Pomiar siły myszy

Podsumowanie

Deficyty siły mięśniowej występują w wielu stanach klinicznych, takich jak choroba neuronu ruchowego. Opisane tutaj testy odwróconego sita oraz podnoszenia ciężarów mierzą siłę u myszy niemal wyłącznie, przy minimalnym wpływie czynników takich jak koordynacja.

Streszczenie

Kondziela⁷ opracował test odwróconego sita i opublikował go w 1964 roku. Jest to test siły mięśni z wykorzystaniem wszystkich czterech kończyn. Większość zdrowych myszy bez trudu osiąga maksymalny wynik w tym zadaniu; jest to szybki, ale mało czuły test przesiewowy, a test obciążeniowy opisany w niniejszym artykule zapewni dokładniejszy pomiar siły mięśniowej.

Dostępnych jest również na rynku kilka urządzeń opartych na tensometrach, które dostarczają bardziej stopniowanych danych niż test odwróconego sita, jednak ich koszt może sprawić, że będą one poza zasięgiem wielu laboratoriów, które nie specjalizują się w badaniach wytrzymałościowych. W związku z tym w 2000 roku autor opracował tanie i proste urządzenie. Składa się ono z serii ogniw łańcucha o zwiększającej się długości, przymocowanych do „kolektora futra” – kulki z drobnej drucianej siatki, sprzedawanej w celu zapobiegania osadzaniu się kamienia w obszarach z twardą wodą. Przypadkowa obserwacja wykazała, że myszy potrafią bardzo mocno chwytać te elementy, dzięki czemu okazały się one idealnym punktem uchwytu dla urządzenia do podnoszenia ciężarów. Powszechną wadą komercyjnych mierników siły jest to, że pręt lub inny element chwytny nie jest wystarczająco cienki, aby myszy mogły wywrzeć maksymalny uścisk. Co do zasady, im cieńszy drut lub pręt, tym lepiej mysz może chwytać go swoimi małymi pazurami.

Jest to czysty test siły, choć jak w przypadku każdego testu, czynniki motywacyjne mogą odgrywać pewną rolę. Stosowanie kolektorów wagowych wydaje się jednak minimalizować problemy z motywacją, ponieważ u większości zdrowych młodych myszy dorosłych motywacja wydaje się być bardzo wysoka.

Wprowadzenie

Dla osoby postronnej idea pomiaru siły u myszy może wydawać się absurdalna, a nawet być czymś w rodzaju oksymoronu. Nie bez powodu jednak myszy domowe/laboratoryjne nazwano Mus musculus. Posiadają one w rzeczywistości bardzo wysoki stosunek siły do masy ciała, większy niż szczury. Na przykład dorosłe myszy potrafią z łatwością utrzymać ciężar własnego ciała, używając nawet tylko przednich lub tylnych łap; bardzo niewiele dorosłych szczurów laboratoryjnych jest w stanie to zrobić.

Myszy odgrywają coraz większą rolę w badaniach biomedycznych. Mogą być one wykorzystywane do modelowania wielu ludzkich zaburzeń motorycznych, zarówno tych o pochodzeniu somatycznym, jak i ośrodkowym. Do pierwszej grupy należy ponad trzydzieści postaci dziedzicznej dystrofii mięśniowej¹ oraz miastenia gravis, natomiast przykładami drugiej grupy są stwardnienie rozsiane, rdzeniowy zanik mięśni, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona oraz stwardnienie zanikowe boczne. W przypadku wszystkich tych modeli pełna ocena deficytów motorycznych musi obejmować specyficzne testy siły.

Protokół

1. Aparatura

1.1 Odwrócony test sitowy Kondzieli

Odwrócone sito stanowi kwadrat z siatki drucianej o boku 43 cm, składający się z oczek o rozmiarze 12 mm wykonanych z drutu o średnicy 1 mm (Rycina 1). Jest ono otoczone drewnianą listwą o głębokości 4 cm (która zapobiega wspinaniu się na drugą stronę myszom, które sporadycznie podejmują takie próby) (Rycina 2).

1.2 Test obciążników

Aparatura składa się z siedmiu ciężarków. Każdy z nich tworzy kula z zaplątanego cienkiego drutu ze stali nierdzewnej, będąca „zbieraczem kamienia” stosowanym w celu zapobiegania osadzaniu się kamienia wapiennego w domowych czajnikach. Masa takiego zbieracza jest niewielka (7 g), jednak każdy z nich jest przymocowany do serii ogniw stalowego łańcucha, z których każde waży około 13 g. Liczba ogniw waha się od jednego do siedmiu. Ich masy wynoszą zatem: 20, 33, 46, 59, 72, 85 i 98 g (ryciny 3 i 4).

2. Procedura

We wszystkich testach należy przenieść myszy do pomieszczenia doświadczalnego na 5-20 min przed rozpoczęciem badania, aby upewnić się, że są one w pełni rozbudzone. Co do zasady, aby umożliwić regenerację siły mięśniowej i powrót do normalnego poziomu pobudzenia, po każdym teście motorycznym należy poddać myszy odpoczynkowi poprzez powrót do klatki domowej.

1. Test odwróconego sita Kondzieli
2. Procedura: Umieść mysz w centrum drucianego sita, uruchom stoper, obróć sito do pozycji odwróconej w ciągu 2 sec, tak aby głowa myszy była skierowana w dół. Utrzymuj sito nieruchomo na wysokości 40-50 cm nad wyściełaną powierzchnią. Zanotuj czas, w którym mysz spadnie, lub zdejmij ją, gdy upłynie kryterialny czas 60 sec. W niektórych eksperymentach przydatne mogą być dłuższe czasy kryterialne.
3. Punktacja w teście odwróconego sita:

Upadek w czasie 1-10 s = 1
Upadek w czasie 11-25 s = 2
Upadek w czasie 26-60 s = 3
Upadek po 60 s = 4

Lub, np. dla 2 min:
Upadek między 1-10 sec = 1
Upadek między 11-25 sec = 2
Upadek między 26-60 sec = 3
Upadek między 61-90 sec = 4
Upadek po 90 sec = 5

3. Test obciążeniowy

Utrzymaj mysz za środek lub nasadę ogona i opuść ją, aby mogła chwycić pierwsze obciążenie (20 g) leżące na blacie laboratoryjnym. W momencie, gdy mysz chwyci przednimi łapami drucianą skalę kolektora, uruchom stoper i podnieś mysz tak, aby ogniwo oderwało się od blatu. Kryterium jest utrzymanie obciążenia przez 3 s. Jeśli mysz upuści ciężarek w czasie krótszym niż 3 s, zanotuj czas jego utrzymania. Pozwól myszy odpocząć przez około 10 s, a następnie powtórz próbę z tym samym obciążeniem. Jeśli mysz zawiedzie trzykrotnie, próba zostaje zakończona, a myszy przypisuje się maksymalny osiągnięty czas/obciążenie. Jeśli utrzyma ciężarek przez 3 s, sprawdź jej możliwości z następnym, cięższym obciążeniem. Jeśli podniesie je na 3 s, sprawdź następne, jeszcze cięższe obciążenie, po wcześniejszym przetestowaniu wszystkich współlokatorów z klatki z pierwszym ciężarkiem. Ponownie, mysz otrzymuje trzy szanse na utrzymanie obciążenia przez 3 s. Końcowy wynik całkowity oblicza się jako iloczyn liczby ogniw w najcięższym łańcuchu utrzymanym przez pełne 3 s, pomnożony przez czas (sec) jego utrzymania. Jeśli najcięższe obciążenie zostanie upuszczone przed upływem 3 s, oblicza się odpowiednią wartość pośrednią. Zatem mysz utrzymująca obciążenie 5 ogniw przez 3 s, ale niezdolna do podniesienia obciążenia 6 ogniw, otrzymuje wynik (5 x 3) = 15. Jeśli utrzyma obciążenie 6 ogniw przez 1 s, otrzymuje wynik (5 x 3) + (1) = 16.

Czasami myszy mogą nie być wystarczająco zmotywowane do chwycenia aparatury. Dzieje się tak zazwyczaj u starszych zwierząt. Problem ten można zminimalizować, trzymając myszy za ogon przez dłuższy czas przed przybliżeniem ich na odległość umożliwiającą chwycenie drucianej kuli.

Wyniki

Oczekiwane wyniki

Contet et al.² wykazali, że myszy 129S2/sv uzyskały w teście obciążeń wyniki podobne do myszy C57BL/6. Samice myszy C57BL/6 uzyskały wynik około 15, a myszy 129 wynik 17, co oznacza, że były w stanie podnieść około 5 ogniw łańcucha, czyli około 70 g. Jest to wartość wysoka; zazwyczaj myszy C57BL/6 podnoszą 2-3 ogniwa łańcucha (wynik 6-9, 33-46 g)⁵. Różnice te wynikają prawdopodobnie z czynników takich jak stopień oswojenia myszy oraz szczegóły techniki zastosowanej przez eksperymentatora.

Zmiany w hipokampie nie wpłynęły na siłę mierzoną za pomocą testu z obciążeniem lub testu odwróconego sita⁴. Myszy z chorobą prionową (scrapie) wykazywały upośledzenie w teście odwróconego sita w 18. tygodniu po zakażeniu⁶. Mimo pewnego upośledzenia w testach na poprzeczce poziomej i rotarodzie w stosunku do myszy C57BL/6, myszy C57BL/10 nie wykazywały upośledzenia w teście podnoszenia ciężarów⁵. Myszy z nokautem podjednostki kanału KATP Kir6.2 nie były upośledzone w testach odwróconego sita ani podnoszenia ciężarów, choć samice uzyskały w tym ostatnim wyższe wyniki niż samce³. Było to nietypowe, ponieważ zazwyczaj cięższe samce wykazują większą siłę niż samice.

Rysunek 1. Odwrócony ekran.

Rysunek 2. Zbliżenie myszy na odwróconym ekranie.

Rycina 3. Obciążniki o masach od 20 g do 98 g.

Rycina 4. Podnoszenie ciężarów przez mysz.

Dyskusja

Nieustannie opracowywane są modele mysie dla wielu chorób dotykających ludzki układ ruchowy, dlatego niezbędne są rzetelne testy siły u myszy. Przykłady obejmują liczne postaci dystrofii mięśniowej, chorobę Parkinsona oraz chorobę Huntingtona. Testy siły znajdują zastosowanie również w modelach regeneracji nerwów po uszkodzeniach rdzenia kręgowego lub nerwów obwodowych. Wypadki przemysłowe i samochodowe wciąż powodują znaczną niepełnosprawność u ludzi, jednak obecnie wiele prac przedklinicznych bada możliwe kierunki leczenia oparte na czynnikach wzrostu nerwów.

Mięśnie nigdy nie pracują w izolacji. Są aktywowane przez mózg, lokalne lub wyższe odruchy rdzeniowe za pośrednictwem złączy nerwowo-mięśniowych i działają w ramach ograniczeń nakładanych przez inne mięśnie oraz układ szkieletowy. Zatem złożoność tego systemu sprawia, że testy siły mięśniowej in vivo u zwierząt w stanie czuwania są niezbędne do oceny ich obecnego stanu oraz efektów wszelkich potencjalnych terapii. Myszy instynktownie mocno chwytają przedmioty, przez co Mus musculus stanowi idealny model zwierzęcy do oceny zaburzeń siły mięśniowej oraz możliwych metod leczenia.