Frezowanie wiązką jonową (FIB) i skaningowa mikroskopia elektronowa tkanki mózgowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i obrazowania w trzech wymiarach tkanki mózgowej zatopionej w żywicy przy użyciu skupionej wiązki jonów oraz skaningowego mikroskopu elektronowego.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania próbek biologicznych, takich jak tkanka mózgowa, w trzech wymiarach przy użyciu skupionej wiązki jonów i skaningowego mikroskopu elektronowego (FIB/SEM). Próbki utrwalane są aldehydami, a następnie barwione metalami ciężkimi przy użyciu czwartotlenku osmu i octanu uranylu. Następnie poddawane są odwodnieniu alkoholem oraz infiltracji żywicą, która jest następnie utwardzana. Przy użyciu mikroskopu świetlnego i ultramikrotomu z nożami szklanymi przygotowywany jest niewielki blok zawierający obszar zainteresowania znajdujący się blisko powierzchni. Blok ten umieszcza się w FIB/SEM, a następnie za pomocą wiązki jonów wykonuje się wstępne frezowanie pionowej płaszczyzny wzdłuż jednej strony bloku, w pobliżu tego obszaru. Wykorzystując elektrony wstecznie rozproszone do obrazowania struktur pod powierzchnią, frezowana jest mniejsza płaszczyzna za pomocą cieńszej wiązki jonów, a powierzchnia jest dokładniej analizowana w celu ustalenia dokładnego obszaru płaszczyzny do obrazowania i frezowania. Parametry mikroskopu są następnie ustawione tak, aby płaszczyzna była wielokrotnie frezowana i obrazowana, co pozwala na gromadzenie obrazów seryjnych z całej objętości bloku. Stos obrazów zazwyczaj zawiera izotropowe woksele o wymiarach tak małych jak 4 nm w każdym kierunku. Taka jakość obrazu w dowolnej płaszczyźnie obrazowania umożliwia użytkownikowi analizę ultrastruktury komórek pod dowolnym kątem widzenia w obrębie stosu obrazów.

Protokół

1. Fixacja próbek i zatapianie w żywicy

1. Próbki świeżej tkanki i komórek utrwalono przez co najmniej 2 godziny w 2% paraformaldehydzie i 2,5% glutaraldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Grubość próbki nie powinna przekraczać 0,150 mm, aby umożliwić odpowiednią penetrację utrwalacza; nie należy pozostawiać próbek w utrwalaczu dłużej niż przez 12 godzin.
2. Próbki umieszczono w 20 ml szklanych fiolkach do scyntylacji i przepłukano trzykrotnie, po 5 minut każdorazowo, w 0,1 M buforze kakodylanowym.
3. Barwienie przeprowadzono przy użyciu 1,5% (w/v) ferryjanku potasu i 1% (w/v) tetrautlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanowym (0,1 M, pH 7,4) przez 30 minut.
4. Barwienie przeprowadzono przy użyciu 1,0% (w/v) tetrautlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanowym przez 30 minut.
5. Jednorazowo przepłukano wodą dwukrotnie destylowaną przez 3 minuty.
6. Barwienie przeprowadzono przy użyciu 1% (w/v) octanu uranylu w wodzie dwukrotnie destylowanej przez 30 minut.
7. Przekroje przepłukano przez 5 minut w wodzie dwukrotnie destylowanej, a następnie odwodniono w serii alkoholi o rosnącym stężeniu, zmieniając roztwór co 2 minuty (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%).
8. Zatopiono w rosnących stężeniach żywicy Durcupan zmieszanej z etanolem, zmieniając roztwór co 30 minut, zaczynając od 50% Durcupan w etanolu, a następnie: 70%, 90%, 95% i 100%.
9. Wymieniono medium na świeżą żywicę Durcupan i powoli mieszano przez 4 godziny.
10. Za pomocą drewnianych wykałaczek przeniesiono przekroje na szklane szkiełka mikroskopowe pokryte środkiem oddzielającym od formy i umieszczono w piecu w temperaturze 65° C na 24 godziny.

2. Przygotowanie próbki do FIB/SEM

11. Oddzielić warstwę żywicy zawierającą próbki od dwóch szkiełek przedmiotowych i dokładnie wypłukać, aby usunąć pozostałości środka rozdzielającego formy.
12. Użyć mikroskopu światła przechodzącego z obiektywami o małym powiększeniu lub mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem przechodzącym, aby zidentyfikować obszar zainteresowania w plastrze żywicy.
13. Wyciąć mały kwadrat (3 mm x 3 mm) wokół obszaru zainteresowania za pomocą żyletki i przykleić go do góry pustego bloku żywicznego klejem akrylowym (Rysunek 1). Odczekać 5 minut do stwardnienia kleju, a następnie przejść do następnego kroku.
14. Zacisnąć blok w uchwycie ultramikrotomu i, korzystając z dołączonego stereomikroskopu, przyciąć materiał wokół obszaru zainteresowania za pomocą żyletki, aż pozostanie jedynie mała piramida materiału.
15. Dalszo przyciąć blok za pomocą noża szklanego zamocowanego w ultramikrotomie, tak aby obszar zainteresowania można było precyzyjnie zlokalizować względem wymiarów powierzchni bloku (Rysunek 1). Wyciąć jedną krawędź bloku, blisko obszaru zainteresowania, tak aby przez próbkę przebiegał prostopadły stopień (Rysunek 1 i 2). Stopień ten tworzy powierzchnię obrazowania (Rysunek 2).
16. Wyjąć blok z ultramikrotomu i sfotografować obszar zainteresowania wewnątrz bloku, używając mikroskopu światła przechodzącego.
17. Odciąć przyciętym blok od pozostałego trzpienia żywicznego. Należy to zrobić za pomocą piłki jubilerskiej, aby upewnić się, że do FIB/SEM zostanie wprowadzony jedynie mały blok. Całkowita wysokość tego bloku nie powinna przekraczać 5 mm.
18. Przykleić blok do aluminiowego trzpienia pastą węglową, dbając o to, aby strona przeznaczona do obrazowania znajdowała się na zewnętrznej krawędzi (Rysunek 1).
19. Po wyschnięciu kleju pokryć blok cienką warstwą złota (> 20 nm; system naparowy Cressington).

3. Obrazowanie w FIB/SEM

20. Przy niskim powiększeniu, korzystając z obrazowania elektronów wtórnych ( 5 kV, 0,5 nAmp), ustaw bloczek tak, aby wybrany obszar zainteresowania i bok bloczka przeznaczony do obrazowania były zwrócone w stronę operatora (Rycina 2 c, d).
21. Ustaw bloczek tak, aby powierzchnia przeznaczona do obrazowania leżała równolegle do wiązki trawiącej. Oznacza to, że wiązka elektronów będzie zorientowana pod kątem 54 ° do tej powierzchni (Rycina 2 b).
22. Używając prądu wiązki jonowej 13 - 27 nAmps przy 30 kV, usuń wąski pas żywicy z przodu obszaru przeznaczonego do obrazowania.
23. Przełącz na tryb obrazowania elektronów wstecznie rozproszonych, aby zobaczyć wytrawioną powierzchnię nad obszarem zainteresowania.
24. Korzystając z referencyjnego obrazu z mikroskopii świetlnej (wykonanego w kroku 16) oraz obrazu wytrawionej powierzchni, zlokalizuj dokładny obszar na bloczku, który ma zostać wytrawiony i obrazowany (Rycina 2).
25. Za pomocą systemu wtrysku gazowego mikroskopu nanieś warstwę ochronną (o grubości około 1 mikrona) węgla (lub metalu) na powierzchnię bloczka nad obszarem zainteresowania (Rycina 2).
26. Używając prądu 700 picoAmps, precyzyjnie wytraw obszar bloczka, w którym zostaną wykonane końcowe obrazy.
27. Pozostaw wiązkę trawiącą do całkowitego wytrawienia tej powierzchni obrazowania, aż na powierzchni nie będą widoczne żadne artefakty trawienia. Całkowite wytrawienie powierzchni sprawdza się, obserwując zmiany na każdym kolejnym obrazie w całym polu widzenia. Niedostateczne trawienie może objawiać się jako białe smugi lub „kurtyny” pojawiające się pionowo na obrazie.
28. Pozostaw mikroskop na co najmniej 2 godziny, aby wszelkie zmiany termiczne uległy rozproszeniu. Zmniejsza to ryzyko dryftu powierzchni bloczka podczas obrazowania, co mogłoby skutkować przesunięciem obrazów.
29. Wybierz parametry mikroskopu do seryjnego obrazowania powierzchni. Upewnij się, że napięcie wiązki elektronów jest wystarczająco niskie, aby obrazować jedynie bardzo płytką warstwę materiału na powierzchni bloczka. Powinno to być również znacznie płycej niż grubość warstwy przeznaczonej do usunięcia. Typowe parametry obrazowania to napięcia od 1,2 - 2,0 kV przy rozmiarach piksela od 4 - 20 nm. Czas przebywania wiązki na pikselu powinien wynosić około 10 μsecs, aby całkowity czas wytrawienia powierzchni i pozyskania jednego obrazu nie przekroczył 2 minut (Rycina 3).

4. Klucze do sukcesu

Krok 1) Należy upewnić się, że próbki nie są grubsze niż 150 micronów. Umożliwi to odpowiednią penetrację różnych barwników i żywicy w głąb materiału. Można to osiągnąć poprzez cięcie próbek w wibrotomie bezpośrednio po utrwaleniu. Taka grubość jest odpowiednia dla tkanki mózgowej. W przypadku innych tkanek konieczne jest przeprowadzenie testów w celu zapewnienia prawidłowego utrwalenia i barwienia.

Krok 3) Podczas wprowadzania tego wtórnego utrwalacza próbki muszą być swobodnie rozłożone w całym roztworze, a nie skupione w jednej części fiolki. Zapewni to maksymalną penetrację próbki i ograniczy ryzyko jej zniekształcenia podczas procesu utrwalania. Osiąga się to poprzez delikatne zamieszanie próbek w fiolce bezpośrednio po dodaniu roztworu.

Krok 15) Upewnij się, że obszar zainteresowania znajduje się bezpośrednio poniżej (< 30 micronów) powierzchni bloku. Pozwoli to ograniczyć zakres trawienia wiązką jonową podczas fazy akwizycji obrazu.

Krok 22) Czas skanowania wiązki jonowej musi być odpowiedni, aby zapewnić całkowite wytrawienie całej powierzchni obrazowania. Niewystarczające wytrawienie objawi się w postaci białych smug lub „kurtyn” przebiegających pionowo w dół powierzchni obrazowania.

Krok 26) Końcowa sfrezowana powierzchnia musi być większa od powierzchni obrazowanej. Wynika to z faktu, że sfrezowana żywica jest wyrzucana z bloku i ponownie osadza się na jego powierzchni w bezpośrednim sąsiedztwie. Ponowne osadzenie to może naruszyć pole widzenia obrazowania, czego można uniknąć, frezując obszar znacznie większy niż ten, który jest obrazowany. W przypadku okna obrazowania o szerokości 20 µm, szerokość sfrezowanej powierzchni bloku powinna przekraczać 30 µm.

Krok 29) Kluczowe jest, aby parametry wiązki elektronów były tak dobrane, by obraz był generowany przez elektrony pochodzące z zaledwie kilku pierwszych nanometrów powierzchni bloku. Osiąga się to poprzez zminimalizowanie napięcia poniżej 2 kV, co zapobiega zbyt głębokiej penetracji elektronów. Pomocne jest również zastosowanie napięcia siatki na detektorze, dzięki czemu do końcowego obrazu przyczyniają się tylko elektrony o najwyższych energiach. Typowo, dla napięcia obrazowania 1,5 kV, stosuje się napięcie siatki 1,3 kV.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Przygotowanie bloku żywicznego. a) Przekrój koronowy mózgu dorosłego szczura zatopiony w żywicy (grubość 80 mikronów) oglądany w stereomikroskopie. Obraz wyraźnie pokazuje różne obszary mózgu, które można wyciąć z przekroju (b) za pomocą ostrza skalpela. W tym przypadku wycinany jest kwadrat o boku 1 mm z kory mózgowej, a następnie (c) przyklejany do pustego bloku żywicznego. d) Blok żywiczny jest następnie przycinany nożem szklanym zamontowanym w ultramikrotomie, a po zredukowaniu bloku tak, aby pozostał jedynie obszar zainteresowania (e), wycina się stopień prostopadle do przedniej powierzchni zatopionego materiału. f) Cały przycięty obszar zostaje następnie wycięty z pozostałej części żywicy i zamocowany na aluminiowym stubie, przygotowany do napylania metalem i obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym.

Rysunek 2. Przygotowanie powierzchni bloku do obrazowania FIB/SEM. a) i b) przedstawiają ilustracje bloku oraz krawędzi, która jest frezowana w celu utworzenia powierzchni obrazowania (oznaczonej czarną strzałką dwustronną). Położenie wiązki jonowej (biała) pokazano równolegle do powierzchni obrazowania, a wiązka elektronowa (szara) uderza w powierzchnię pod kątem 54° względem wiązki jonowej. c) przedstawia widok bloku uzyskany za pomocą wiązki elektronowej i obrazowany z wykorzystaniem elektronów wtórnych. Wzdłuż tej strony bloku ciemniejszy obszar (oznaczony przerywaną białą ramką) pokazuje fragment powierzchni, który został wstępnie wyfrezowany (oznaczony czarną strzałką dwustronną), aby odsłonić znajdującą się poniżej próbkę. d) Gdy ten obszar jest obrazowany wyłącznie z wykorzystaniem elektronów wstecznie rozproszonych, widoczna jest zatopiona tkanka. Tutaj pełna szerokość sekcji zatopionej tkanki jest zaznaczona białą strzałką dwustronną. Pasek skali na c) wynosi 100 microns.

Rysunek 3. Obrazowanie objętości tkanki mózgowej z izotropowymi wokselami. a) Obraz z odwróconym kontrastem uzyskanym metodą rozproszonych elektronów (backscattered image) z powierzchni bloku, przedstawiający ultrastrukturę w obszarze mózgu szczura. Widoczne są wszystkie błony oraz duże struktury makromolekularne. b) Zebrano łącznie 1600 obrazów z odstępem 5 nm, co pozwoliło na uzyskanie stosu obrazów z izotropowymi wokselami. c) Stos ten można obrazować w dowolnej płaszczyźnie z tą samą rozdzielczością. Obraz przedstawia pojedyncze połączenie synaptyczne obrazowane w płaszczyźnie x y oraz w płaszczyźnie y z.

Dyskusja

Technika FIB/SEM działa optymalnie, gdy obszar zainteresowania nie jest zbyt duży. Górna granica obrazowanej objętości zależy od wiązki jonowej i obszaru, który można konsekwentnie i wielokrotnie trawić przez wiele godzin. Do tej pory osiągnięto to dla obszarów o wymiarach około 60 x 60 mikronów, jednak obrazowanie całego tego obszaru z odpowiednią rozdzielczością nie jest możliwe, głównie ze względu na czas potrzebny na zarejestrowanie tak dużego obrazu. Przykładowo, pozyskanie obrazu 4 k x 4 k przy czasie przebywania piksela 10 mikrosekund zajęłoby 2 minuty i 40 sekund, co przy polu widzenia 60 mikronów dałoby rozmiar piksela wynoszący zaledwie 15 nm. Do obrazowania ultrastruktury komórek i tkanek bardziej odpowiedni jest mniejszy rozmiar piksela, zazwyczaj między 4 a 10 nm / piksel. Dla obszaru 60 x 60 mikronów obraz byłby pozyskiwany przez 10 godzin, nawet gdyby mikroskop posiadał taką możliwość. Z tych powodów mikroskop ten jest idealnym narzędziem do obrazowania objętości rzędu 10 x 10 x 10 mikronów lub istotnych fragmentów całych komórek. Można to łatwo zrealizować w ciągu 48 godzin na próbkach, które wykazują dobry kontrast przy zastosowaniu tej procedury.

Do tej pory protokół ten był stosowany głównie w przypadku tkanki mózgowej, a także różnych typów hodowlanych komórek ssaków przylegających do szkiełek podstawowych. Niemniej jednak procedura fiksacji i barwienia może być wykorzystana w wielu innych typach materiału biologicznego, w tym materiału roślinnego, w celu uzyskania stosów obrazów o równie dobrym kontraście.

Zatem główną zaletą tej techniki jest możliwość obrazowania objętości z izotropowymi wokselami. Stosy obrazów tego typu pozwalają na analizę objętości 3D przy użyciu obrazów pobranych z dowolnej płaszczyzny stosu. Korzyścią z tego rozwiązania jest umożliwienie obserwatorowi obrazowania cech w serii obrazów z dowolnego kierunku oraz zapewnienie większej szczegółowości obrazu (Rycina 3).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klej cyjanoakrylowy
Mikroskop stereoskopowy: Leica MZ8	Leica Microsystems
żywica Durcupan	Sigma-Aldrich
mikroskop FIB/SEM (Zeiss, NVision 40)
Szkiełka histologiczne	Menzel-Glaser	AA00008032E
Urządzenie do wycinania noży szklanych: Leica EM KMR2	Leica Microsystems
Szklane fiolki scyntylacyjne (20 ml)	EMS	72634
Glutaraldehyd	EMS	16222
Jubiler’piła tarczowa	EMS	72010
Środek rozdzielający do form	Glorex, Szwajcaria	62407445
Tetrotlenek osmu	EMS	19110
Paraformaldehyd	EMS	RT 19208
Sole fosforanowe do buforu fosforanowego	Sigma-Aldrich	71642 i 71496
Kacodylan sodu	Sigma-Aldrich	20840
Sputter coater z tarczą złota	Cressington Co.
bufor Tris (TBS)	Sigma-Aldrich	T1378
Ultramikrotom: Leica UCT	Leica Microsystems
Octan uranylu	EMS	RT 22451