Niebędąca podatna na fouling monowarstwa silanu PEG została desorbowana z indywidualnie adresowalnych elektrod ITO na szkle poprzez przyłożenie potencjału redukcyjnego. Elektrochemiczne usuwanie warstwy silanu PEG z mikroelektrod ITO umożliwiło adhezję komórek w sposób przestrzennie zdefiniowany, przy czym wzory komórkowe ściśle odpowiadały rozmieszczeniu elektrod.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wzorcowanie komórek na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do precyzyjnej przestrzennej i czasowej kontroli oddziaływań na powierzchni komórek jest ważnym warunkiem wstępnym do tworzenia wielokomórkowych struktur służących jako modele in vitro tkanek natywnych. W niniejszym badaniu wykorzystano techniki fotolitografii i trawienia mokrego do wytworzenia indywidualnie adresowalnych elektrod z tlenku indu i cyny (ITO) na podłożach szklanych. Podłoża szklane zawierające mikroelektrody ITO zmodyfikowano silanem z poli(glikolem etylenowym) (PEG), aby nadać im właściwości odporne na osadzanie białek i komórek. Obecność izolujących cząsteczek PEG na powierzchni elektrod zweryfikowano za pomocą woltamperometrii cyklicznej, wykorzystując ferryjanożelazek potasu jako reporterową cząsteczkę redoks. Co istotne, przyłożenie potencjału redukującego spowodowało desorpcję warstwy PEG, co doprowadziło do regeneracji przewodzącej powierzchni elektrody i pojawienia się typowych pików redoks ferryjanożelazku. Przyłożenie potencjału redukującego odpowiadało również zmianie właściwości elektrody ITO z nieadhezyjnych dla komórek na adhezyjne. Elektrochemiczne usuwanie warstwy silanu-PEG z mikroelektrod ITO umożliwiło adhezję komórek w sposób przestrzennie zdefiniowany, przy czym wzory komórkowe ściśle odpowiadały wzorom elektrod. Na tych podłożach zademonstrowano mikrowzorowanie kilku typów komórek. W przyszłości kontrola właściwości biointerfejsu zapewniona przez tę metodę pozwoli na inżynierię mikrośrodowisk komórkowych poprzez zestawianie trzech lub więcej typów komórek w precyzyjnej konfiguracji geometrycznej na optycznie przezroczystym podłożu.
Protokół
Część I: Formowanie elektrod
- Oczyszczone i odwodnione szkiełka szklane pokryte warstwą ITO powleczono pozytywnym fotorezystem
- Powierzchnię wypiekano w temperaturze 100°C w celu usunięcia rozpuszczalników z fotorezystu
- Po wypiekaniu powierzchnię naświetlano światłem ultrafioletowym przez fotomaskę przy użyciu urządzenia Canon Mask Aligner
- Naświetlone obszary usunięto w roztworze wywoływacza
- Powierzchnię poddano utwardzaniu termicznemu (hard bake), aby usunąć pozostałości roztworu wywoływacza
- Obszary ITO niechronione wzorem z fotorezystu trawiono w trawieniu kwasowym
- Pozostały fotorezyst usunięto poprzez sonikację w acetonie, tworząc elektrody ITO
Część II: Modyfikacja powierzchni
- Zmodyfikowane elektrody są oczyszczane w komorze plazmowej, a następnie modyfikowane 2% PEG silanem w toluenie. Inkubację prowadzono przez 2 godziny, po czym nastąpiło 2-godzinne wypiekanie.
Uwaga: Proces ten przeprowadza się w worku rękawicowym wypełnionym azotem, aby uniknąć obecności wilgoci, ponieważ silan PEG reaguje z nią.
Część III: Elektrochemia
- Stalowe druty zostają przymocowane do podkładek elektrod.
- Elektrody modyfikowane silanem PEG są umieszczane w ogniwie elektrochemicznym w celu przeprowadzenia eksperymentów elektrochemicznych.
- Silan PEG z obszarów połączonych jest usuwany przy użyciu układu trójelektrodowego w PBS.
Część IV: Wzorowanie komórkowe
- Fibroblasty inkubuje się na świeżo oczyszczonych podłożach. Po inkubacji komórki te przytwierdzają się do obszarów, z których usunięto silan PEG; nie wiążą się one jednak w żadnym innym miejscu na powierzchni.
- Uzorowane komórki inkubuje się w świeżej pożywce i obrazuje za pomocą mikroskopu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym filmie zaprezentowaliśmy wzorowanie komórek na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny. Po wykonaniu elektrod ITO za pomocą fotolitografii, zostały one zmodyfikowane odporną na przyleganie komórek monowarstwą silanu PEG. Monowarstwa ta została zdesorbowana za pomocą elektrochemii, co zmieniło właściwości powierzchni z odpornej na przyleganie komórek na adhezyjną. W filmie pokazano wzorowanie mysich fibroblastów 3T3. Tą samą techniką wzorowaliśmy również hepatocyty, komórki pierwotne oraz komórki ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Tlenek indu i cyny | Inne | Delta Technologies | CB 40IN | |
| Silan PEG | Odczynnik | Gelest Inc. | SIM6492.66 | |
| Kwas solny | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Kwas azotowy | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 258121 | |
| Etanol | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Aceton | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Toluen | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 34866 | |
| Pożywka | Odczynnik | Invitrogen | ||
| Kolagen | Odczynnik | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| Mysie fibroblasty 3T3 | Linia komórkowa | ATCC |
Bibliografia
- Lee, J. Y., Jones, C., Zern, M. A., Revzin, A. Analysis of Local Tissue-Specific Gene Expression in Cellular Micropatterns. Analytical Chemistry. 78, 8305-8312 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
