Ocena kopania nor, budowy gniazd i gromadzenia zapasów u myszy

Podsumowanie

Kopanie nor, budowanie gniazd i gromadzenie zapasów to typowe dla gatunku czynności, które myszy chętnie wykonują w warunkach laboratoryjnych. Niniejszy artykuł opisuje, w jaki sposób można je w prosty i niedrogi sposób ocenić. Protokoły te są niezwykle wrażliwe na szczep myszy, uszkodzenia mózgu oraz choroby. Co więcej, stanowią one „wzbogacenie środowiskowe” dla myszy i ucieleśniają aspekt „Udoskonalenia” (Refinement) zasady „3R”18.

Streszczenie

Pogorszenie zdolności do wykonywania „czynności życia codziennego” (ADL) jest wczesnym objawem choroby Alzheimera (AD). Prekliniczne przesiewowe badania behawioralne potencjalnych metod leczenia AD koncentrują się obecnie głównie na testach poznawczych, które często wymagają kosztownego sprzętu i dużego nakładu czasu eksperymentatora. Jednakże ludzka pamięć epizodyczna (aspekt pamięci najbardziej dotknięty w przebiegu AD) różni się od pamięci gryzoni, która wydaje się być w dużej mierze nieepizodyczna. W związku z tym obecne metody przesiewowe w poszukiwaniu nowych terapii AD u gryzoni są z natury mało prawdopodobne do sukcesu. Nowym podejściem do badań preklinicznych byłaby charakterystyka ADL u myszy. Przypadkowo w Oksfordzie opracowano ostatnio kilka takich testów, a w niniejszej pracy przedstawiono trzy z nich, które są najczulsze i najlepiej scharakteryzowane.

Metoda badania kopania w podłożu (burrowing) została opracowana po raz pierwszy w Oxfordzie¹³. Wynikła ona z potrzeby stworzenia paradygmatu badania gromadzenia zapasów u myszy. Większość opublikowanych paradygmatów gromadzenia zapasów u gryzoni wymagała połączenia odległego źródła pokarmu z klatką domową za pomocą łącznika. Wiązało się to z koniecznością modyfikacji klatki domowej, a także zbudowania szczelnego łącznika i źródła pokarmu, z których myszy nie mogłyby się wydostać. Rozważano zatem, czy możliwe byłoby umieszczenie źródła pokarmu wewnątrz klatki. Stwierdzono, że jeśli pojemnik zostanie umieszczony na dnie klatki, zostanie on opróżniony do następnego ranka. Granulaty pokarmowe były jednak po prostu składowane w kopcu przy wejściu do pojemnika, a nie przenoszone w odseparowane miejsce z dala od pojemnika, czego należałoby się spodziewać, gdyby myszy rzeczywiście gromadziły zapasy. Szczegółowa obserwacja wykazała, że myszy wykonują ruchy kopania („burrowing”), a nie przenoszą granulaty w pyskach do wybranego miejsca, co robiłyby w przypadku rzeczywistego gromadzenia zapasów.⁶

Granulaty paszowe nie są niezbędnym podłożem do kopania; myszy opróżnią rurki wypełnione piaskiem, żwirem, a nawet zabrudzoną ściółką z własnej klatki. Co więcej, opróżnią pełną rurkę nawet wtedy, gdy obok niej zostanie umieszczona rurka pusta⁸.

W literaturze istnieje kilka protokołów gniazdowania. Przedstawiony tutaj protokół oksfordzki upraszcza procedurę i posiada dobrze zdefiniowany system oceny jakości gniazda⁵.

Później opracowano paradygmat gromadzenia zapasów, w którym myszy, zamiast znosić pokarm do właściwej klatki domowej, zostały przystosowane do życia w „bazie domowej” aparatu do gromadzenia. Baza domowa ta była połączona rurką wykonaną z drucianej siatki, której dalszy koniec zawierał źródło pokarmu. Takie rozwiązanie okazało się zapewniać prawidłowe zachowania gromadzenia zapasów, pod warunkiem że myszy były przystosowane do przebywania w „bazie domowej” w ciągu dnia i miały dostęp do rurki do gromadzenia zapasów wyłącznie w nocy.

Protokół

1. Kopanie nor

1. Aparatura

Przetestowano różne konstrukcje pojemników (na przykład metalowy dzbanek, który można było łatwo czyścić, jednak myszy niechętnie do niego wchodziły). Ostatecznie odkryto, że wydajnym elementem aparatury jest odcinek plastikowej rury spustowej (stosowanej w systemach rynnowych w domach), lekko uniesiony na jednym końcu, aby zapobiec przypadkowemu (niezamierzonemu) wypadaniu granulek pokarmu, i zamknięty na drugim końcu. Nory są obecnie wykonywane z plastikowej rury spustowej o średnicy 68 mm, pociętej na odcinki o długości 20 cm (Rysunek 1). Jeden koniec jest uszczelniony korkiem z płyty MDF o grubości 12 mm. (Przy pracy z płytą MDF zaleca się stosowanie ochrony dróg oddechowych). W celu czyszczenia i zapewnienia wodoszczelności, na powierzchnie wewnętrzne i zewnętrzne płyty MDF można nałożyć wodoodporną masę uszczelniającą, która służy również do przyklejenia jej do rury koparskiej. Wkręty maszynowe (o długości 5 cm) są wykorzystywane do uniesienia drugiego końca rury na wysokość 3 cm nad podłogą. W rurze koparskiej, 1 cm od otwartego końca, wierci się dwa otwory pod kątem 90°, a następnie wkręca i dokręca śruby⁴.

Średnica nor jest prawdopodobnie krytyczna; Schmid-Holmes i wsp.¹⁹ zaobserwowali, że myszy w naturze „czyściły nory” głównie z tych, których rozmiar był zbliżony do naszych nor sztucznych.

Rysunek 1. Mysz w tubie do kopania.

2. Procedura

1. Habituacja
   Kopanie nor jest zazwyczaj spontaniczne, jednak występuje w nim pewien element uczenia się. Proces ten jest wzmacniany przez facylitację społeczną. Dlatego należy umieścić pełną norę na noc w grupowej klatce myszy, które mają zostać później poddane testom po zastosowaniu zabiegu. Każda nora jest wypełniona 200 g granulek paszowych stosowanych normalnie w diecie. (Dotyczy to gęstego, prasowanego rodzaju paszy; w przypadku stosowania paszy „ekspandowanej” nora pomieści mniej niż 200 g). Eksperymentatorzy powinni wziąć pod uwagę takie czynniki podczas wyboru podłoża do kopania.
   
   Jeśli myszy są poddawane racjonowaniu pokarmu (na przykład w celu zmotywowania ich do jednoczesnego wykonywania zadania uczenia się w labiryncie), można stosować substancje niepokarmowe, np. kulki gliniane (stosowane do wyścielania powierzchni gleby w doniczkach do roślin doniczkowych), żwir grochowy (małe kamienie o średnicy ~1 cm) oraz piasek. Żwir grochowy i piasek, będąc trzykrotnie cięższe od granulek paszy, są użytecznymi zamiennikami paszy w sytuacjach, gdy myszy kopią bardzo intensywnie, aby uniknąć tzw. „efektu sufitu”.
2. Wyznaczanie linii bazowej
   Należy przeprowadzić (najlepiej dwa) testy kopania bazowego w odstępach 48 h, w ten sam sposób, w jaki będą przeprowadzane testy po proponowanym zabiegu. Test optymalnie rozpoczyna się około godziny 16:00, jeśli myszy są utrzymywane w cyklu ciemno-jasnym 0700-1900 h. Jest to wrażliwy czas testowania, ponieważ myszy zazwyczaj nie są wtedy przebudzone, a kopanie rozpoczyna się wolniej niż w momencie, gdy są już w fazie ciemnej i w konsekwencji bardzo aktywne. Po dwóch godzinach od rozpoczęcia wykonuje się pomiar „migawkowy” wagi zakopanej paszy; zawartość nory wysypuje się do tarytowanego pojemnika i waży, a następnie granulki umieszcza się z powrotem w norze, którą wkłada się do klatki. Jeśli mysz znajduje się w norze, należy ją wraz z zawartością delikatnie przelać do pojemnika wagowego, a następnie umieścić mysz z powrotem w klatce. Ilość zakopanej paszy po dwóch godzinach oblicza się poprzez odjęcie wagi od początkowych 200 g. Ostateczny odczyt wykonuje się następnego ranka. Czas nie jest krytyczny, ponieważ myszy wróciły już do snu (często w norze) i nie kopią już aktywnie. Pomiar z 2 h wykonany podczas drugiej próby należy wykorzystać do utworzenia grup zrównoważonych pod względem wyników bazowych. Ponieważ zdolność kopania wzrasta wraz z praktyką¹⁷, wyznaczanie linii bazowej pomaga również myszom osiągnąć bardziej stabilną wydajność asymptotyczną, co lepiej ujawnia efekty zastosowanego zabiegu.
3. Testowanie
   W celu testowania, po podaniu zabiegów, myszy poddaje się testowi kopania dokładnie w taki sam sposób, jak na etapie wyznaczania linii bazowej. Jeśli test kopania ma być stosowany chronicznie, zaleca się, aby testy dzieliło co najmniej 48 h, aby zapobiec spadkowi wydajności wynikającemu z nadmiernej ekspozycji na procedurę.
4. Uwaga
   NIE należy przekładać zakopanej paszy z dna klatki z powrotem do nory. Nawet jeśli mysz nic nie zakopała, należy przeprowadzić procedurę ważenia tak, jak gdyby kopanie miało miejsce; zakłócenie spowodowane ważeniem ma tendencję do stymulowania zachowania, a myszy, które zakopały już część podłoża, często zaczynają kopać z nową energią po zakończeniu procesu ważenia.

2. Oczekiwane wyniki

Myszy C57~BL/6 zazwyczaj przekopują około 70 g w ciągu pierwszych dwóch godzin i blisko 200 g w ciągu nocy. Myszy z uszkodzeniami hipokampa często przekopują mniej niż 5 g¹¹ (Rycina 2). Choroba prionowa hamuje kopanie nor^1,2, podobnie jak podanie lipopolisacharydu²⁰. Test kopania nor pozwala wykryć chorobę prionową (scrapie) w 10–12 tygodniu po wstrzyknięciu homogenatu chorego mózgu, podczas gdy objawy kliniczne pojawiają się dopiero w 22 tygodniu¹³ (Rycina 3). Wykazano, że kopanie nor jest wrażliwe na różnice między szczepami¹⁵ oraz na nokaut podjednostek kanałów potasowych¹⁰.

Rycina 2. Masa granulek pokarmu (mediany i rozstępy międzykwartylne) zakopanych w ciągu dwóch godzin przez myszy kontrolne i myszy z uszkodzeniem hipokampa. Te drugie zakopały znacznie mniej niż grupa kontrolna (P = 0.0001).

Rycina 3. Masa granulek pokarmu (średnie) zakopanych przez noc przez myszy kontrolne oraz myszy zainfekowane scrapie. Zdolność zakopywania zwiększa się (wraz z praktyką) w obu grupach od 7. do 10. tygodnia po iniekcji, jednak od 12. tygodnia aktywność ta spada w grupie z scrapie, a różnica między grupami staje się istotna statystycznie (przekracza dwa błędy standardowe średniej).

3. Dyskusja

Przetestowaliśmy kopanie nor u innych gatunków gryzoni – szczurów, gerbilów, chomików oraz myszy kolczastych egipskich⁸. Wszystkie, z wyjątkiem tych ostatnich, mogły zostać pobudzone do kopania w znacznych ilościach podłoży naziemnych, takich jak żwir lub piasek, jednak kopanie w granulkach pokarmowych występowało znacznie rzadziej, nawet po dużym doświadczeniu z materiałami naziemnymi. Przyczyna tej różnicy w stosunku do myszy nie jest znana. Po zakończeniu tych prac odkryto, że myszy kolczaste egipskie w rzeczywistości nie kopią nor w naturze; mogą one zajmować nory wykopane przez gerbile, ponadto powierzchnia ich naturalnego siedliska często składa się z twardych skał. Niedawne obserwacje w Nairobi wykazały, że w obrębie rodzaju Acomys, mysz kolczasta Wilsona (Acomys wilsoni) oraz mysz kolczasta Percivala (Acomys percivali), które kopią nory w naturze, kopią je również w warunkach laboratoryjnych.

4. Gniazdowanie

1. Aparatura

Test ten przeprowadza się w oddzielnych klatkach; odpowiednie są te same, które stosowano do badania kopania nor. Podłoże powinno pokrywać dno klatki do głębokości 0.5 cm. (Zmienność głębokości oraz bardzo głęboka ściółka mogą wpływać na konstrukcję gniazda). Każda klatka jest wyposażona w „Nestlet”, czyli kwadrat z prasowanej waty bawełnianej o boku 5 cm (Ancare).

2. Procedura

Myszy umieszcza się pojedynczo w klatkach z materiałem do budowy gniazd około godziny przed fazą ciemną, a wyniki ocenia się następnego ranka. Podobnie jak w przypadku kopania nor i z podobnych przyczyn, dokładny czas przeprowadzenia procedury nie jest krytyczny.

3. Punktacja

Gniazda ocenia się w 5-stopniowej skali (Ryciny 4-8), a następnie waży się ilość niepodartego materiału Nestlet⁵.

1. Nestlet jest w dużej mierze nienaruszony (>90% nienaruszone).
2. Nestlet jest częściowo rozszarpany (pozostało 50-90% nienaruszonego materiału).
3. Nestlet jest w większości poszatkowany, lecz często nie można zidentyfikować miejsca gniazdowania: < 50% Nestletu pozostaje nienaruszone, ale < 90% materiału znajduje się w obrębie jednej czwartej powierzchni dna klatki, tzn. wata nie jest zgromadzona w gnieździe, lecz rozrzucona po klatce. Uwaga: materiał może czasami znajdować się w szeroko zdefiniowanym obszarze gniazda, jednak kluczową definicją jest to, że 50-90% zostało poszatkowane.
4. Zidentyfikowane, lecz płaskie gniazdo: > 90% Nestletu jest rozszarpane, materiał jest zgromadzony w gnieździe w obrębie jednej czwartej powierzchni dna klatki, ale gniazdo jest płaskie, a ściany wyższe niż wysokość ciała myszy (zwiniętej bokiem) występują na mniej niż 50% jego obwodu.
5. Gniazdo (niemal) idealne: > 90% Nestletu jest rozszarpane, gniazdo ma formę krateru, a ściany wyższe niż wysokość ciała myszy występują na więcej niż 50% jego obwodu.

W przypadku rozbieżności między kryteriami należy przyjąć wartość pośrednią. Na przykład idealne gniazdo z nieposzarpanym kawałkiem o masie 0.7g otrzymałoby ocenę 4.5.

Rysunek 4. Wynik budowy gniazda 1

Rycina 5. Wynik budowania gniazda 2

Rysunek 6. Wynik budowy gniazda 3

Rycina 7. Wynik budowania gniazda 4

Rysunek 8. Wynik budowy gniazda 5

4. Oczekiwane wyniki

Zarówno samce, jak i samice budują gniazda, ponieważ służą one termoregulacji, a także są związane z rozprodukcją. W przypadku myszy C57BL/6 oceny budowy gniazd dla samców i samic mieszczą się w tym samym zakresie, choć nie przeprowadzono kontrolowanego porównania w ramach jednego eksperymentu. Większość myszy C57BL/6 uzyskuje 4-5 punktów za budowę gniazda, jednak w przypadku uszkodzenia hipokampa mediana ocen wynosi około 1-2; mało prawdopodobne jest przekroczenie oceny 3 (Rysunek 9). Budowa gniazd okazała się również wrażliwą metodą wykrywania chorób prionowych w okolicach 10-12 tygodnia^1,2,16.

Rysunek 9. Wyniki budowy gniazd (mediany i rozstępy międzykwartylowe) dla myszy kontrolnych oraz myszy z uszkodzeniami grzbietowej, brzusznej i całkowitej części hipokampa. Tylko myszy z całkowitym uszkodzeniem wykazują zahamowanie budowy gniazd, zatem efekty selektownych uszkodzeń obszarów grzbietowego i brzusznego wydają się być poniżej progu, lecz mają charakter addytywny.

5. Gromadzenie zapasów

1. Aparatura

Seria „baz domowych” jest połączona z rurkami wykonanymi z drucianej siatki, które są trwale uszczelnione na końcu dystalnym, gdzie umieszcza się pellety z pokarmem, oraz tymczasowo na końcu proksymalnym za pomocą drewnianego korka. Stosuje się to w celu zapobieżenia wchodzeniu myszy do rurek przed zakończeniem adaptacji do bazy domowej7.

Aparaturę (Rysunek 10) można wykonać na różne sposoby, pod warunkiem przestrzegania podstawowych zasad. Nasza składa się z rzędu 8 drewnianych pudełek o wymiarach 30 x 13 x 15 cm każdy, z przezroczystymi pokrywami z pleksiglasu. Każde jest wyposażone w butelkę z wodą i posiada otwór z tyłu, w który wciskana jest rurka do gromadzenia zapasów. Rurki wykonane są z czarnego plastiku, mają 10 cm długości i 40 mm średnicy, i są połączone z rurką z drucianej siatki o długości 45 cm i średnicy 4 cm, co daje łączną długość 50 cm. Siatka składa się z oczek o boku 13 mm i jest podwójnie zwinięta z przesunięciem oczek, aby zmniejszyć otwory w siatce i zapobiec wypadaniu granulek pokarmu. Jeśli dostępna jest siatka o oczkach 6 mm, jest to lepszy materiał, gdyż wystarczy jedna warstwa. Dalszy koniec rurki, w którym umieszcza się granulki pokarmu, jest zamknięty. Koniec bliższy jest uszczelniony wyjmowanym drewnianym korkiem.

Rycina 10. Myszy w rurkach do gromadzenia zapasów

2. Procedura

1. Zazwyczaj gromadzenie zapasów jest bardzo zmienne podczas pierwszej próby i niektóre myszy mogą go w ogóle nie wykazywać. Gromadzenie, podobnie jak kopanie nor, ulega poprawie wraz z praktyką. Dlatego, o ile pozwala na to plan eksperymentu, sesje wyznaczania wartości bazowej najlepiej przeprowadzić przed zastosowaniem zabiegu. Oczywiście nie jest to praktyczne, jeśli zmienna niezależna jest wrodzona, jak w przypadku myszy mutantów (niekondycjonalnych) lub podczas testowania różnych szczepów myszy.
2. Na początku dnia każdą mysz umieszcza się w osobnej klatce w celu habituacji. W klatce znajduje się tunel tekturowy, który przebywał w rzeczywistej klatce grupowej przez co najmniej jedną noc, a także obfita porcja zużytej ściółki, aby mysz czuła się jak „w domu”. Dostęp do rurki do gromadzenia zapasów jest zablokowany drewnianym korkiem aż do wieczora. 100 g granulek pokarmowych (mieszanka małych i dużych) umieszcza się na dystalnym końcu rurki do gromadzenia zapasów (wsypując je z drugiego końca przy pionowym ustawieniu rurki). Aby upewnić się, że mysz jest lekko głodna przed rozpoczęciem testu, w klatce domowej nie podaje się pokarmu.
3. Tuż przed rozpoczęciem fazy ciemnej należy wyjąć drewniany korek, aby umożliwić myszy dostęp do rurki do gromadzenia zapasów. Następnego ranka (ponownie, czas nie jest krytyczny) należy zebrać i zważyć wszystkie granulki pokarmowe, które zostały zgromadzone w klatce bazy domowej.

6. Oczekiwane wyniki

W przypadku samic myszy C57BL/6 mediana gromadzonej ilości pokarmu wynosiłaby około 50-70 g. Uszkodzenia hipokampa silnie hamują gromadzenie11, podczas gdy uszkodzenia kory przedczołowej mają jedynie słaby wpływ¹² (Rysunek 11).

Rysunek 11. Masa granulek pokarmu zgromadzonych przez myszy z grupy kontrolnej oraz myszy z uszkodzeniem przyśrodkowej kory przedczołowej (mediany i rozstępy międzykwartylowe). Chociaż mediany znacznie się różnią, wysoka zmienność w grupie kontrolnej sprawia, że wynik jest daleki od istotności statystycznej (P = 0.3).

Dyskusja

Testy te są niezwykle proste w wykonaniu, a uzyskane wielkości efektu są bardzo duże, co sprawia, że są one wyjątkowo czułe na zastosowane terapie, różnice między szczepami i inne czynniki. Są one zgodne z aspektem „Udoskonalenia” (Refinement) zasady 3R zaproponowanej przez Russella i Burcha¹⁸. W rzeczywistości dobre wyniki w testach takich jak kopanie nor wydają się być wskaźnikiem ogólnego stanu zdrowia zwierząt. W związku z tym może to być wartościowy test do oceny dobrostanu zwierząt.

Znaczenie wzbogacenia środowiskowego dla gryzoni laboratoryjnych jest obecnie powszechnie uznawane. Zapewnienie materiału do budowy gniazd jest obecnie standardową praktyką w wielu pomieszczeniach dla zwierząt i jest to łatwe do zrealizowania. Entuzjazm, z jakim myszy kopią tunele, sprawia, że możliwość kopania jest potencjalnie doskonałą formą wzbogacenia, jednak niestety nie opracowano jeszcze „samoodnawialnego” podłoża do kopania, które stanowiłoby praktyczny sposób realizacji tej potrzeby. Nie ustalono jeszcze, czy myszy uznają gromadzenie zapasów za formę wzbogacenia środowiskowego.

Jedną z wad jest to, że dane generowane przez te testy są zazwyczaj nieparametryczne (nie mają rozkładu Gaussa), dlatego do ich analizy wymagane są odpowiednie statystyki nieparametryczne, np. test U Manna-Whitneya dla porównań parzystych lub ANOVA Kruskala-Wallisa dla danych z wielu grup. W przypadku zastosowania planów z powtarzanymi pomiarami, ze względu na brak odpowiedniego testu ANOVA dla danych nieparametrycznych, wyniki można przekształcić, np. za pomocą procedur pierwiastkowania lub logarytmowania, aby dopasować je do rozkładu bardziej zbliżonego do normalnego.

Wymiary aparatury mogą nieco różnić się od tych określonych w tekście (co jest przydatne dla eksperymentatorów z USA), jednak należy unikać znacznych rozbieżności. Niemniej jednak w niektórych przypadkach inni badacze mogą uznać, że konstrukcje odmienne od opisanych tutaj sprawdzają się lepiej.

Podobnie jak w przypadku wszystkich pomiarów behawioralnych, należy zbadać myszy, aby sprawdzić, czy ich poziomy aktywności są prawidłowe, ponieważ brak aktywności będzie miał oczywisty niekorzystny wpływ na zachowania typowe dla gatunku. W przypadku myszy zainfekowanych scrapie, u których stwierdzono upośledzenie kopania nor i budowania gniazd, poziomy aktywności były prawidłowe (badane w aparacie open field). Co więcej, okres hiperaktywności występuje około 2-4 tygodnie po tym, jak te typowe dla gatunku zachowania zostaną po raz pierwszy upośledzone².

Silne upośledzenie kopania nor, budowania gniazd i gromadzenia zapasów – które są wszystkimi zachowaniami typowymi dla tego gatunku – wywołane przez uszkodzenia hipokampa, uzupełnia deficyty w uczeniu się przestrzennym i pamięci9, będące dobrze udokumentowanymi efektami tych uszkodzeń. Wydają się one być równoważne upośledzeniu czynności życia codziennego, tak charakterystycznemu dla choroby Alzheimera¹⁴.

Te testy typowe dla gatunku mogą okazać się niezwykle użyteczne w badaniach przedklinicznych nad metodami leczenia choroby Alzheimera oraz innych chorób neurodegeneracyjnych¹⁴. W wielu schorzeniach mózgu u ludzi utrata lub ograniczenie zdolności do wykonywania normalnych, codziennych czynności jest tak samo istotne, jak inne cechy choroby, takie jak zaburzenia poznawcze. W szczególności utrata ta może wymuszać angażowanie opiekunów, co często wiąże się z dużym obciążeniem społeczno-ekonomicznym.