchni (Rysunek 2 b).
22. Przy użyciu prądu wiązki jonowej 13 - 27 nAmps przy 30 kV usuń wąski pas żywicy z przedniej części obszaru, który ma być obrazowany.
23. Przełącz na tryb obrazowania elektronami wstecznie rozproszonymi, aby obejrzeć wytrawioną powierzchnię znajdującą się nad obszarem zainteresowania.
24. Korzystając z referencyjnego obrazu z mikroskopii świetlnej (wykonanego w kroku 16) oraz obrazu wytrawionej powierzchni, zlokalizuj dokładny obszar na bloku, który ma zostać wytrawiony i obrazowany (Rysunek 2).
25. Za pomocą systemu wtrysku gazowego mikroskopu nanieś na powierzchnię bloku, powyżej obszaru zainteresowania, ochronną warstwę węgla (lub metalu) o grubości około 1 mikrona (Rysunek 2).
26. Przy użyciu prądu 700 picoAmps precyzyjnie wytraw obszar bloku, w którym zostaną wykonane końcowe obrazy.
27. Pozostaw wiązkę trawiącą do całkowitego wytrawienia tej powierzchni obrazowania, aż na powierzchni nie będą widoczne żadne artefakty trawienia. Całkowite wytrawienie powierzchni sprawdza się, obserwując zmiany w każdym kolejnym obrazie w całym polu widzenia. Niedostateczne trawienie może objawiać się jako białe smugi lub „kurtyny” pojawiające się pionowo na obrazie.
28. Pozostaw mikroskop na co najmniej 2 godziny, aby wszelkie zmiany termiczne ustąpiły. Zmniejsza to ryzyko dryfu powierzchni bloku podczas obrazowania, co mogłoby skutkować przesunięciem obrazów.
29. Wybierz parametry mikroskopu do seryjnego obrazowania powierzchni. Upewnij się, że napięcie wiązki elektronów jest na tyle niskie, aby obrazować tylko bardzo płytką warstwę materiału w powierzchni bloku. Powinno to być również znacznie płycej niż grubość usuwanej powierzchni. Typowe parametry obrazowania to napięcia od 1,2 - 2,0 kV przy rozmiarach piksela od 4 - 20 nm. Czas przebywania wiązki na pikselu powinien wynosić około 10 μsecs, aby całkowity czas wytrawienia powierzchni i pozyskania jednego obrazu nie przekraczał 2 minut (Rysunek 3).

4. Klucze do sukcesu

Krok 1) Należy upewnić się, że próbki nie są grubsze niż 150 micronów. Pozwoli to na odpowiednią penetrację różnych barwników i żywicy w głąb materiału. Można to osiągnąć poprzez krojenie próbek w wibrotomie bezpośrednio po fiksacji. Taka grubość jest odpowiednia dla tkanki mózgowej. W przypadku innych tkanek należy przeprowadzić testy, aby zapewnić odpowiednią fiksację i barwienie.

Krok 3) Próbki muszą być swobodnie rozmieszczone w całym roztworze i nie mogą skupiać się w jednej części fiolki podczas wprowadzania tego wtórnego utrwalacza. Zapewni to maksymalną penetrację próbki i zmniejszy ryzyko jej zniekształcenia podczas procesu utrwalania. Osiąga się to poprzez delikatne zamieszanie próbek w fiolce bezpośrednio po dodaniu roztworu.

Krok 15) Upewnij się, że obszar zainteresowania znajduje się bezpośrednio poniżej (< 30 mikronów) powierzchni bloku. Pozwoli to zmniejszyć zakres trawienia wiązką jonową podczas fazy akwizycji obrazu.

Krok 22) Czas skanowania wiązki jonowej musi być odpowiedni, aby zapewnić całkowite wytrawienie całej powierzchni obrazowania. Niedostateczne wytrawienie objawi się w postaci białych smug lub „kurtyn” pojawiających się pionowo na powierzchni obrazowania.

Krok 26) Końcowa frezowana powierzchnia musi być większa od powierzchni obrazowanej. Wynika to z faktu, że usunięta żywica zostaje wyrzucona z bloku i ponownie osadza się na jego powierzchni w bezpośrednim sąsiedztwie. Ponowne osadzanie to może nachodzić na pole widzenia obrazowania, czego można uniknąć, frezując znacznie większy obszar niż ten, który jest obrazowany. Dla okna obrazowania o szerokości 20 µm, frezowana powierzchnia bloku powinna mieć szerokość większą niż 30 µm.

Krok 29) Kluczowe jest, aby parametry wiązki elektronów były tak dobrane, by obraz był generowany przez elektrony uwalniane jedynie z pierwszych kilku nanometrów powierzchni bloku. Osiąga się to poprzez zminimalizowanie napięcia poniżej 2 kV, co zapobiega zbyt głębokiej penetracji elektronów. Pomocne jest również zastosowanie napięcia siatki na detektorze, dzięki czemu do końcowego obrazu przyczyniają się tylko elektrony o najwyższych energiach. Typowo, przy napięciu obrazowania 1.5 kV, stosuje się napięcie siatki wynoszące 1.3 kV.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Przygotowanie bloku żywicznego. a) Przekrój wieńcowy mózgu dorosłego szczura zatopiony w żywicy (grubości 80 mikronów) oglądany w stereomikroskopie. Obraz wyraźnie pokazuje różne obszary mózgu, które można wyciąć z przekroju (b) za pomocą ostrza skalpela. Tutaj wycinany jest kwadrat o boku 1 mm z kory i (c) przyklejany do pustego bloku żywicznego. d) Blok żywiczny jest następnie przycinany nożem szklanym zamontowanym w ultramikrotomie, a po zredukowaniu bloku tak, aby pozostał jedynie obszar zainteresowania (e), wycina się stopień prostopadle do przedniej powierzchni zatopionego materiału. f) Cały ten przycięty obszar jest następnie wycinany z reszty żywicy i montowany na aluminiowym stubie, gotowym do napylania metalem i obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym.

Rysunek 2. Przygotowanie powierzchni bloku do obrazowania FIB/SEM. a) i b) przedstawiają ilustracje bloku oraz krawędzi, która jest trawiona w celu utworzenia powierzchni obrazowania (wskazanej czarną strzałką dwukierunkową). Pozycja wiązki jonowej (biała) jest pokazana równolegle do powierzchni obrazowania, a wiązka elektronowa (szara) uderza w powierzchnię pod kątem 54° względem wiązki jonowej. c) pokazuje widok bloku uzyskany za pomocą wiązki elektronowej i obrazowany za pomocą elektronów wtórnych. Wzdłuż tej strony bloku ciemniejszy obszar (wskazany przerywanym białym prostokątem) przedstawia fragment powierzchni, która została wstępnie wytrawiona (wskazana czarną strzałką dwukierunkową), aby odsłonić leżącą pod nią próbkę. d) Gdy ten obszar jest obrazowany przy użyciu wyłącznie elektronów wstecznie rozproszonych, widoczna jest zatopiona tkanka. Tutaj pełna szerokość sekcji tkanki zatopionej jest zaznaczona białą strzałką dwukierunkową. Pasek skali na c) wynosi 100 microns.

Rysunek 3. Obrazowanie objętości tkanki mózgowej z izotropowymi wokselami. a) Obraz rozproszonego światła z odwróconym kontrastem powierzchni bloku, przedstawiający ultrastrukturę w obrębie regionu mózgu szczura. Widoczne są wszystkie membrany, jak również duże struktury makromolekularne. b) Zebrano łącznie 1600 obrazów w odstępach 5 nm, co pozwoliło na uzyskanie stosu obrazów z izotropowymi wokselami. c) Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z taką samą rozdzielczością. Obraz ten przedstawia pojedyncze połączenie synaptyczne obrazowane w płaszczyźnie x y oraz płaszczyźnie y z.

Dyskusja

Technika FIB/SEM działa optymalnie, gdy obszar zainteresowania nie jest zbyt duży. Górna granica obrazowanej objętości zależy od wiązki jonowej i obszaru, który można konsekwentnie i wielokrotnie trawić przez wiele godzin. Do tej pory osiągnięto to dla obszarów o wymiarach około 60 x 60 mikronów, jednak obrazowanie całego tego obszaru z odpowiednią rozdzielczością nie jest możliwe, głównie ze względu na czas potrzebny na zarejestrowanie tak dużego obrazu. Przykładowo, pozyskanie obrazu 4 k x 4 k przy czasie przebywania piksela 10 mikrosekund zajęłoby 2 minuty i 40 sekund, co przy polu widzenia 60 mikronów dałoby rozmiar piksela wynoszący zaledwie 15 nm. Do obrazowania ultrastruktury komórek i tkanek bardziej odpowiedni jest mniejszy rozmiar piksela, zazwyczaj między 4 a 10 nm / piksel. Dla obszaru 60 x 60 mikronów obraz byłby pozyskiwany przez 10 godzin, nawet gdyby mikroskop posiadał taką możliwość. Z tych powodów mikroskop ten jest idealnym narzędziem do obrazowania objętości rzędu 10 x 10 x 10 mikronów lub istotnych fragmentów całych komórek. Można to łatwo zrealizować w ciągu 48 godzin na próbkach, które wykazują dobry kontrast przy zastosowaniu tej procedury.

Do tej pory protokół ten był stosowany głównie w przypadku tkanki mózgowej, a także różnych typów hodowlanych komórek ssaków przylegających do szkiełek podstawowych. Niemniej jednak procedura fiksacji i barwienia może być wykorzystana w wielu innych typach materiału biologicznego, w tym materiału roślinnego, w celu uzyskania stosów obrazów o równie dobrym kontraście.

Zatem główną zaletą tej techniki jest możliwość obrazowania objętości z izotropowymi wokselami. Stosy obrazów tego typu pozwalają na analizę objętości 3D przy użyciu obrazów pobranych z dowolnej płaszczyzny stosu. Korzyścią z tego rozwiązania jest umożliwienie obserwatorowi obrazowania cech w serii obrazów z dowolnego kierunku oraz zapewnienie większej szczegółowości obrazu (Rycina 3).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klej cyjanoakrylowy
Mikroskop stereoskopowy: Leica MZ8	Leica Microsystems
żywica Durcupan	Sigma-Aldrich
mikroskop FIB/SEM (Zeiss, NVision 40)
Szkiełka histologiczne	Menzel-Glaser	AA00008032E
Urządzenie do wycinania noży szklanych: Leica EM KMR2	Leica Microsystems
Szklane fiolki scyntylacyjne (20 ml)	EMS	72634
Glutaraldehyd	EMS	16222
Jubiler’piła tarczowa	EMS	72010
Środek rozdzielający do form	Glorex, Szwajcaria	62407445
Tetrotlenek osmu	EMS	19110
Paraformaldehyd	EMS	RT 19208
Sole fosforanowe do buforu fosforanowego	Sigma-Aldrich	71642 i 71496
Kacodylan sodu	Sigma-Aldrich	20840
Sputter coater z tarczą złota	Cressington Co.
bufor Tris (TBS)	Sigma-Aldrich	T1378
Ultramikrotom: Leica UCT	Leica Microsystems
Octan uranylu	EMS	RT 22451