Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych na natywnych nienaruszonych nukleosomach za pomocą testu ELISA

Summary

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) to czuła i ilościowa metoda wykrywania globalnych wzorców modyfikacji potranslacyjnych w preparatach natywnych, nienaruszonych nukleosomów. Modyfikacje te obejmują metylację, acetylację i fosforylację przy określonych resztach aminokwasowych histonów, a zatem NU-ELISA zapewnia globalny test proteomiczny ogólnych stanów modyfikacji chromatyny określonych typów komórek.

Abstract

Genom eukariontów występuje jako chromatyna, która zawiera zarówno DNA, jak i białka. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, który zawiera 146 par zasad DNA związanych z dwoma histonami H2A, H2B, H3 i H4¹. N-końcowe ogony histonów są bogate w lizynę i argininę i są modyfikowane po transkrypcji przez acetylację, metylację i inne modyfikacje potranslacyjne (PTM). Konfiguracja nukleosomów PTM może wpływać na aktywność transkrypcyjną powiązanego DNA, zapewniając w ten sposób sposób sposób regulację genów, który ma charakter epigenetyczny ^2,3. Opracowaliśmy metodę zwaną ELISA NUKLEOSOMÓW (NU-ELISA) do ilościowego określania globalnych sygnatur PTM nukleosomów wyekstrahowanych z komórek. NU-ELISA jest bardziej czuły i ilościowy niż western blot i jest przydatny do badania stanu epiproteomicznego określonych typów komórek. Ten artykuł w czasopiśmie wideo przedstawia szczegółowe procedury przeprowadzania analizy NU-ELISA.

Protocol

1. Hodowla komórek ssaków

NU-ELISA może być przeprowadzona na dowolnym typie komórek ssaków, które mogą być hodowane w hodowli. Preferujemy przygotowywanie umiarkowanych i dużych partii komórek, aby nukleosomy można było wyizolować w ilości wystarczającej do przygotowania kilku identycznie obciążonych płytek ELISA, umożliwiając w ten sposób testy z kilkoma różnymi przeciwciałami (Abs). Następujące skale hodowlane dostarczają obszernego materiału:

Dla embyronicznych komórek macierzystych myszy, hoduj jedną lub dwie 15 cm płytki komórek bez komórek zasilających. W przypadku fibroblastów wyhoduj od 5 do 10 15 cm płytek do zbiegu.

2. Izolacja jąder

Uwaga: Wszystkie kroki są na lodzie z wstępnie schłodzonymi, z wyjątkiem przypadków opisanych powyżej.

1. Trypsynizuj komórki za pomocą 3 ml trypsyny na płytkę, połącz i dodaj 20 ml lodowatego PBS/maślanu. Wirować z prędkością 1000 obr./min przez 5 min.
2. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS/maślanu i odwirować z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut.
3. Zawiesić w 4 ml buforu do lizy z inhibitorami proteazy (Sigma-Aldrich P-8340). Odbij homogenizuj 20 uderzeń tłuczkiem typu B na lodzie.
4. Wirować przy 2000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. (Supernatant zawiera cytoplazmę, która nie jest potrzebna do tego protokołu, ale w razie potrzeby można ją zachować do innych zastosowań).
5. Zawiesić osad w 2 ml lodowatego buforu do przemywania C (z inhibitorami proteazy).
6. Zawiesinę materiału należy nałożyć na 5 ml 30% poduszki sacharozy, a następnie odwirować przy 2400 g przez 5 minut w obracającym się wirniku kubełkowym. Jądra będą migrować przez poduszkę, a szczątki pozostaną na granicy faz.
7. Ostrożnie usunąć całą objętość cieczy i ponownie zawiesić jądra w 250 μl lodowatego buforu do płukania C + inhibitory proteazy.

3. Izolacja nukleosomów metodą trawienia in situ nukleazą mikrokokową (MNazą)

Używamy procedury, w której chromatyna jest trawiona in situ w jądrach poprzez nastrzykiwanie ich MNazą, a następnie hipotoniczną obróbkę w celu wprowadzenia wolnych nienaruszonych nukleosomów do supernatantu.

1. Do próbki dodać 3 μl 0,1 M CaCl₂. Umieść w bloku grzewczym o temperaturze 37°C. Pozostawić do przyjęcia temperatury 37°C.
2. Dodać 2 jednostki MNazy (nukleaza mikrokokowa, Sigma-Aldrich, rozpuszczona w 2 jednostkach/10 μl w buforze MNazy), a następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 12 minut, często mieszając za pomocą końcówki pipety.
3. Dodać 6 μl 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0, aby zatrzymać reakcję. Połóż na lodzie.
4. Wirować przy 2000 g przez 4 minuty, odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 300 μl 0,2 mM Na-EDTA. Przechowywać na lodzie przez 1 godzinę, od czasu do czasu delikatnie pipetując. (Te hipotoniczne warunki uwalniają wolne nukleosomy z jąder).
5. Wirować przy 3000 g przez 4 minuty w temperaturze 4°C. Zachowaj supernatant, który zawiera wolne nukleosomy, na lodzie.
6. Ponownie zawiesić osad za pomocą 300 μl 0,2 mM Na-EDTA. Przechowywać na lodzie przez 1 godzinę, od czasu do czasu delikatnie pipetując.
7. Wirować przy 3000g przez 4 minuty w temperaturze 4°C. Zachować supernatant i połączyć go z pierwszym supernatantem z kroku 5. Otrzymane preparaty mononukleosomów można podasumować i przechowywać w temperaturze -80°C.

Uwaga: Ilość chromatyny można z grubsza określić ilościowo, mierząc absorbancję przy 260 nm próbki 10 μl dodanej do 990 μl wody. A₂₆₀=10 (po dostosowaniu do rozcieńczenia 1/100) odpowiada około 1 mg/ml chromatyny. Ponadto, podczas powyższej procedury, małe próbki mogą być zachowane, a następnie analizowane pod kątem zawartości DNA w celu monitorowania jakości i zakresu trawienia MNazy, które powinny zawierać głównie DNA o długości 146 pz. Drabinkowanie wskazuje na niepełne trawienie MNazy.

Uwaga: Rys.1 zawiera schematyczne podsumowanie etapów izolacji jądrowej i trawienia MNazy.

4. Nucleosom-ELISA (NU-ELISA)

Wykrywamy PTM na frakcjach zawierających natywne nienaruszone nuklezosomy, które zostały unieruchomione na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych ELISA. Dla każdej próbki wykonujemy serię 2-krotnych rozcieńczeń, które są pokrywane na studzienkach w trzech egzemplarzach.

1. Płytki MaxiSorp należy pokryć na noc w temperaturze 4°C 50 μl/studzienkę nukleosomów rozcieńczonych w buforze powlekającym. Sugerowane seryjne dwukrotne rozcieńczenia nukleosomów przygotowuje się od górnego rzędu do dolnego, dodając 0,1 μg, 0,05 μg, 0,025 μg, 0,0125 μg, 0,00625 μg, 0,00313 μg, 0,00156 μg, z samym buforem powlekającym (0 μg chromatyny) w dolnym rzędzie. (Uwaga: na tym etapie potrzebne są osłony płyt.)
2. Rano umyj płytki 4 razy 200 μl/studzienkę PBS/0,5% Tween-20 w temperaturze pokojowej (RT) przez łącznie 10 minut za pomocą myjki do płyt.
3. Blokuj 1 godzinę w RT za pomocą 100 μl/studzienka PBS/0,05% Tween-20/5% BSA.
4. Usuń bufor blokujący, energicznie potrząsając odwróconym talerzem nad zlewem. Przykryj i przechowuj płytki w temperaturze -20°C lub przejdź bezpośrednio do następnego kroku.
5. Dodać 1° Abs w objętości 50 μl/dobrze rozcieńczony w stosunku 1:1000 (lub w razie potrzeby) w PBS/0,05% Tween-20/5% BSA, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na rotatorze.
6. Umyj płytki 4 razy 200 μl/studzienkę PBS/0,5% Tween-20 w temperaturze pokojowej i łącznie 10 minut w myjce do płyt.
7. Dodać peroksydazę chrzanową (HRP) sprzężoną z 2° Abs, rozcieńczoną w stosunku 1:5000 (lub w razie potrzeby) w PBS/0,05% Tween-20/5% BSA w temperaturze pokojowej przez godzinę na rotatorze.
8. Umyj płytki 4 razy za pomocą 200 μl/studzienka PBS/0,5% Tween-20. Każde mycie odbywa się w temperaturze pokojowej i trwa łącznie 10 minut z myjką do talerzy.
9. Rozwinąć płytki, dodając 50 μl substratu TMB do każdej studzienki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl/basenik 2N H₂SO₄ i odczytać płytki 450 nm. (Wskazówka: Wirować z prędkością 1500 obr./min przez 2 minuty za pomocą wirnika płytowego, aby rozproszyć wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach przed odczytem absorbancji).
10. Eksportuj odczyty do plików arkuszy kalkulacyjnych w celu analiz ilościowych i statystycznych.

Odczynniki

PBS/maślan 135 mM NaCl 2,5 mM KCl 8 mM na₂HPO₄ 1,5 mM KH₂PO₄ 10 mM Na-maślanu Bufor do lizy 250 mM sacharozy 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM Na-maślanu 4 mM MgCl₂ 0,1% Tryton X-100 Bufor do płukania C 250 mM sacharozy 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM Na-maślanu 4 mM MgCl₂ Poduszka z sacharozą 30% (w/v) sacharozy w buforze do przemywania C Bufor nukleazy mikrokokowej 5 mM bufor NaPO₄, pH 7,0 0,025 mM CaCl₂ Bufor do powlekania 80 ml roztworu A + 170 ml roztworu B + 250 ml dH₂O Roztwór A: 0,2 M na₂CO₃ Roztwór B: 0,2 M NaHCO₃

5. Reprezentatywne wyniki

Za pomocą metody NU-ELISA przygotowuje się serię kilku identycznych płytek, które można obciążyć chromatyną przygotowaną w postaci mononukleosomów. Zazwyczaj przygotowujemy serie identycznie obciążonych płytek, tak aby każda z nich mogła być sondowana różnymi przeciwciałami specyficznymi dla anty-PTM (Abs). Zawsze przygotowujemy również płytkę, którą można sondować za pomocą Ab, który wykrywa histony bez względu na ich stan modyfikacji, całkowitą kontrolę obciążenia chromatyną. Kontrola ta jest niezbędna w celu późniejszego ilościowego porównania zawartości PTM w nukleosomach przygotowanych z różnych próbek. Aby określić ilościowo poziomy PTM w danej próbce chromatyny, korygujemy wartości absorbancji surowej przy użyciu następującego podejścia: Najpierw odejmujemy dowolny sygnał tła za pomocą wartości uzyskanych ze studzienek kontrolnych niezawierających chromatyny (tło jest zwykle pomijalne). Następnie standaryzujemy sygnały specyficzne dla PTM do wyników NU-ELISA uzyskanych z identycznie obciążonej płytki, która została przetestowana z Ab, który wykrywa nukleosomy niezależnie od ich stanu modyfikacji. (W tym celu użyliśmy poliklonalnych Abs specyficznych dla histonów H2A lub H2B). Następnie określamy średnie i wariancje dla każdego rozcieńczenia chromatyny i wykorzystujemy dane uzyskane z liniowej części testu ELISA. Szczegółowe przykłady analiz matematycznych i statystycznych NU-ELISA zostały przedstawione wcześniej⁴

Rysunek 1. Schemat kroków NU-ELISA. ZA. Komórki ssaków są zbierane; Ur. Jądra są oddzielane od komórek przez homogenizację Dounce, C. Uszkodzone komórki są ładowane na wierzch 30% w/v poduszki sacharozy, D. Po odwirowaniu jądra są osadzane w osadzie; E, F. Chromatyna jest trawiona in situ do głównie mononukleomów przez MNazę; G, H, I. Rozpuszczalne mononukleosomy ekstrahuje się przez obróbkę hipotoniczną i wielokrotne wirowanie pozostałego materiału jądrowego. J. Mononukleosomy z różnych próbek (w tym przypadku oznaczone jako samp. 1 i 2) są powlekane na studzienkach mikromiareczkowych w szeregu identycznie obciążonych płytek i badane za pomocą Abs specyficznych dla PTM i Abs niezależnych od PTM w celu określenia całkowitego obciążenia chromatyną. K. Przedstawienie różnicowych poziomów detekcji sygnału w dwóch próbkach, które różnią się zawartością PTM, ale mają podobną ogólną zawartość chromatyny, ocenianą na podstawie immunoreaktywności anty-H2B.

Discussion

NU-ELISA zapewnia metodę ustalania globalnego statusu nukleosomów PTM obecnych w określonym typie komórki. Badania NU-ELISA wykazały, że globalne stany modyfikacji nukleosomów różnią się w porównaniach rozbieżnych typów komórek ⁴. Ponadto profile NU-ELISA PTM zmieniają się, gdy komórki są wystawione na działanie epigenetycznych czynników modulujących, takich jak trichostatyna-A, lub gdy różnicowane są embyroniczne komórki macierzyste myszy ⁴. Metoda ta została również z powodzeniem zastosowana do badania chromatyny ludzkich komórek ES⁵. Ważne jest, aby pamiętać, że NU-ELISA, w swojej obecnej formie, może wykryć tylko złożoną sygnaturę PTM obecnych w sumie całkowitego epigenomu komórkowego. Różni się to znacznie od immunoprecypitacji chromatyny obejmującej cały genom, która może określać dystrybucję określonego PTM w określonych loci genetycznych.

Początkowe etapy procedur NU-ELISA są dostosowane do poprzednich metod izolowania mononukleosomów z jąder^{ssaków 6,7}. Te dostosowane metody zapewniają celowy sposób uzyskiwania wysokiej jakości nienaruszonych mononukleosomów z komórek ssaków, a uzyskane frakcje są wszechstronne pod względem zawartości chromatyny, ale zawierają dużo dodatkowego materiału jądrowego. Ponieważ stosowane są specyficzne Abs, zanieczyszczający materiał nienukleosomalny jest dobrze tolerowany w teście NU-ELISA, w przeciwieństwie do podejść o specyfikacji masy, które wymagają większej czystości. Jednak NU-ELISA jest bardziej czuły i ilościowy niż western blotting ⁴, zapewniając w ten sposób dobrą alternatywę dla western i mass spec do wykrywania nukleosomalnych PTM.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jądra mikrokokkowe	Sigma-Aldrich	N3755	Wykonaj porcje 2 U/10μ l bufor, przechowywany na poziomie -20° C
Nunc MaxiSorp Płytki do mikromiareczkowania	Fisher Scientific	12-565-135	Samoprzylepne osłony płytek można również zamówić za pośrednictwem
Fisher Automatyczna myjka
1-stopniowe TMB-ELISAsubstrate	Pierce, Thermo Scientific	34028	Sklep pod adresem 4° C wstępnie podgrzany do RT przed użyciem lub zgodnie z zaleceniami w karcie specyfikacji
Czytnik płytek do mikromiareczkowania	Bio-Rad		Odpowiednia jest większość modeli czytników płytek kolorymetrycznych