Podstawowe zasady oczyszczania metodą nadkrytycznej chromatografii fluidalnej - REKLAMA

Podsumowanie

Podstawowe zasady rozdzielania związków z mieszanin za pomocą nadkrytycznej chromatografii płynnej (SFC) są podobne do podstaw preparatywnej chromatografii cieczowej.

Streszczenie

Chociaż nadkrytyczna chromatografia fluidalna (SFC) nie jest nową techniką, preparatywna SFC staje się coraz bardziej popularna dzięki postępom w oprzyrządowaniu, oprogramowaniu i chemii. Podstawowe zasady izolowania związków za pomocą SFC są podobne do podstawowych zasad dla preparatywnej chromatografii cieczowej na dużą skalę. W tym badaniu zilustrowano wpływ natężenia przepływu, rozpuszczalnika do rozpuszczania próbki i selektywności kolumny na izolację związków z mieszaniny. Kolumny wyposażone w technologię optymalnej gęstości złoża (OBD)¹ i dopasowany skład chemiczny zapewniają łatwą i przewidywalną skalowalność od małej skali do większych separacji preparatywnych.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

• Mieszanina złożona 1: kumaryna, ibuprofen i karbamazepina; po 20 mg/ml w metanolu
• Mieszanina 2: ibuprofen i karbamazepina; po 20 mg/ml w metanolu
• Mieszanina związków 3: ibuprofen i karbamazepina; po 20 mg/ml w DMSO (dimetylosulfotlenek)
• Mieszanina 4: 10 mg/ml fenoprofenu, 15 mg/ml ketoprofenu, 20 mg/ml flawonu, 20 mg/ml ibuprofenu i 20 mg/ml kumaryny w metanolu

2. Warunki eksperymentalne

1. Chromatografię analityczną przeprowadzono na Stacji Metody Wodnej SFC System.
   Kolumna: Kolumna Viridis SFC 2-etylopirydynowa, 5 μm, 4,6 x 150 mm, numer części 186004937.
2. Chromatografię preparatywną przeprowadzono na systemie Waters Prep 100 SFC UV Directed System. Ten Kolumny:
   • Kolumna OBD Viridis SFC 2-etylopirydyna, 5 μm, 19 x 150 mm, Numer katalogowy 186004945
   • Kolumna OBD Viridis SFC z krzemionki, 5 μm, 19 x 150 mm, Numer części 186004918
   • Kolumna OBD Viridis SFC 2-etylopirydynowa, 5 μm, 19 x 100 mm, Numer katalogowy 186004944
3. Inne parametry metody:
   • Temperatura kolumny: 40 °C
   • Współrozpuszczalnik: Metanol
   • Objętość wtrysku, natężenie przepływu i gradienty: przedstawione w liczbach

3. Reprezentatywne wyniki

Natężenie przepływu

Natężenie przepływu używane w preparatywnych separacjach LC jest ograniczone przez szereg czynników, w tym długość i średnicę kolumny, wielkość cząstek i ciśnienie wsteczne systemu. Dwutlenek węgla o niskiej lepkości, główny składnik fazy ruchomej w SFC, umożliwia stosowanie wyższych natężeń przepływu niż te powszechnie stosowane w chromatografii cieczowej. Ciśnienie zwrotne związane z długością kolumny jest również niższe, co umożliwia użycie dłuższych kolumn w celu zwiększenia rozdzielczości. Wyższe natężenia przepływu zwiększają przepustowość poprzez skrócenie czasu potrzebnego do zakończenia separacji. Jak pokazano na rysunku 1, profil chromatograficzny jest taki sam przy różnych natężeniach przepływu, pod warunkiem że nachylenie gradientu wyrażone w procentowej zmianie na objętość kolumny pozostaje stałe. Osiąga się to poprzez skrócenie czasu pracy w takim samym stopniu, w jakim zwiększa się natężenie przepływu.

Rozpuszczanie próbki i ładowanie rozpuszczalnika

Izolowanie związków z mieszanin wymaga, aby próbka była całkowicie rozpuszczalna przed wstrzyknięciem. Metanol, najpowszechniejszy współrozpuszczalnik w SFC, nie rozpuszcza wszystkich próbek w wysokich stężeniach zwykle wymaganych do typowych separacji preparatywnych. Duże ilości rozpuszczalników, takich jak metanol, mogą ograniczać pojemność masową kolumny ze względu na silne działanie rozpuszczalników, które mogą zniekształcić chromatografię. Wtrysk strumienia modyfikatora, standardowa, opatentowana konfiguracja wszystkich systemów SFC przygotowania Waters został zaprojektowany w celu zmniejszenia tego efektu rozpuszczalnika. Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest regularnie stosowany w laboratoriach oczyszczania do rozpuszczania wielu różnych rodzajów związków. Rysunki 2 i 3 ilustrują, w jaki sposób iniekcje DMSO w SFC mogą skutkować większym obciążeniem i lepszą rozdzielczością w zastosowaniach achiralnych w porównaniu z próbkami wstrzykiwanymi w metanolu.

Uwaga: W przypadku zastosowań chiralnych należy zachować ostrożność, ponieważ DMSO może poważnie uszkodzić tradycyjną, powlekaną chiralną fazę stacjonarną. Jeśli do rozpuszczalności próbki wymagane jest DMSO, należy wybrać unieruchomioną kolumnę chiralną.

Selektywność

W SFC, wiele kolumn jest rutynowo testowanych w celu określenia, która zapewnia najlepszą rozdzielczość i kształt piku dla składników w mieszaninie. Dobra rozdzielczość między związkami prowadzi do izolacji związków docelowych o wysokiej czystości. W poniższym przykładzie kolumna 2-etylopirydyny wykazuje doskonałe rozdzielenie wszystkich pięciu związków w mieszaninie próbki. Ta sama mieszanina próbek analizowana na kolumnie krzemionki wykazuje tylko trzy piki składników, ponieważ ma inną selektywność. Kumaryna i ibuprofen wymywają się po około 0,8 minuty, a flawon i fenoprofen uwalniają się nieco później. Flawon i ibuprofen również zmieniają kolejność elucji na kolumnie krzemionkowej. Ketoprofen jest dobrze oddzielony od wszystkich innych pików w obu kolumnach.

Skalowanie

Mieszaniny próbek surowych są zazwyczaj analizowane za pomocą gradientu przesiewowego, który zaczyna się od niskiego procentu rozpuszczalnika organicznego i kończy na wyższym procentu rozpuszczalnika organicznego w stosunkowo krótkim czasie. Jeśli interesujące związki są dobrze rozdzielone, gradient można skalować bezpośrednio w celu oczyszczenia. Gdy wszystkie związki eluują się przed zakończeniem gradientu i są w pełni rozdzielone, dopuszczalne jest proste zmniejszenie długości gradientu. Szybkie prędkości przepływu stosowane w SFC w połączeniu ze zmodyfikowanymi gradientami znacznie skracają całkowity czas potrzebny do oczyszczenia docelowych związków.

Skalowanie separacji wymaga dopasowania składu chemicznego kolumny i wielkości cząstek, a także odpowiednio przeskalowanych objętości wtrysku i gradientów. Kolumny SFC do preparatywności wody są wyposażone w technologię OBD, zapewniającą doskonałą stabilność złoża i wydajność porównywalną z kolumnami analitycznymi SFC Waters. Kolumny preparatywne układu OBD są upakowane do gęstości złoża, która jest ściśle zgodna z równoważną kolumną analityczną. Ta innowacyjna procedura pozwala uzyskać kolumny preparatywne o doskonałej stabilności, powtarzalności i wydajności.

Badanie obciążenia jest wykonywane na małej skali w celu określenia, ile masy próbki można załadować do kolumny. Celem jest maksymalizacja obciążenia bez uszczerbku dla rozdzielczości. Lepsza rozdzielczość pików prowadzi do większych obciążeń i lepszej czystości izolowanych związków. Większe obciążenie kolumny zmniejsza liczbę przebiegów wymaganych do uzyskania wystarczającej ilości materiału do kolejnych eksperymentów. Chromatografia z badania obciążenia jest przedstawiona na rysunku 5. Zachowawcza objętość iniekcji wynosząca 35 μl wykazuje dobrą rozdzielczość między wszystkimi związkami w mieszaninie, a następnie jest skalowana do przebiegu przygotowawczego na dużej kolumnie. Całkowita objętość 600 μL została wstrzyknięta na kolumnę preparatywną SFC o wymiarach 19 x 150 mm. Rysunek 6 porównuje chromatografię z wykorzystaniem zmodyfikowanego gradientu w małej skali przy maksymalnym obciążeniu z chromatografią wielkoskalową stosowaną do izolacji. Selektywność jest identyczna, co jest krytycznym czynnikiem przy użyciu chromatografii analitycznej jako narzędzia do wykrywania i oczyszczania. Różnice w czasie retencji i rozdzielczości między chromatogramami analitycznymi i preparatywnymi można przypisać takim czynnikom, jak objętość systemu i tryb wstrzykiwania. W szczególności opatentowany tryb wtrysku strumienia modyfikatora* jest stosowany we wszystkich preparatywnych systemach SFC firmy Waters, minimalizując efekt rozpuszczalnika, a tym samym poprawiając przepustowość i wydajność.
* Patent USA # 6,576,125

Dyskusja

• Podstawowe zasady chromatografii cieczowej można zastosować do chromatografii cieczowej w stanie nadkrytycznym (SFC).
• Chromatografia cieczowa w stanie nadkrytycznym może być przeprowadzana przy zwiększonych natężeniach przepływu, co przyspiesza izolację i zwiększa przepustowość.
• Próbki o ograniczonej rozpuszczalności można rozpuścić w dimetylosulfotlenku i oczyścić za pomocą SFC. Zastosowanie DMSO do rozpuszczania próbki ułatwia proces oczyszczania poprzez zmniejszenie niepewności związanej z rozpuszczalnością próbki.
• Rozdzielczość i obciążenie próbek rozpuszczonych w DMSO można poprawić w porównaniu z tymi samymi próbkami rozpuszczonymi w metanolu. Lepsza rozdzielczość próbki prowadzi do produktów o wyższej czystości. Większe obciążenie poprawia efektywność procesu oczyszczania.
• Selektywność kolumn wpływa na separację składników mieszaniny. Przesiewanie różnych kolumn z szybkimi gradientami prowadzi do podjęcia decyzji o tym, której kolumny przygotowawczej użyć do wyizolowania związków w próbce.
• Możliwość skalowania między analitycznymi i preparatywnymi kolumnami OBD prowadzi do identycznych separacji zarówno w małej, jak i dużej skali, pod warunkiem, że objętość wtrysku, nachylenie i czas gradientu są prawidłowo skalowane, a skład chemiczny i wielkość cząstek pozostają stałe. Skalowalność kolumn eliminuje niepewność w identyfikacji pików, ułatwiając w ten sposób wyższą wydajność procesu oczyszczania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stacja metodyczna System SFC	Wody	Więcej informacji dostępnych na stronie www.waters.com	Analityczny system
SFC SFC-UV Prep 100	Waters	Więcej informacji dostępnych na stronie www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Etylopirydyna, 4,6 x 150 mm, 5 μ m Wody kolumnowe		186004937	Analityczna kolumna chromatograficzna SFC
Viridis™ SFC 2-Etylopirydyna OBD™, 19 x 150 mm, 5 μ m Wody kolumnowe		186004945	Kolumna preparatywnej chromatografii chromatograficznej SFC
Viridis™ SFC Krzemionka OBD™, 19 x 150 mm, 5 μ m Wody kolumnowe		186004918	Przygotowawcza kolumna chromatograficzna SFC
Viridis™ SFC 2-Etylopirydyna OBD™, 19 x 100 mm, 5 μ m Wody kolumnowe		186004944	Kolumna preparatywnej chromatografii SFC