Test NU-ELISA (Nucleosome ELISA) jest czułą i ilościową metodą wykrywania ogólnych wzorców modyfikacji potranslacyjnych w preparatach natywnych, nienaruszonych nukleosomów. Modyfikacje te obejmują metylacje, acetylacje i fosforylacje w konkretnych resztach aminokwasowych histonów, dzięki czemu NU-ELISA stanowi globalny test proteomiczny ogólnego stanu modyfikacji chromatyny w określonych typach komórek.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Genom eukariotów występuje w postaci chromatyny, która zawiera zarówno DNA, jak i białka. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, składający się ze 146 par zasad DNA związanych z dwiema kopiami każdych z histonów H2A, H2B, H3 oraz H41. Końce N-terminalne histonów są bogate w lizynę i argininę i ulegają modyfikacjom potranskrypcyjnym poprzez acetylację, metylację oraz inne modyfikacje potranslacyjne (PTMs). Konfiguracja PTM nukleosomów może wpływać na aktywność transkrypcyjną powiązanego z nimi DNA, zapewniając tym samym mechanizm regulacji genów o charakterze epigenetycznym 2,3. Opracowaliśmy metodę zwaną NU-ELISA (nucleosome ELISA), służącą do ilościowego oznaczania globalnych sygnatur PTM nukleosomów wyekstrahowanych z komórek. Metoda NU-ELISA jest bardziej czuła i ilościowa niż western blotting i jest użyteczna do badania stanu epiproteomicznego konkretnych typów komórek. Niniejszy artykuł w formie wideo przedstawia szczegółowe procedury przeprowadzania analizy NU-ELISA.
Protokół
1. Kultura komórek ssaków
Metodę NU-ELISA można przeprowadzić na dowolnym typie komórek ssaków, które można hodować in vitro. Zalecamy przygotowanie średnich lub dużych partii komórek, aby można było wyizolować nukleosomy w ilości wystarczającej do przygotowania kilku identycznie obciążonych płytek ELISA, co umożliwia przeprowadzenie analiz z użyciem kilku różnych przeciwciał (Abs). Poniższe skale hodowli zapewniają wystarczającą ilość materiału:
W przypadku embrionalnych komórek macierzystych myszy, należy hodować jedną lub dwie płytki 15 cm z komórkami bez komórek karmicieli. W przypadku fibroblastów, należy hodować od 5 do 10 płytek 15 cm do osiągnięcia konfluencji.
2. Izolacja jąder komórkowych
Uwaga: Wszystkie etapy są wykonywane w lodzie z użyciem schłodzonych buforów, chyba że wskazano inaczej.
- Poddać komórki trypsynizacji, używając 3 ml trypsyny na płytkę, połączyć materiał i dodać 20 ml lodowatego PBS/maślanu. Wirować przy 1000 rpm przez 5 min.
- Resuspender komórki w 10 ml PBS/maślanu i wirować przy 1000 rpm przez 5 min.
- Resuspender w 4 ml buforu lizującego z inhibitorami proteaz (Sigma-Aldrich P-8340). Homogenizować w homogenizatorze Dounce, wykonując 20 ruchów tłuczkiem typu B w lodzie.
- Wirować przy 2000g przez 10 min w temperaturze 4°C. (Nadpływ zawiera cytoplazmę, która nie jest potrzebna do tego protokołu, ale można ją zachować do innych zastosowań, jeśli jest to pożądane).
- Resuspender osad w 2 ml lodowatego buforu do przemywania C (z inhibitorami proteaz).
- Nanieść resuspenderowany materiał na warstwę 5 ml 30% poduszki sacharozowej, a następnie wirować przy 2400g przez 5 min w rotorze z koszyczkami wahadłowymi. Jądra komórkowe przejdą przez poduszkę, a zanieczyszczenia pozostaną na granicy faz.
- Ostrożnie usunąć całą objętość cieczy i resuspender jądra w 250 μl lodowatego buforu do przemywania C + inhibitorów proteaz.
3. Izolacja nukleosomów poprzez trawienie nukleazą mikrok Kokową (MNase) in situ
Stosujemy procedurę, w której chromatyna jest trawiona in situ w obrębie jąder komórkowych poprzez inkubację z MNase, a następnie poddawana traktowaniu w roztworze hipotonicznym w celu uwolnienia nienaruszonych nukleosomów do nadsączu.
- Dodaj 3 μl 0,1 M CaCl22 do próbki. Włożyć 37°C blok grzejny. Pozostawić do wyrównania temperatury 37°C temperatura
- Dodaj 2 jednostki MNazy (nukleazy mikrokokalnej, Sigma-Aldrich, rozpuszczonej w stężeniu 2 jednostek/10μl w buforze MNase), a następnie inkubować przez 37°C przez 12 min, często mieszając za pomocą końcówki do pipety.
- Dodaj 6 μl 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 w celu zatrzymania reakcji. Umieścić w lodzie.
- Wiruj z prędkością 2000 g przez 4 min, a następnie odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 300 μl 0,2 mM Na-EDTA. Przechowywać w lodzie przez 1 h, sporadycznie delikatnie pipetując. (Te warunki hipotoniczne uwalniają wolne nukleosomy z jąder komórkowych).
- Wiruj w wirowarce przy 3000 g przez 4 min w temperaturze 4°CPrzechowuj supernatant zawierający wolne nukleosomy w lodzie.
- Ponownie zawiesić osad w 300 μl 0,2 mM Na-EDTA. Przechowywać w lodzie przez 1 h, wykonując sporadycznie delikatne pipetowanie.
- Wirować przy 3000 g przez 4 min w temperaturze 4°CZachować nadsącz i połączyć go z pierwszym nadsączem z kroku 5. Otrzymane preparaty mononukleosomów można podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80°C.
Uwaga: Ilość chromatyny można w przybliżeniu określić ilościowo, mierząc absorbancję przy 260 nm próbki o objętości 10 μl dodanej do 990 μl wody. Wartość A260=10 (po uwzględnieniu rozcieńczenia 1/100) odpowiada około 1mg/ml chromatyny. Ponadto, podczas powyższej procedury można zachować niewielkie próbki i przeanalizować je później pod kątem zawartości DNA, aby monitorować jakość i zakres trawienia przez MNazę, która powinna przynieść głównie fragmenty DNA o długości 146 bp. Wystąpienie drabinki świadczy o niepełnym trawieniu przez MNazę.
Uwaga: Ryc. 1 zawiera schematyczne podsumowanie etapów izolacji jąder oraz trawienia MNase.
4. NU-ELISA (ELISA nukleosomów)
Wykrywamy Modyfikacje Potranslacyjne (PTM) w frakcjach zawierających natywne, nienaruszone nukleosomy, które zostały unieruchomione na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych do testów ELISA. Dla każdej próbki przygotowujemy serię rozcieńczeń dwukrotnych, a następnie nanosimy je na dołki w trzech powtórzeniach.
- Płytki MaxiSorp należy pokryć przez noc w temperaturze 4°C, dodając 50 μl/dołek nukleosomów rozcieńczonych w buforze do pokrywania. Sugerowane dwukrotne rozcieńczenia szeregowe nukleosomów przygotowuje się od górnego do dolnego rzędu, dodając kolejno 0,1 μg, 0,05 μg, 0,025 μg, 0,0125 μg, 0,00625 μg, 0,00313 μg, 0,00156 μg, przy czym w dolnym rzędzie znajduje się sam bufor do pokrywania (0 μg chromatyny). (Uwaga: na tym etapie wymagane są przykrywki do płytek).
- Rano płytki należy przemyć 4 razy, używając 200 μl/dołek PBS/0,5% Tween-20 w temperaturze pokojowej (RT) przez łącznie 10 min za pomocą myjki do płytek.
- Blokowanie przeprowadza się przez 1 h w RT, stosując 100 μl/dołek PBS/0,05% Tween-20/5% BSA.
- Bufor blokujący należy usunąć, energicznie wstrząsając odwróconą płytką nad zlewem. Płytki należy przykryć i przechowywać w temperaturze -20°C lub przejść bezpośrednio do następnego kroku.
- Należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe (1° Abs) w objętości 50 μl/dołek, rozcieńczone 1:1000 (lub według potrzeb) w PBS/0,05% Tween-20/5% BSA i inkubować w RT przez 1 godzinę na rotatorze.
- Płytki należy przemyć 4 razy, używając 200 μl/dołek PBS/0,5% Tween-20 w RT przez łącznie 10 min w myjce do płytek.
- Należy dodać przeciwciała drugorzędowe (2° Abs) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczone 1:5000 (lub według potrzeb) w PBS/0,05% Tween-20/5% BSA; inkubować w RT przez godzinę na rotatorze.
- Płytki należy przemyć 4 razy, używając 200 μl/dołek PBS/0,5% Tween-20. Każde przemywanie odbywa się w RT przez łącznie 10 minut za pomocą myjki do płytek.
- Utlenianie płyt przeprowadza się poprzez dodanie 50 μl substratu TMB do każdego dołka na 10 min w RT. Reakcję należy zatrzymać, dodając 50 μl/dołek 2N H2SO4, a następnie odczytać wartości z płytek przy 450 nm. (Wskazówka: przed odczytem absorbancji należy wirować płytki przy 1500 rpm przez 2 min za pomocą rotora do płytek, aby usunąć pęcherzyki powietrza z dołków).
- Odczyty należy wyeksportować do arkuszy kalkulacyjnych w celu przeprowadzenia analiz ilościowych i statystycznych.
Odczynniki
| PBS/maślan |
| 135 mM NaCl |
| 2,5 mM KCl |
| 8 mM Na2HPO4 |
| 1,5 mM KH2PO4 |
| 10 mM butyranu sodu |
| Bufor lizujący |
| 250 mM sacharozy |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 10 mM maślanu sodu |
| 4 mM MgCl22 |
| 0,1% Triton X-100 |
| Bufor płukący C |
| 250 mM sacharozy |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 10 mM butyranu sodu |
| 4 mM MgCl22 |
| Poduszka sacharozowa |
| 30% (m/v) sacharozy w buforze płuczącym C |
| Bufor do nukleazy mikrokokowej |
| 5 mM NaPO44 Bufor, pH 7,0 |
| 0,025 mM CaCl22 |
| Bufor do powlekania |
| 80 ml roztworu A + 170 ml roztworu B + 250 ml dH2O2O |
| Roztwór A: 0,2 M Na2Tlenek węgla3 |
| Roztwór B: 0,2 M NaHCO33 |
5. Reprezentatywne wyniki
Zastosowanie metody NU-ELISA wymaga przygotowania serii kilku identycznych płytek, na które nanosi się chromatynę w formie mononukleosomów. Zazwyczaj przygotowujemy serie identycznie obciążonych płytek, aby każdą z nich można było inkubować z innym przeciwciałem (Ab) specyficznym dla różnych modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM). Zawsze przygotowujemy również płytkę do inkubacji z przeciwciałem wykrywającym histony niezależnie od stanu ich modyfikacji, co służy jako kontrola całkowitego obciążenia chromatyną. Kontrola ta jest niezbędna do późniejszego ilościowego porównania zawartości PTM w nukleosomach przygotowanych z różnych próbek. Aby określić poziom PTM w danej próbce chromatyny, korygujemy surowe wartości absorbancji w następujący sposób: najpierw odejmujemy sygnał tła, korzystając z wartości uzyskanych z dołków kontrolnych niezawierających chromatyny (tło jest zazwyczaj pomijalne). Następnie standaryzujemy sygnały specyficzne dla PTM względem wyników NU-ELISA uzyskanych z identycznie obciążonej płytki, której analizę przeprowadzono z użyciem przeciwciała wykrywającego nukleosomy niezależnie od stanu ich modyfikacji. (W tym celu stosowaliśmy poliklonalne przeciwciała specyficzne dla histonów H2A lub H2B). Następnie wyznaczamy średnie i wariancje dla każdego rozcieńczenia chromatyny i wykorzystujemy dane uzyskane z linearnej części testu ELISA. Szczegółowe przykłady analiz matematycznych i statystycznych NU-ELISA zostały opisane we wcześniejszych publikacjach4
Rysunek 1. Schemat etapów metody NU-ELISA. A. Zbiór komórek ssaków; B. Oddzielenie jąder od komórek poprzez homogenizację w homogenizatorze Dounce'a, C. Naniesienie rozbitych komórek na poduszkę z 30% w/v sacharozy, D. Po wirowaniu jądra osadzają się w osadzie; E, F. Chromatyna jest trawiona in situ przez MNazę głównie do mononukleosomów; G, H, I. Rozpuszczalne mononukleosomy są ekstrahowane poprzez traktowanie roztworem hipotonicznym i wielokrotne wirowanie pozostałego materiału jądrowego. J. Mononukleosomy z różnych próbek (oznaczone w tym przypadku jako samp. 1 i 2) są unieruchamiane w dołkach mikropłytek w serii identycznie obciążonych płytek, a następnie analizowane za pomocą przeciwciał specyficznych dla PTM oraz przeciwciał niezależnych od PTM w celu określenia całkowitej ilości naniesionej chromatyny. K. Przedstawienie różnic w poziomach detekcji sygnału w dwóch próbkach, które różnią się zawartością PTM, ale mają podobną całkowitą zawartość chromatyny, ocenianą na podstawie immunoreaktywności anty-H2B.
Dyskusja
Metoda NU-ELISA umożliwia określenie ogólnego stanu PTM nukleosomów występujących w konkretnym typie komórek. Badania z wykorzystaniem NU-ELISA wykazały, że globalne stany modyfikacji nukleosomów różnią się w zależności od analizowanych typów komórek 4. Ponadto profile PTM w NU-ELISA ulegają zmianie, gdy komórki są poddane działaniu czynników modyfikujących epigenetycznie, takich jak trichostatyna-A, lub gdy dochodzi do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy 4. Metodę tę z powodzeniem zastosowano również do badania chromatyny ludzkich komórek ES5. Należy zauważyć, że NU-ELISA w obecnej formie pozwala na wykrycie jedynie zbiorczej sygnatury PTM obecnych w całkowitej sumie epigenomu komórkowego. Różni się to znacząco od genomowej immunoprecypitacji chromatyny, która pozwala określić rozkład konkretnego PTM w określonych loci genetycznych.
Pierwsze etapy procedur NU-ELISA zostały zaadaptowane z wcześniejszych metod izolacji mononukleosomów z jąder komórek ssaków6,7. Zaadaptowane metody te stanowią szybki sposób na uzyskanie wysokiej jakości nienaruszonych mononukleosomów z komórek ssaków, a otrzymane frakcje są kompleksowe pod względem zawartości chromatyny, lecz zawierają znaczną ilość dodatkowego materiału jądrowego. Ponieważ stosowane są specyficzne przeciwciała, zanieczyszczenia materiałem nienukleosomowym są dobrze tolerowane w teście NU-ELISA, w przeciwieństwie do metod spektrometrii mas, które wymagają większej czystości. Jednakże NU-ELISA jest bardziej czuła i ilościowa niż western blotting 4, stanowiąc tym samym dobrą alternatywę dla metod western blot i spektrometrii mas w detekcji nukleosomowych PTM.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Opracowanie metody NU-ELISA zostało sfinansowane z grantu NIH RO1AG023687.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nukleaza mikrokokkowa | Sigma-Aldrich | N3755 | Przygotować alikwoty o stężeniu 2 U/10μl buforu, przechowywane w -20°C |
| Płytki mikrotitracyjne Nunc MaxiSorp | Fisher Scientific | 12-565-135 | Przylepne pokrywy do płytek można również zamówić w firmie Fisher |
| Automatyczna myjka do płytek | |||
| 1-stopniowy substrat TMB-ELISA | Pierce, Thermo Scientific | 34028 | Przechowywać w 4°C, przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej lub zgodnie z instrukcją na karcie specyfikacji |
| Czytnik płytek mikrotitracyjnych | Bio-Rad | Odpowiednie są większość modeli kolorymetrycznych czytników płytek |
Bibliografia
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
- Dai, B., Rasmussen, T. P. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells. Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).
- Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
- Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).
- Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).
Przedruki i uprawnienia
