Ocena kopania nor, budowy gniazd i gromadzenia zapasów u myszy

Podsumowanie

Kopanie nor, budowanie gniazd i gromadzenie zapasów to typowe dla gatunku czynności, które myszy chętnie wykonują w warunkach laboratoryjnych. Niniejszy artykuł opisuje, w jaki sposób można je w prosty i niedrogi sposób ocenić. Protokoły te są niezwykle wrażliwe na szczep myszy, uszkodzenia mózgu oraz choroby. Co więcej, stanowią one „wzbogacenie środowiskowe” dla myszy i ucieleśniają aspekt „Udoskonalenia” (Refinement) zasady „3R”18.

Streszczenie

Pogorszenie zdolności do wykonywania „czynności życia codziennego” (ADL) jest wczesnym objawem choroby Alzheimera (AD). Prekliniczne przesiewowe badania behawioralne potencjalnych metod leczenia AD koncentrują się obecnie głównie na testach poznawczych, które często wymagają kosztownego sprzętu i dużego nakładu czasu eksperymentatora. Jednakże ludzka pamięć epizodyczna (aspekt pamięci najbardziej dotknięty w przebiegu AD) różni się od pamięci gryzoni, która wydaje się być w dużej mierze nieepizodyczna. W związku z tym obecne metody przesiewowe w poszukiwaniu nowych terapii AD u gryzoni są z natury mało prawdopodobne do sukcesu. Nowym podejściem do badań preklinicznych byłaby charakterystyka ADL u myszy. Przypadkowo w Oksfordzie opracowano ostatnio kilka takich testów, a w niniejszej pracy przedstawiono trzy z nich, które są najczulsze i najlepiej scharakteryzowane.

Metoda badania kopania w podłożu (burrowing) została opracowana po raz pierwszy w Oxfordzie¹³. Wynikła ona z potrzeby stworzenia paradygmatu badania gromadzenia zapasów u myszy. Większość opublikowanych paradygmatów gromadzenia zapasów u gryzoni wymagała połączenia odległego źródła pokarmu z klatką domową za pomocą łącznika. Wiązało się to z koniecznością modyfikacji klatki domowej, a także zbudowania szczelnego łącznika i źródła pokarmu, z których myszy nie mogłyby się wydostać. Rozważano zatem, czy możliwe byłoby umieszczenie źródła pokarmu wewnątrz klatki. Stwierdzono, że jeśli pojemnik zostanie umieszczony na dnie klatki, zostanie on opróżniony do następnego ranka. Granulaty pokarmowe były jednak po prostu składowane w kopcu przy wejściu do pojemnika, a nie przenoszone w odseparowane miejsce z dala od pojemnika, czego należałoby się spodziewać, gdyby myszy rzeczywiście gromadziły zapasy. Szczegółowa obserwacja wykazała, że myszy wykonują ruchy kopania („burrowing”), a nie przenoszą granulaty w pyskach do wybranego miejsca, co robiłyby w przypadku rzeczywistego gromadzenia zapasów.⁶

Granulaty paszowe nie są niezbędnym podłożem do kopania; myszy opróżnią rurki wypełnione piaskiem, żwirem, a nawet zabrudzoną ściółką z własnej klatki. Co więcej, opróżnią pełną rurkę nawet wtedy, gdy obok niej zostanie umieszczona rurka pusta⁸.

W literaturze istnieje kilka protokołów gniazdowania. Przedstawiony tutaj protokół oksfordzki upraszcza procedurę i posiada dobrze zdefiniowany system oceny jakości gniazda⁵.

Później opracowano paradygmat gromadzenia zapasów, w którym myszy, zamiast znosić pokarm do właściwej klatki domowej, zostały przystosowane do życia w „bazie domowej” aparatu do gromadzenia. Baza domowa ta była połączona rurką wykonaną z drucianej siatki, której dalszy koniec zawierał źródło pokarmu. Takie rozwiązanie okazało się zapewniać prawidłowe zachowania gromadzenia zapasów, pod warunkiem że myszy były przystosowane do przebywania w „bazie domowej” w ciągu dnia i miały dostęp do rurki do gromadzenia zapasów wyłącznie w nocy.

Protokół

1. Kopanie nor

1. Aparatura

Wypróbowano różne konstrukcje pojemników (na przykład metalowy dzbanek, który można było łatwo wyczyścić, jednak myszy niechętnie do niego wchodziły). Ostatecznie odkryto, że efektywnym elementem aparatury jest odcinek plastikowej rury spustowej (stosowanej w rynnach domowych), lekko uniesiony na jednym końcu, aby zapobiec przypadkowemu (niezamierzonemu) wysunięciu granulek pokarmu, i zamknięty na drugim końcu. Nory są obecnie wykonywane z plastikowej rury spustowej o średnicy 68 mm, pociętej na odcinki o długości 20 cm (Rysunek 1). Jeden koniec jest uszczelniony korkiem z płyty MDF o grubości 12 mm. (Podczas pracy z płytą MDF zaleca się stosowanie ochrony dróg oddechowych). W celu zapewnienia czystości i wodoszczelności, na powierzchnie wewnętrzne i zewnętrzne płyty MDF można nałożyć wodoodporną masę uszczelniającą, która służy również do przyklejenia jej do rury do kopania. Wkręty maszynowe (o długości 5 cm) są wykorzystywane do uniesienia drugiego końca rury na wysokość 3 cm nad podłogą. 1 cm od otwartego końca rury do kopania wierci się dwa otwory pod kątem 90°, w których następnie wkręca się i dokręca śruby⁴.

Średnica nor jest prawdopodobnie kluczowa; Schmid-Holmes i wsp.¹⁹ zaobserwowali, że myszy w naturze „czyściły nory” głównie w norach o rozmiarach zbliżonych do naszych sztucznych konstrukcji.

Rysunek 1. Mysz w rurce do kopania.

2. Procedura

1. Habituacja
   Kopanie nor zwykle odbywa się spontanicznie, jednak występuje w tym procesie pewien element uczenia się. Proces ten jest wzmacniany przez facylitację społeczną. Dlatego należy umieścić pełną norę na noc w klatce zbiorowej myszy, które zostaną później poddane testowaniu po zastosowaniu zabiegu. Każda nora jest wypełniona 200 g granulek paszowych stosowanych normalnie w diecie. (Dotyczy to gęstego typu paszy prasowanej; jeśli stosowana jest pasza „ekspandowana”, nora pomieści mniej niż 200 g). Eksperymentatorzy powinni wziąć pod uwagę takie czynniki podczas wyboru podłoża do kopania.
   
   Jeśli myszy są na racjonowaniu pokarmu (na przykład w celu zmotywowania ich do jednoczesnego przejścia zadania uczenia się w labiryncie), można zastosować substancje niejadalne, np. kulki gliniane stosowane do wyścielania powierzchni gleby w doniczkach do roślin doniczkowych, żwir grochowy (małe kamienie o średnicy ~1 cm) oraz piasek. Żwir grochowy i piasek, będąc trzykrotnie cięższe od granulek paszy, są użytecznymi zamiennikami paszy w przypadku, gdy myszy kopią bardzo intensywnie, aby uniknąć tzw. „efektu sufitu”.
2. Ustalanie wartości bazowej
   Przeprowadź (najlepiej dwa) testy bazowe kopania w odstępach 48 h w ten sam sposób, w jaki będą przeprowadzane testy po planowanym zabiegu. Test optymalnie rozpoczyna się około godziny 16:00, jeśli myszy są utrzymywane w cyklu ciemno-jasnym 0700-1900 h. Jest to wrażliwy moment na testowanie, ponieważ myszy nie są wtedy zazwyczaj rozbudzone, a kopanie rozpoczyna się wolniej niż gdyby znajdowały się w zaawansowanej fazie ciemnej i w konsekwencji były bardzo aktywne. Dwie godziny po rozpoczęciu wykonuje się pomiar „migawkowy” wagi pokarmu, który został zakopany; zawartość nory wysypuje się do tarytowanego pojemnika i waży, a następnie granulki umieszcza z powrotem w norze, którą wkłada się do klatki. Jeśli mysz znajduje się w norze, należy ją delikatnie przelać wraz z zawartością do pojemnika wagowego, a następnie umieścić mysz z powrotem w klatce. Wagę zakopanego pokarmu po dwóch godzinach oblicza się poprzez odjęcie od począgowych 200 g. Ostateczny odczyt wykonuje się następnego ranka. Moment pomiaru nie jest krytyczny, ponieważ myszy zdążą już wrócić do snu (często w norze) i nie kopią już aktywnie. Wykorzystaj pomiar z 2 h wykonany podczas drugiej próby, aby utworzyć grupy zrównoważone pod względem wyników bazowych. Ponieważ intensywność kopania wzrasta wraz z praktyką¹⁷, ustalanie wartości bazowej pomaga również myszom osiągnąć bardziej stabilną wydajność asymptotyczną, co lepiej ujawnia efekty zabiegu.
3. Testowanie
   W celu testowania, po podaniu zabiegów, myszy poddaje się testowi kopania dokładnie w ten sam sposób, co w etapie ustalania wartości bazowej. Jeśli test kopania ma być stosowany chronicznie, zaleca się, aby testy dzieliło co najmniej 48 h, aby zapobiec spadkowi wydajności wynikającemu z nadmiernej ekspozycji na procedurę.
4. Uwaga
   NIE należy przekładać zakopanego pokarmu z dna klatki z powrotem do nory. Nawet jeśli mysz nic nie zakopała, przeprowadź procedurę ważenia tak, jak gdyby kopanie miało miejsce; zakłócenie spowodowane ważeniem ma tendencję do stymulowania zachowania, a myszy, które zakopały już część podłoża, często zaczynają kopać z odnowioną energią po procesie ważenia.

2. Oczekiwane wyniki

Myszy C57~BL/6 zazwyczaj kopią tunele o masie około 70 g w ciągu pierwszych dwóch godzin i blisko 200 g w ciągu nocy. Myszy z uszkodzeniami hipokampa często kopią mniej niż 5 g¹¹ (Rysunek 2). Choroby prionowe hamują kopanie^1,2, podobnie jak podawanie lipopolisacharydu²⁰. Test kopania pozwala wykryć chorobę prionową (scrapie) w 10–12 tygodniu po wstrzyknięciu homogenatu chorego mózgu, podczas gdy objawy kliniczne pojawiają się dopiero w 22 tygodniu¹³ (Rysunek 3). Wykazano, że kopanie jest wrażliwe na różnice między szczepami¹⁵ oraz na nokaut podjednostek kanałów potasowych¹⁰.

Rycina 2. Masa granulek pokarmu (mediany i rozstępy międzykwartylowe) zakopanych w ciągu dwóch godzin przez myszy kontrolne oraz myszy z uszkodzeniem hipokampa. Te ostatnie zakopały znacząco mniej niż grupa kontrolna (P = 0.0001).

Rysunek 3. Masa granulek pokarmowych (średnie) zakopanych w ciągu nocy przez myszy kontrolne i myszy zakażone scrapie. Zdolność zakopywania wzrasta (wraz z praktyką) w obu grupach od 7. do 10. tygodnia po iniekcji, jednak od 12. tygodnia zakopywanie spada w grupie z scrapie, a różnica między grupami staje się istotna statystycznie (przekracza dwa błędy standardowe średniej).

3. Dyskusja

Przetestowaliśmy kopanie nor u innych gatunków gryzoni – szczurów, gerbilów, chomików i myszy kolczastych egipskich⁸. Wszystkie, z wyjątkiem tych ostatnich, mogły zostać skłonione do przekopywania znacznych ilości substratów lądowych, takich jak żwir lub piasek, jednak kopanie w pelletach paszowych występowało znacznie rzadziej, nawet po zdobytym doświadczeniu z materiałami lądowymi. Przyczyna tej różnicy w stosunku do myszy nie jest znana. Po zakończeniu tych prac odkryto, że myszy kolczaste egipskie w rzeczywistości nie kopią nor w naturze; mogą one zajmować nory wykopane przez gerbile, a powierzchnia ich naturalnego siedliska często składa się z twardej skały. Niedawne obserwacje w Nairobi wykazały, że w obrębie rodzaju Acomys, mysz kolczasta Wilsona (Acomys wilsoni) oraz mysz kolczasta Percivala (Acomys percivali), które kopią nory w naturze, kopią je również w warunkach laboratoryjnych.

4. Gniazdowanie

1. Aparatura

Test ten przeprowadza się w oddzielnych klatkach; odpowiednie są te same, które stosuje się do badania kopania nor. Podłoże powinno pokrywać dno klatki do głębokości 0,5 cm. (Zmiany głębokości oraz bardzo głęboka ściółka mogą wpływać na budowę gniazda). Każda klatka jest wyposażona w „Nestlet”, czyli kwadrat z prasowanej waty bawełnianej o boku 5 cm (Ancare).

2. Procedura

Myszy umieszcza się pojedynczo w klatkach z materiałem do budowy gniazd około godziny przed fazą ciemną, a wyniki ocenia się następnego ranka. Podobnie jak w przypadku kopania nor i z podobnych przyczyn, dokładny czas nie jest krytyczny.

3. Punktacja

Gniazda ocenia się w 5-stopniowej skali (Ryciny 4-8), a następnie waży się ilość nienaruszonego materiału Nestlet⁵.

1. Nestlet pozostaje w dużej mierze nienaruszony (>90% nienaruszonych fragmentów).
2. Nestlet jest częściowo rozszarpany (50-90% nienaruszonych fragmentów).
3. Nestlet jest w większości poszarpany, lecz często nie można zidentyfikować miejsca gniazdowania: < 50% Nestlet pozostaje nienaruszone, a < 90% materiału znajduje się w obrębie jednej czwartej powierzchni dna klatki, co oznacza, że bawełna nie jest zebrana w gniazdo, lecz rozproszona po klatce. Uwaga: materiał może czasami znajdować się w szeroko zdefiniowanym obszarze gniazda, jednak kluczowym kryterium jest to, że 50-90% zostało poszarpane.
4. Zidentyfikowane, ale płaskie gniazdo: > 90% Nestlet jest poszarpane, materiał jest zebrany w gniazdo w obrębie jednej czwartej powierzchni dna klatki, ale gniazdo jest płaskie, a jego ścianki są wyższe niż wysokość ciała myszy (zwiniętej na boku) na mniej niż 50% obwodu.
5. Gniazdo (niemal) idealne: > 90% Nestlet jest poszarpane, gniazdo ma kształt krateru, a jego ścianki są wyższe niż wysokość ciała myszy na więcej niż 50% obwodu.

W przypadku rozbieżności między kryteriami należy przyjąć wartość średnią. Na przykład idealne gniazdo z nieposzarpanym kawałkiem o masie 0,7g otrzymałoby ocenę 4,5.

Rycina 4. Wynik gniazdowania 1

Rysunek 5. Wynik gniazdowania 2

Rycina 6. Wynik gniazdowania 3

Rysunek 7. Wynik gniazdowania 4

Rysunek 8. Wynik budowania gniazda 5

4. Oczekiwane wyniki

Zarówno samce, jak i samice budują gniazda, ponieważ służą one termoregulacji oraz są związane z reprodukcją. W przypadku myszy C57BL/6 oceny budowy gniazd dla samców i samic mieszczą się w tym samym zakresie, choć nie przeprowadziliśmy kontrolowanego porównania w ramach jednego eksperymentu. Większość myszy C57BL/6 otrzymuje ocenę 4-5 za budowę gniazda, natomiast po uszkodzeniu hipokampa mediana ocen wynosi około 1-2; mało prawdopodobne jest przekroczenie oceny 3 (Rysunek 9). Wykazano również, że budowa gniazd jest wrażliwa na chorobę prionową w okolicach 10-12 tygodnia^1,2,16.

Rycina 9. Wyniki oceny budowy gniazd (mediany i rozstępy międzykwartylne) dla myszy kontrolnych oraz myszy z uszkodzeniami grzbietowej, brzusznej i całkowitej części hipokampa. Tylko u myszy z całkowitym uszkodzeniem obserwuje się zahamowanie budowy gniazd, co sugeruje, że efekty selektywnych uszkodzeń obszarów grzbietowych i brzusznych są poniżej progu, lecz mają charakter addytywny.

5. Gromadzenie zapasów

1. Aparatura

Seria „baz domowych” jest połączona z rurkami wykonanymi z drucianej siatki, które są trwale zamknięte na końcu dystalnym, gdzie umieszcza się pellety z pokarmem, oraz tymczasowo na końcu proksymalnym za pomocą drewnianego korka. Stosuje się to w celu zapobieżenia wchodzeniu myszy do rurek przed zakończeniem adaptacji do bazy domowej7.

Aparaturę (Rysunek 10) można wykonać na różne sposoby, pod warunkiem przestrzegania podstawowych zasad. Nasza składa się z rzędu 8 drewnianych skrzynek, każda o wymiarach 30 x 13 x 15 cm, z przezroczystymi pokrywami z pleksiglasu. Każda skrzynka jest wyposażona w butelkę z wodą i posiada otwór z tyłu, w który wciśnięta jest rurka do gromadzenia zapasów. Rurki są wykonane z czarnego plastiku, mają 10 cm długości i 40 mm średnicy, a są one połączone z rurką z siatki drucianej o długości 45 cm i średnicy 4 cm, co daje całkowitą długość 50 cm. Siatka składa się z oczek o wielkości 13 mm i jest podwójnie zwinięta z przesunięciem oczek, aby zmniejszyć otwory w siatce i zapobiec wypadaniu granulek pokarmu. Jeśli dostępna jest siatka o oczkach 6 mm, jest to lepszy materiał, gdyż wystarczyłaby jedna warstwa. Dalszy koniec rurki, w którym umieszcza się granulki pokarmu, jest zamknięty. Koniec bliższy jest uszczelniony zdejmowanym drewnianym korkiem.

Rycina 10. Myszy w rurkach do gromadzenia zapasów

2. Procedura

1. Zazwyczaj gromadzenie zapasów jest bardzo zmienne podczas pierwszej próby i niektóre myszy mogą w ogóle nie gromadzić pokarmu. Zdolność ta, podobnie jak kopanie nor, poprawia się wraz z praktyką. Dlatego, o ile pozwala na to plan eksperymentalny, sesje wyznaczania wartości bazowej najlepiej przeprowadzić przed podaniem preparatu. Oczywiście nie jest to praktyczne, gdy zmienna niezależna jest wrodzona, jak w przypadku (nieuwarunkowanej) myszy mutantowej lub podczas testowania różnych szczepów myszy.
2. Na początku dnia każdą mysz umieszcza się w oddzielnej klatce w celu habituacji. W klatce znajduje się tekturowy tunel, który przebywał w klatce zbiorowej grupy przez co najmniej jedną noc, a także obfita porcja zabrudzonej ściółki, aby mysz czuła się jak „w domu”. Dostęp do rury do gromadzenia zapasów jest zablokowany drewnianym korkiem aż do wieczora. 100 g peletu pokarmowego (mieszanka małych i dużych granulek) umieszcza się na dystalnym końcu rury (wsypując go drugim końcem przy pionowo trzymanej rurze). Aby upewnić się, że mysz jest lekko głodna przed rozpoczęciem testów, w klatce domowej nie zapewnia się pokarmu.
3. Tuż przed rozpoczęciem fazy ciemnej należy usunąć drewniany korek, aby umożliwić myszy dostęp do rury do gromadzenia zapasów. Następnego ranka (ponownie, dokładny czas nie jest krytyczny) należy zebrać i zważyć wszystkie granulki pokarmu, które zostały zgromadzone w klatce domowej.

6. Oczekiwane wyniki

W przypadku samic myszy C57BL/6 mediana gromadzonej ilości wynosiłaby około 50-70 g. Uszkodzenia hipokampa silnie hamują gromadzenie11, podczas gdy uszkodzenia kory przedczołowej mają jedynie słaby efekt¹² (Rycina 11).

Rycina 11. Masa granulek pokarmu zgromadzonych przez myszy z grupy kontrolnej oraz myszy z uszkodzeniem przyśrodkowej kory przedczołowej (mediany i rozstępy międzykwartylne). Chociaż mediany znacznie się różnią, wysoka zmienność w grupie kontrolnej sprawia, że wynik jest daleki od istotności statystycznej (P = 0.3).

Dyskusja

Testy te są niezwykle proste w wykonaniu, a uzyskane wielkości efektu są bardzo duże, co sprawia, że są one wyjątkowo czułe na zastosowane terapie, różnice między szczepami i inne czynniki. Są one zgodne z aspektem „Udoskonalenia” (Refinement) zasady 3R zaproponowanej przez Russella i Burcha¹⁸. W rzeczywistości dobre wyniki w testach takich jak kopanie nor wydają się być wskaźnikiem ogólnego stanu zdrowia zwierząt. W związku z tym może to być wartościowy test do oceny dobrostanu zwierząt.

Znaczenie wzbogacenia środowiskowego dla gryzoni laboratoryjnych jest obecnie powszechnie uznawane. Zapewnienie materiału do budowy gniazd jest obecnie standardową praktyką w wielu pomieszczeniach dla zwierząt i jest to łatwe do zrealizowania. Entuzjazm, z jakim myszy kopią tunele, sprawia, że możliwość kopania jest potencjalnie doskonałą formą wzbogacenia, jednak niestety nie opracowano jeszcze „samoodnawialnego” podłoża do kopania, które stanowiłoby praktyczny sposób realizacji tej potrzeby. Nie ustalono jeszcze, czy myszy uznają gromadzenie zapasów za formę wzbogacenia środowiskowego.

Jedną z wad jest to, że dane generowane przez te testy są zazwyczaj nieparametryczne (nie mają rozkładu Gaussa), dlatego do ich analizy wymagane są odpowiednie statystyki nieparametryczne, np. test U Manna-Whitneya dla porównań parzystych lub ANOVA Kruskala-Wallisa dla danych z wielu grup. W przypadku zastosowania planów z powtarzanymi pomiarami, ze względu na brak odpowiedniego testu ANOVA dla danych nieparametrycznych, wyniki można przekształcić, np. za pomocą procedur pierwiastkowania lub logarytmowania, aby dopasować je do rozkładu bardziej zbliżonego do normalnego.

Wymiary aparatury mogą nieco różnić się od tych określonych w tekście (co jest przydatne dla eksperymentatorów z USA), jednak należy unikać znacznych rozbieżności. Niemniej jednak w niektórych przypadkach inni badacze mogą uznać, że konstrukcje odmienne od opisanych tutaj sprawdzają się lepiej.

Podobnie jak w przypadku wszystkich pomiarów behawioralnych, należy zbadać myszy, aby sprawdzić, czy ich poziomy aktywności są prawidłowe, ponieważ brak aktywności będzie miał oczywisty niekorzystny wpływ na zachowania typowe dla gatunku. W przypadku myszy zainfekowanych scrapie, u których stwierdzono upośledzenie kopania nor i budowania gniazd, poziomy aktywności były prawidłowe (badane w aparacie open field). Co więcej, okres hiperaktywności występuje około 2-4 tygodnie po tym, jak te typowe dla gatunku zachowania zostaną po raz pierwszy upośledzone².

Silne upośledzenie kopania nor, budowania gniazd i gromadzenia zapasów – które są wszystkimi zachowaniami typowymi dla tego gatunku – wywołane przez uszkodzenia hipokampa, uzupełnia deficyty w uczeniu się przestrzennym i pamięci9, będące dobrze udokumentowanymi efektami tych uszkodzeń. Wydają się one być równoważne upośledzeniu czynności życia codziennego, tak charakterystycznemu dla choroby Alzheimera¹⁴.

Te testy typowe dla gatunku mogą okazać się niezwykle użyteczne w badaniach przedklinicznych nad metodami leczenia choroby Alzheimera oraz innych chorób neurodegeneracyjnych¹⁴. W wielu schorzeniach mózgu u ludzi utrata lub ograniczenie zdolności do wykonywania normalnych, codziennych czynności jest tak samo istotne, jak inne cechy choroby, takie jak zaburzenia poznawcze. W szczególności utrata ta może wymuszać angażowanie opiekunów, co często wiąże się z dużym obciążeniem społeczno-ekonomicznym.